Escape Response Assay: Eine Methode, um die Reaktion von Zebrafisch Larve auf Berührung Stimuli zu studieren

Overview

Dieses Video beschreibt den Touch-evoke Response Assay, der die Reaktion der Zebrafischlarve misst, um Reize zu berühren.

Protocol

1. Touch-evozierte Antwort Assay

1. Vorbereitung von 2 dpf Embryos für Touch-evozierte Response Assay
   1. Stellen Sie sicher, dass die Tageszeit, zu der der Test durchgeführt wird, zwischen den Experimenten konsistent ist, da die Aktivität im Laufe des Tages stark variieren kann.
      ANMERKUNG: Das Experiment sollte geblendet durchgeführt und die Reihenfolge der Tests randomisiert durchgeführt werden, um experimentelle Artefakte zu minimieren.
   2. Weisen Sie den Fischstämmen eine Zahl zu, die dem Einzelnen, der das Experiment durchführt, unbekannt ist. Anschließend generieren die frei verfügbaren Online-Tools eine zufällige Liste, die die Reihenfolge der Tests vorschreibt.
   3. Mindestens eine Stunde vor dem Test, dechorionate Embryonen durch Reißen eines Lochs in der Chorion und sanft ziehen die Chorion auseinander mit einem Paar feine Pinzette. Entfernen Sie schmutzer Teile aus der Petrischale, bevor Sie zum 28 °C-Inkubator zurückkehren.
2. Durchführen von Touch-evozierten Antwort-Assay
   1. Hitzestufe auf 28 °C mindestens 15 min vor Beginn der Prüfung.
      HINWEIS: Diese Stufe ist temperaturgeregelt und bleibt für die Dauer der Prüfung bei 28 °C. Die Temperatur wird die Aktivität beeinflussen und es ist daher wichtig, eine konstante Temperatur zu halten. Wenn eine beheizte Stufe nicht verfügbar ist, sollte die Temperatur des Wassers überwacht werden und alle Experimente sollten bei der gleichen Temperatur durchgeführt werden.
   2. Eine mit Embryomedium gefüllte Petrischale (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ in Wasser) auf eine beleuchtete Bühne stellen und die Hochgeschwindigkeitskamera über die Petrischale montieren.
   3. Starten Sie die Videokamera-Aufnahmesoftware (z. B. Stream Pix 5, wie hier beschrieben) und wählen Sie unter der Registerkarte "Arbeitsbereich" 1.000 Frame pro Sekunde (1.000 fps) als Aufnahmegeschwindigkeit aus, um sicherzustellen, dass die schnelle Schwimmwirkung der Fische aufgezeichnet wird.
   4. Wenn Sie mit einem Embryo nach dem anderen arbeiten, stellen Sie den Embryo in die Mitte der Petrischale, wobei der Zebrafisch im Sichtfeld deutlich sichtbar ist.
      ANMERKUNG: Wenn der Embryo vor Beginn des Experiments wegschwimmt, ersetzt er ihn durch einen anderen, da die Rückeroberung und Positionierung des Embryos dazu führen kann, dass er dem Reiz desensizipiert wird und wiederholte Burstreaktionen die Muskelschwäche in einigen Krankheitsmodellen fördern können.
   5. Beginnen Sie mit der Aufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche "Aufzeichnen" klicken und den mechanosensorischen Reiz an den Embryo liefern, indem Sie ihn sanft mit einer stumpfen Nadel auf der Oberseite des Kopfes berühren.
   6. Beenden Sie die Aufzeichnung, nachdem der Embryo aus dem Sichtfeld geschwommen oder zur Ruhe zurückgekehrt ist.
      ANMERKUNG: Die Beschleunigungsspitzen innerhalb der ersten 0,2 Sek. der Burst-Escape-Reaktion nach dem mechanischen Stimulus. Stellen Sie daher sicher, dass sich der Fisch zumindest während der ersten 0,2 Sek. der Fluchtreaktion, die den Fisch aufzeichnet, im Sichtfeld befindet. Mit der Software Stream Pix 5 werden die Daten automatisch als .avi Videodatei gespeichert. Alternative Videoaufnahmesoftware wie Free Video Capture oder Softonic, die beide frei zum Download zur Verfügung stehen, könnte ebenfalls verwendet werden.
   7. Bringen Sie den Embryo in eine neue Petrischale zurück und wählen Sie einen anderen Embryo zum Testen aus. Führen Sie Tests an mindestens 15 Fischen durch.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2