Escape Response Assay: En metode til at studere reaktionen fra Zebrafish Larva at røre Stimuli

Overview

Denne video beskriver touch-evoke respons assay, som måler reaktionen fra zebrafisk larven til at røre stimuli.

Protocol

1. Touch-fremkaldte Response Assay

1. Forberedelse af 2 dpf embryoner til touch-fremkaldt respons assay
   1. Sørg for, at det tidspunkt på dagen, hvor testen udføres, er konsistent mellem eksperimenter, fordi aktiviteten kan variere dramatisk i løbet af dagen.
      BEMÆRK:Forsøget skal udføres blændet og rækkefølgen af test randomiseret for at minimere eksperimentelle artefakter.
   2. Tildel fiskestammerne et tal, som er ukendt for den person, der udfører forsøget. Efter dette genererer brug af frit tilgængelige onlineværktøjer en tilfældig liste, der dikterer rækkefølgen af test.
   3. Mindst en time før test, dechorionate embryoner ved at rippe et hul i chorion og forsigtigt trække chorion fra hinanden ved hjælp af et par fine pincet. Fjern snavs fra petriskålen, før du vender tilbage til inkubatoren på 28 °C.
2. Udfører Touch-fremkaldte Response Assay
   1. Varmestadiet til 28 °C mindst 15 minutter før testen påbegyndes.
      BEMÆRK: Dette trin er temperaturreguleret og forbliver på 28 °C under prøvningen. Temperaturen vil påvirke aktiviteten, og det er derfor vigtigt at opretholde en konstant temperatur. Hvis der ikke er en opvarmet fase til rådighed, skal vandets temperatur overvåges, og alle forsøg skal udføres ved samme temperatur.
   2. Placer en petriskål fyldt med fostermedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl_2,0,33 mM MgSO₄ i vand) på en oplyst scene og monter højhastighedskameraet over petriskålen.
   3. Start videokameraoptagelsessoftwaren (f.eks. Stream Pix 5, beskrevet her) og vælg 1.000 billeder pr. sek. (1.000 fps) under fanen "arbejdsområde" som fangsthastighed for at sikre, at fiskens hurtige svømningshandling registreres.
   4. Når du arbejder med et foster ad gangen, skal du placere embryoet midt i petriskålen med zebrafisken tydeligt synlig i synsfeltet.
      BEMÆRK:Hvis embryoet svømmer væk, inden forsøget påbegyndes, erstattes det med et andet, da generoturering og placering af embryoet kan resultere i, at det bliver desensibiliseret til stimulus, og gentagne udbrudsresponser kan fremme muskelsvaghed i nogle sygdomsmodeller.
   5. Begynd at optage ved at klikke på "record"-knappen, og levere den mekanosensoriske stimulus til embryoet ved at røre ved det forsigtigt med en stump nål på toppen af hovedet.
   6. Stop optagelsen, når embryoet er svømmet ud af synsfeltet eller vendt tilbage til hvile.
      BEMÆRK:Accelerationen topper inden for de første 0,2 sek. Sørg derfor for, at fisken i det mindste i løbet af de første 0,2 sek. Ved hjælp af softwaren Stream Pix 5 gemmes dataene automatisk som en .avi videofil. Alternativ videooptagelsessoftware som Free Video Capture eller Softonic, som begge er frit tilgængelige til download, kan også bruges.
   7. Returner embryoet til en ny petriskål og vælg et andet foster til test. Udfør test på mindst 15 fisk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2