エスケープ応答アッセイ:ゼブラフィッシュ幼虫のタッチ刺激への反応を研究する方法

Overview

このビデオでは、ゼブラフィッシュの幼虫が刺激に触れる反応を測定するタッチ呼び起こす応答アッセイについて説明します。

Protocol

1. タッチ誘発応答アッセイ

1. タッチ誘発応答アッセイ用2 dpf胚の調製
   1. 一日を通して活動が劇的に変化する可能性があるため、テストが実施される時刻が実験間で一貫していることを確認します。
      メモ: 実験は、実験アーティファクトを最小限に抑えるために、ブラインドを実行し、テストの順序をランダム化する必要があります。
   2. 魚の株に数を割り当てますが、これは実験を行う個人には不明です。これに続いて、自由に利用可能なオンラインツールを使用すると、テストの順序を指示するランダムなリストが生成されます。
   3. 試験の少なくとも1時間前に、絨毛膜に穴を開け、細かいピンセットを使用してコリオンをそっと引き離すことによって胚をデコリオネートする。28°Cインキュベーターに戻る前に、シャーレから破片を取り除きます。
2. タッチ呼び起こされる応答アッセイの実行
   1. 試験開始前に28°Cに加熱する。
      メモ:この段階は温度制御されており、試験期間中は28°Cのままです。温度は活性に影響を与えるので、一定の温度を維持することが重要です。加熱された段階が利用できない場合は、水の温度を監視し、すべての実験を同じ温度で行う必要があります。
   2. 胚培地(5 mM NaCl、0.17mM KCl、0.33 mM CaCl 2、0.33 mM MgSO₄₎を照らされたステージに入れ、シャーレの上に高速カメラを取り付けます。
   3. ビデオカメラ録画ソフトウェア(Stream Pix 5、ここで説明)を起動し、「ワークスペース」タブの下で、魚の高速泳ぐアクションが記録されていることを確認するために、キャプチャ速度として1,000フレーム/秒(1,000 fps)を選択します。
   4. 一度に1つの胚を扱って、ゼブラフィッシュが視野にはっきりと見えるシャーレの真ん中に胚を置きます。
      注: 実験開始前に胚が泳ぎ去ると、胚の取り戻しと位置決めが刺激に対する脱感作になり、破裂反応が繰り返される可能性があるため、一部の疾患モデルでは筋力低下を促進する可能性があるため、実験開始前に胚が泳ぎ去った場合。
   5. 録音を開始するには、「録音」ボタンをクリックし、頭の上に鈍い針で優しく触れることで、胚にメカノ感覚刺激を提供します。
   6. 胚が視界から抜け出したか、休息に戻った後、記録を停止します。
      メモ: 加速は、機械的刺激に続くバーストエスケープ応答の最初の0.2秒以内にピークを迎えます。したがって、魚を記録するエスケープ応答の少なくとも0.2秒の間に、視野にあることを確認してください。ソフトウェアStream Pix 5を使用すると、データは自動的に.aviビデオファイルとして保存されます。無料のビデオキャプチャやソフトニックなどの代替ビデオキャプチャソフトウェアも使用でき、どちらも無料でダウンロードできます。
   7. 胚を新しいシャーレに戻し、テストのために別の胚を選択します。最低15匹の魚に対してテストを行います。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2