Summary
مقدمة في البروتوكول ، والتكنولوجيا ، والتعامل مع السفن HYPERStack كورنينج والاكسسوارات المستخدمة لزراعة الخلايا عالية الغلة ملتصقة. فإن بروتوكول تظهر كيفية استخدام السفن نظام مغلق لحصاد الخلية الحالية على زيادة المنتجات المسطحة مكدسة.
Abstract
ثقافة كبيرة حجم الخلية ملتصقة حاليا موحدة على المنتجات المكدسة لوحة نمو الخلايا عندما الخرز microcarrier ليست الخيار الأمثل. سفن HYPERStack تسمح مغلقة جدول النظام حتى من المنتجات الحالية وتوفر لوحة مكدسة> 2.5X المزيد من الخلايا في نفس البصمة الحجمي. السفن HYPERStack ظيفة عبر الغاز نفاذية المواد التي يسمح تبادل الغاز لتحدث ، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى فراغ الرأس الداخلية داخل السفينة. القضاء على فراغ الرأس يسمح للمقصورة حيث تحدث لنمو الخلايا يمكن التقليل للحد من الفضاء ، والسماح لمزيد من طبقات من نمو الخلايا مساحة داخل نفس البصمة الحجمي.
للعديد من التطبيقات مثل العلاج بالخلايا أو إنتاج اللقاحات ، وهناك حاجة إلى نظام مغلق لنمو الخلايا والحصاد. السفينة HYPERStack يسمح الخلية والكاشف إضافة وإزالة الأنابيب عبر وسائل الاعلام من أكياس أو أساليب أخرى.
وهذا البروتوكول يفسر التكنولوجيا وراء المادة نفاذية الغاز المستخدمة في السفن HYPERStack ، نشر النتائج الغاز لتلبية احتياجات التمثيل الغذائي للخلايا ، أغلقت بروتوكولات نمو الخلية النظام ، وطرق الحصاد المختلفة.
Protocol
1. HYPERStack سفينة -- الغاز تكنولوجيا المواد نافذ الخلفية
- السفينة هي سفينة HYPERStack متعدد الطبقات لاستزراع نظام مغلق من الخلايا التي تعتمد على تبادل الغازات من خلال فيلم الغاز 76.2micron البوليمر لنفاذية الأيض الخلوية.
- السفينة HYPERStack يختلف من أكثر السفن التقليدية الثقافة الخلية لأنه لا يملك "فراغ الرأس" فوق الخلايا داخل السفينة. بدلا من أن تحتوي على هذا "فراغ الرأس" لتبادل الغازات داخل السفينة ، ومنتجات الغاز نفاذية الهواء والمسافات (ويشار إلى مسافات "القصبة الهوائية") تحت كل دائرة الثقافة التي هي مفتوحة في الغلاف الجوي.
- هذا الفضاء القصبة الهوائية تمكن الخلايا المتنامية في كل خلية ثقافة مقصورة السفينة قد يعادل تبادل الغازات.
- الفيلم نفاذية الغاز يسمح تبادل الغاز لتحدث مع الحفاظ على بيئة معقمة. جميع التلاعبات السائل لكل من طبقات متعددة تحدث عبر منفذ دخول واحد.
2. موجز السفينة المكون HYPERStack
- وStackette هي ثقافة خلية فردية المقصورة التي تتكون من لوحة الأعلى والغاز نفاذية الفيلم. يتم استزراع خلايا داخل هذه المقصورة.
- والمنوع السائل يربط كل طبقة من طبقات stackette 12 معا في إطار وحدة نمطية HYPERStack. ترتبط مع وحدات أنابيب لتشكيل السفن في المضاعفات من 12 طبقات. مشعب يسمح للمستخدم أن يجعل واحدة التلاعب السائل إلى الوعاء بأكمله.
- والمنوع الهواء أيضا يربط طبقات stackette معا ، ولكنها تستخدم لتحل محل الهواء من السفينة عندما تحدث إضافات السوائل. كان يحتوي على خط التعبئة لاستخدامها أثناء التعبئة.
- الفضاء القصبة الهوائية هي المساحة في الهواء الطلق بين كل طبقة stackette ، والسماح لتبادل الغازات من خلال الفيلم تحدث في كل طبقات الغاز "نفاذة.
- توصيل أنابيب معالجة السائل إلى سائل متعددة ، ويستخدم لجعل جميع السوائل نظام مغلق التلاعب. يمكن تخصيص هذا المكون.
- توصيل أنابيب التهوية في مشعب الهواء ، وتحتوي على فلتر الهواء ، ويستخدم لإطلاق الهواء الزائد مع الحفاظ على العقم.
- الأنبوب مطاردة لديه مرشح والمشبك وترتبط الأنبوب مناولة السائل وتستخدم لاجلاء السائل من أنابيب معالجة السائل بعد ملء الوعاء.
- ومناور المكدس كورنينج أو CSM هو جهاز للمساعدة في معالجة وضع السفن في المواضع الصحيحة أثناء الاستخدام.
- والوتد هو ملء الفولاذ المقاوم للصدأ المستخدمة مساعدة عند ملء الأوعية يدويا HYPERStack.
3. نتائج إنتشار الغاز من خلال الأفلام نافذ الغاز المستعملة في السفن HYPERStack
- في النظم التقليدية لنمو الخلايا مع فراغ الرأس تنفيس ، هو استنزاف الأوكسجين في وسائل الإعلام في المتوسط 50 ٪ على مدى 3 أيام في الثقافة. (الشكل 1)
- في نظام نمو الخلايا نفسها ، التدرج في الأوكسجين على ارتفاع 3mm من وسائل الإعلام هو ما يقرب من 50 ٪ زيادة في وسائل الإعلام على مفترق فراغ الرأس مما هو عليه في طبقة الخلايا. (الشكل 2)
- انتشار الأوكسجين من خلال الفيلم الغاز 76.2micron البوليسترين نفاذية تساوي 2.6mm نشرها من خلال وسائل الإعلام. الفيلم نفاذية الغاز المستخدمة في السفن HYPERStack يتيح تبادل الغاز لتحدث في طبقة الخلايا.
- في المئة من الأوكسجين في الفضاء القصبة الهوائية من السفن HYPERStack تبقى ثابتة كما تنمو الخلايا لالتقاء. (الشكل 3)
4. حقيبة إعداد وسائل الاعلام
- السفينة HYPERStack - 12 طبقة 1.3L يأخذ من وسائل الإعلام وHYPERStack - 36 سفينة طبقة 3.9L يأخذ من وسائل الإعلام.
- قبل وسائل الإعلام الخاص بتلقيح حصل ، إذا مصل لاستخدامه ، وأنبوب لحام الكيس كيس المصل إلى وسائل الإعلام ومزيج دقيق.
- المشبك قبالة حوالي 300 مل من وسائل الاعلام في الحقيبة باستخدام المشابك حقيبة كبيرة. وهذا ضمان استخدام كافة الخلايا تلقيح أثناء الملء وليس هي المتبقية في حقيبة الإعلام. مكان وسائل الإعلام على موقف كيس كيس.
5. تحصين وسائل الإعلام
- حقنة ملء مع أنابيب مرفقة مع التعليق الخلية. أنبوب لحام 3 / 16 "أنابيب من حقنة تحتوي على التعليق الخلية إلى حقيبة الإعلام.
- تعليق حقن الخلايا في حقيبة الاعلام ومزيج جيد.
6. ملء الداخلي
- أنبوب لحام الكيس وسائل الاعلام لتلقيح السفينة HYPERStack في 3 / 8 "أنابيب معالجة السائل (عن طريق توصيل العقيمة أو متعدد الأغراض يربط (البلدان المتوسطية الشريكة) ، يمكنك أيضا إرفاق الحقيبة وسائل الإعلام للسفينة).
- إغلاق المشابك على التعامل مع السائل والأنابيب مطاردة على HYPERStack.
- مكان السفينة HYPERStack 36 طبقة في CSM في موقف الحمل ؛ ربط أنبوب تنفيس فلتر في المشبك يحتجزونهم في CSM. إحكام الغطاء وتحريك CSM لملء المنصب. من خلال وضع السفينة إلى موضع التعبئة الصحيحة ، وتصفية الجو الآن في أعلى منصب لمنع التبول أثناء عملية التعبئة. في زاوية 10 درجة تصاريح equilibrالنسبة من السائل إلى طبقات أثناء التعبئة. السفينة طبقة HYPERStack - 12 وضعت على جانبها على ملء إسفين في الموضع الصحيح من أجل التعبئة.
- واضح الهواء من خط التعبئة عن طريق وضع كيس على نفس المستوى مثل سفينة HYPERStack (لا أكثر). حفظ المشبك أنبوب مطاردة مغلقة ؛ فتح أنبوب معالجة السائل المشبك والمشبك كيس السائل وسائل الإعلام للسماح لدخول السفينة.
- باستخدام كيس الوقوف ورفع كيس وسائل الإعلام للمساعدة في وقف تدفق خلية في الإناء.
- ملء الوعاء حتى كل وسائل الإعلام تلقيح يدخل السفينة ، و300 مل من وسائل الإعلام يجب أن لا تزال في الجزء العلوي من كيس وسائل الإعلام. إزالة المشبك من الكيس وسائل الاعلام لمواصلة سد السفينة. كسائل النهج المتعددة الهواء العلوي ، وإبطاء معدل ملء الكيس عن طريق خفض وسائل الإعلام من أجل منع أكثر من التعبئة. جلب ببطء مستوى السائل لملء خط أنابيب المشبك ومناولة السائل.
7. إجراءات العزل إلى قفل السائل الى طبقات
- اقتياد السفينة HYPERStack في CSM لموقف العزلة حتى كلتا المجموعتين من الفتحات الموجودة في أعلى منصب ، وانخفاض في كيس وسائل الاعلام دون ارتفاع السفينة. ويمكن رفع السفينة HYPERStack - 12 طبقة في موقف العزلة من خلال وضع اليد على جانب السفينة واستخدام أخرى لرفع إسفين التعبئة.
- مع تصفية مطاردة عقده في وضع مستقيم ، فتح انبوب المشبك مطاردة. وهذا فارغة أو مطاردة وسائل الإعلام في التعامل مع أنبوب السائل مرة أخرى إلى حقيبة الإعلام. مرة واحدة في أنابيب فارغة ، وأغلق على المشبك أنابيب حقيبة الإعلام.
- حفظ مرشح أنبوب مطاردة في وضع مستقيم ، افتح المشبك على التعامل مع أنبوب السائل على HYPERStack السماح لأي السائل المتبقي للدخول وتوازن في السفينة. الانتظار 1-2 دقائق لهذا أن يحدث.
- تحويل سفينة HYPERStack في CSM بحيث الفتحات الموجودة على اليسار. انخفاض السفينة إلى موضع الحمل على CSM. وسوف تعصف HYPEStack - 12 سفينة طبقة قليلا الى اليسار تصريح إزالة اسفين التعبئة. إغلاق المشابك على مطاردة كل وسائل معالجة الأنابيب.
- وربما تكون الآن في وسائل الاعلام يمكن إزالة كيس من السفينة أو قد تبقى تعلق لاستخدامها لاحقا في الإجراء الحصاد. كيس لتخزين وسائل الاعلام المرفقة ، ولفة كيس فارغ وبأية وسيلة المتبقية في حقيبة ، ومكان تحت العصابات الاحتفاظ في علبة تخزين السفينة HYPERStack.
- تحريك سفينة HYPERStack إلى الحاضنة. وينبغي عند القيام رعاية السفينة التي يجب اتخاذها لإبقاء السائل من دخول مرشح تنفيس الهواء. ويتم إنجاز ذلك من خلال التحول في نهاية متعددة من HYPERStack قليلا إلى أعلى.
8. حصاد البروتوكول
- للبدء في إجراء الحصاد ، وأنبوب لحام الحل تفارق الخلية وأكياس إخماد معا لتشكيل التجمع حقيبة الحصاد. تأكد من اغلاق جميع المشابك الأنابيب. (استخدام الرسوم المتحركة لشرح)
- إزالة HYPERStack السفينة من الحاضنة ، والإفراج عن الحقيبة وسائل الاعلام من تحت الاحتفاظ العصابات ، وشنق على الوقوف الحقيبة. مكان السفينة في CSM في موقف تحميل وإحكام غطاء لتأمين السفن. ربط أنابيب التهوية في المشبك القابضة ونقل CSM لملء المنصب.
- التأكد من أن حقيبة وسائل الإعلام على موقف حقيبة معلقة أقل من HYPERStack ؛ فتح المشبك على حقيبة الإعلام وأنابيب أنابيب السفينة مناولة السائل إلى السماح لوسائل الإعلام في التدفق إلى الحقيبة المرفقة.
- مرة واحدة في سفينة على وشك ¾ فارغة ، تغيير الإعدادات لوضع CSM فارغة النهائية. عندما السفينة HYPERStack وسائل التعامل مع أنابيب فارغة ، ورفع أنابيب لملاحقة وسائل الإعلام الماضية المشبك على أنابيب قضى حقيبة الإعلام ، ثم أغلق كل من أنابيب المشبك على التعامل مع السائل والمشبك أنابيب قضى على حقيبة الإعلام.
- استبدال حقيبة الإعلام أمضى مع الجمعية حقيبة حصاد بواسطة لحام الأنابيب وزيادة ارتفاع الخلية كيس التجميع تفارق فوق ذروة HYPERStack باستخدام الوقوف الحقيبة.
- وضع CSM في موازنة الموقف. فتح أنبوب تفارق حل الخلية المشبك ونقل الى حل HYPERStack. عند اكتمال عملية النقل ، على مقربة من المشابك على التعامل مع السائل والأنابيب الحل تفارق أنابيب الخلية.
- جلب CSM لموقف تحميلها. من خلال عقد ذراع فتح المواقع الأفقي ، الصخرة بلطف الجانب السفينة إلى جانب استخدام العجلة ، وتوزيع الحل عبر طبقات الخلية. أحيانا قد تكون السفينة عاد إلى موازنة الموقف خلال هزاز للحفاظ على المساواة في توزيع الحل. قد لا يكون واضحا أن بصريا المغلفة تماما طبقات ، ولكن لن يكون الحل تفارق موزعة بالتساوي على سطح الخلايا. مرة واحدة وقد تم توزيعها على نحو كاف الحل ، والإفراج عن ذراع على CSM لقفل HYPERStack في موقف تحميلها. مغادرة HYPERStack في هذا الموقفخلال الوقت اللازم لتفكك الخلايا الخاصة بك.
- بمجرد فصل الخلايا ، واستخدام التعكر كدليل ، نقل CSM إلى موازنة الموقف. وينبغي الحرص على عدم هضم أكثر من الخلايا. فتح الكيس المشبك يشفي ومناولة السائل HYPERStack المشبك أنابيب إلى السماح لوسائل الإعلام إرواء لدخول السفينة. إغلاق المشبك على التعامل مع HYPERStack أنابيب السائل بمجرد اكتمال عملية النقل.
- عودة الى الموقف CSM تحميل وعقد ذراع المواقع الأفقي لموسيقى الروك في الجانب السفينة إلى جنب.
- باستخدام كيس الوقوف ، وانخفاض موقف التجمع حقيبة الحصاد دون مستوى HYPERStack. ضبط CSM لموقف فارغة ، فتح أنبوب السائل مناولة سفينة المشبك ونقل مرة أخرى إلى حل الخلية كيس يشفي. عودة الى الموقف CSM تحميل وفصل الحصاد التجمع كيس من السفينة باستخدام انبوب السداده. الحل خلية جاهزة للمعالجة.
9. ممثل النتائج
- حصاد الوقت يحتاج إلى أن يكون الأمثل عند التحويل من سطح البوليسترين قياسية لسطح الغاز نفاذية البوليسترين. الخلايا تميل إلى إطلاق أسرع على المنتج HYPERStack.
- لعرض الخلايا تحت المجهر للتنفيس الأنابيب المناولة والسائلة يجب أن يكون فرضت قبالة. مكان السفينة HYPERStack رأسا على عقب ، مع الفتحات مشيرا إلى أسفل ، على المسرح المجهر.
- يمكن اتخاذ خطوات وقائية لتفادي ترطيب خلال استخدام المرشحات التي سوف تسبب لهم لوقف عملها. التي لم تنته بعد ملء السفينة HYPERStack والحفاظ على تنفيس الأنابيب ومطاردة مرتفعة عند المشابك مفتوحة ، لا ينبغي أن يحدث التبول.
- الضغط من المشابك أغلقت على الأنابيب لأسباب لا تزال مغلقة يتم فتحها بعد المشابك. ومعسر الأنبوب في الاتجاه المعاكس فتحه.
- وتستند وسائل الاعلام تدفق الوقت تدخل وتخرج من السفينة HYPERStack عبر تغذية خطورة على الفرق بين ارتفاع وسائل الاعلام على أعلى مستوى وسائل الإعلام في السفينة HYPERStack ومستوى أعلى من وسائل الإعلام في الحاوية وسائل الإعلام. على مسافة أكبر ، وأسرع في التدفق. يقتصر التدفق الأقصى قبل التصويت للمرشحات ل1.5L/min.
- والحفاظ على وحدة التخزين السليم في ملء السفينة HYPERStack منع الهواء تشكيل فقاعة في غرف نمو الخلايا. فقاعات الهواء يمكن أن تحدث بسبب أخذ العينات أو تفرخ في بيئة unhumidified بسبب فقدان المياه المتبخرة. فإن المبلغ أخذ العينات والتردد ، فضلا عن ظروف الحضانة تحديد ما إذا كان ينبغي أن يضاف السائل إضافية من قبل المستخدم النهائي.
الشكل 1. نضوب الأوكسجين من وسائل الإعلام في وعاء الثقافة الخلية القياسية. هذا الرقم يدل على انخفاض في ملغم / لتر من الأكسجين على مستوى الخلايا على مدى 3 أيام.
الشكل 2. التدرج الأوكسجين في وسائل الإعلام في وعاء الثقافة الخلية القياسية. هذا الرقم يدل على ملغم / لتر من الأوكسجين هو أعظم في وسائل الإعلام على تقاطع فراغ الرأس الموجود في طبقة من الخلايا.
الشكل 3 : النسبة المئوية للأكسجين في القصبة الهوائية لمسافة HYPERStack خلال نمو الخلايا. هذا الرقم يدل على مدى 96 ساعة ، والنسبة المئوية للأكسجين بين الطبقات ، والتي تمد كل أسفل الفيلم نفاذية الغاز ، لا تزال مستمرة. هذا يدل على قدرة الخلايا على النمو وصول الأكسجين أثناء لconfluency.
Discussion
HYPERStack السفينة قد نمت بنجاح هندسيا ، والخلايا الجذعية الأولية و. وقد أجريت الإضافات السائل في الإناء ، عبر اتصالات كيس العقيم بواسطة الجاذبية ، وكذلك تغذية عن طريق الضخ من وسائل الاعلام وعاء معقم. السفينة يوفر زيادة أكبر من النمو في منطقة 2.5X مقابل منتج لوحة مكدسة من البصمة الحجمي نفسه. وHYPERStack 6000 - 12 ومنطقة نمو الطول 2 ، HYPERStack 18000 - 36 ومنطقة نمو الطول 2 ، وHYPERStack 120 و60000 سم 2 من مساحة النمو. من خلال زيادة مساحة السطح ، مستخدمين قادرون على انتاج المزيد من خلايا من السكان نفس الخلية أو كثيرا ، والحد من التقلبات. كما أنها قادرة على انقاذ الفضاء و / أو العمل باستخدام عدد أقل من السفن لتحقيق انتاج الخلية نفسها ، أو زيادة انتاج الخلية دون إضافة الناس ، وأجنحة غرف الأبحاث ، أو الحاضنات. ويتم إنتاج النظام مع انخفاض طرق التجميع والجسيمات دون استخدام مواد لاصقة. بل هو نظام مغلق وهو مجمعة سلفا مع مجموعات الأنابيب والمرشحات ، وقدم الثلاثي حصل العقيمة.
Disclosures
تتناول الغاز سفينة HYPERStack نفاذية التكنولوجيا بموجب براءة الاختراع الأمريكية # : 7745209. الكتاب والعاملين في علوم الحياة كورنينج ، وشركة التي تنتج الأداة المستخدمة في هذه المقالة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر Lonza Walkersville على المساعدة التي قدموها لديهم معرفة نظام مغلق ، وتصميم الحقيبة ، والقروض من السدادات حقيبة واللحام ، فضلا عن خلق حقيبة الخطط HYPERStack.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 1350ml media + 150ml serum (if required) |
| 4.0L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 3600ml media + 400ml serum (if required) |
| HYPERStack Vessel-12 | Corning | 10012 | |
| HYPERStack Vessel-36 | Corning | 10036 | |
| Filling Wedge | Corning | 10040 | |
| Stack Manipulator | Corning | TBD | |
| HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device | Hyclone | SH3B0324.01 | |
| 600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM) | Lonza Inc. | TBD | |
| 600ml Cell Dissociation Solution | Lonza Inc. | TBD |
