Sistema de Protocolo fechado Cultura de Células utilizando navios com HYPERStack Gas Technology material permeável

Summary

Uma introdução à tecnologia de protocolo, e manuseio das embarcações Corning HYPERStack e acessórios utilizados para cultura de células de alto rendimento aderente. O protocolo irá mostrar como usar os vasos sistema fechado para a colheita de células a aumentar ao longo produtos empilhados placa atual.

Abstract

Grande volume de cultura de células aderentes está padronizado na placa empilhados produtos crescimento celular quando microcarregador contas não são uma escolha ideal. Vasos HYPERStack permitir escala sistema fechado a partir do atual placa de produtos empilhados e entrega> 2,5 vezes mais células na pegada volumétrica mesmo. Os vasos HYPERStack função através de material permeável ao gás que permite a troca de gás para ocorrer, portanto, eliminando a necessidade de headspace interna dentro de um vaso. A eliminação de headspace permite que o compartimento onde o crescimento celular ocorre a ser minimizada para reduzir o espaço, permitindo mais camadas de células área de superfície de crescimento dentro da pegada volumétrica mesmo.

Para muitas aplicações, tais como a terapia celular ou a produção de vacinas, um sistema fechado é necessária para o crescimento celular e colheita. O navio HYPERStack permite que celulares e reagente adição e remoção através de tubos de sacos de mídia ou de outros métodos.

Este protocolo irá explicar a tecnologia por trás do material permeável ao gás usado nos vasos HYPERStack, os resultados de difusão de gás para atender as necessidades metabólicas das células, sistema fechado de protocolos de crescimento celular, e vários métodos de colheita.

Protocol

1. HYPERStack navio - Gas fundo Tecnologia de materiais permeáveis

1. O navio é uma embarcação HYPERStack multicamadas para cultura de células sistema fechado que se baseia na troca de gás por meio de um gás permeável 76.2micron filme de polímero para o metabolismo celular.
2. O navio HYPERStack difere de mais navios de celular tradicional cultura em que ele não tem um "headspace" acima das células no interior do vaso. Ao invés de com este "headspace" para a troca de gás dentro do vaso, os produtos gás permeáveis ​​têm espaços aéreos (referido como "traquéia" espaços) abaixo de cada câmara de cultura que está aberto para a atmosfera.
3. Este espaço traqueal permite que as células crescendo em cultura de células de cada compartimento do navio para ter a troca gasosa equivalente.
4. O gás de película permeável permite a troca de gás para ocorrer durante a manutenção de um ambiente estéril. Todas as manipulações de fluidos para cada uma das múltiplas camadas ocorrer através de uma porta de entrada única.

2. HYPERStack Component Summary navio

1. O Stackette é o compartimento de cultura de células individuais, que é composto de placa superior e filme gás-permeáveis. As células são cultivadas dentro desse compartimento.
2. O Manifold líquido conecta cada uma das 12 camadas stackette juntos dentro de um módulo HYPERStack. Módulos são conectados com tubos para formar vasos em múltiplos de 12 camadas. O colector permite ao usuário fazer uma manipulação de fluido para o navio inteiro.
3. O Manifold Air também conecta as camadas stackette juntos, mas usado para deslocar o ar da embarcação quando adições fluido ocorrer. Ele contém uma linha de enchimento para uso durante o enchimento.
4. O Espaço traqueal é o espaço ao ar livre entre cada camada stackette, permitindo a troca de gás para ocorrer através do cinema cada camadas "de gás permeável.
5. A tubulação manipulação de líquidos é ligado ao colector de líquido e é usado para fazer todas as manipulações de fluidos sistema fechado. Este componente pode ser personalizado.
6. O tubo de ventilação está ligado ao colector de ar, contém um filtro de ar, e é usado para liberar o excesso de ar, mantendo a esterilidade.
7. A tubulação tem um filtro de perseguição e grampo e está conectado à tubulação de manipulação de líquidos e são usados ​​para evacuar o líquido da tubulação de manipulação de líquidos após o enchimento do reservatório.
8. O Manipulator Stack Corning ou CSM é um dispositivo de manuseio para auxiliar na colocação dos vasos na posição correta durante o uso.
9. O Wedge enchimento é um aço inoxidável ajudar usado quando manualmente preenchendo os vasos HYPERStack.

3. Resultados de gás difusão através Film gás permeável usado nos vasos HYPERStack

1. Em sistemas de células tradicionais de crescimento com headspace ventiladas, o oxigênio na mídia está esgotada uma média de 50% ao longo de 3 dias em cultura. (Figura 1)
2. No mesmo sistema de crescimento celular, o gradiente de oxigênio em uma altura 3mm de mídia é quase 50% maior na mídia para junção headspace do que é a camada de células. (Figura 2)
3. A difusão de oxigênio através da película de poliestireno 76.2micron gás permeável é igual à difusão através da mídia 2,6 milímetros. O filme gás-permeáveis ​​utilizado nos vasos HYPERStack permite a troca de gás para ocorrer na camada de células.
4. O% de oxigênio no espaço traqueal dos vasos HYPERStack permanece constante como as células crescem à confluência. (Figura 3)

4. Preparação de mídia Bag

1. O HYPERStack-12 navio camada leva 1.3L de media e os HYPERStack-36 navio camada leva 3.9L de media.
2. Antes de inocular seus meios ensacado, se o soro deve ser usado, tubo de solda a bolsa de soro para o saco da mídia e misture bem.
3. Grampo off aproximadamente 300 mL de mídia na bolsa usando braçadeiras grande saco. Isso irá garantir todas as células inoculadas são usadas durante o enchimento e nenhum é remanescente no saco de mídia. Coloque a mídia de saco em stand saco.

5. Mídia inoculação

1. Encha uma seringa com tubo ligado com suspensão de células. Tubo de solda 16/03 tubos "de uma seringa contendo suspensão de células para o saco de mídia.
2. Injetar a suspensão de células para a Bolsa de mídia e misture bem.

6. Preencha Procedimento

1. Tubo de soldar o inoculados saco de mídia para o navio HYPERStack de 3 / 8 "tubulação de manipulação de líquidos. (Usando estéril Multipurpose Liga ou liga (PPM), você também pode anexar o saco de mídia para o navio).
2. Fechar os grampos sobre o manuseio de líquidos e tubos de perseguição na HYPERStack.
3. Coloque o HYPERStack navio Camada 36 para o CSM na posição de carga; gancho do tubo de respiro do filtro no clamp segurando o CSM. Apertar a tampa e mover o CSM para a posição de enchimento. Ao colocar o navio na posição correta de preenchimento; o filtro de ar está agora em posição mais alta para evitar molhar durante a operação de preenchimento. O 10 ° de ângulo permite equilibrção do líquido para as camadas durante o enchimento. O navio camada HYPERStack-12 colocado de lado na cunha de enchimento é na posição correta para o preenchimento.
4. Ar limpo da linha de enchimento, posicionando o saco no mesmo nível que o navio HYPERStack (não superior). Mantendo a fixação de tubo perseguição fechado; abra o grampo do tubo de líquido manuseio e do grampo saco de mídia para permitir que o líquido para entrar no navio.
5. Usando o suporte de saco, levante o saco da mídia para ajudar o fluxo de suspensão celular dentro do vaso.
6. Encha o copo até que a todos os meios inoculados entra no navio, a 300 mL de mídia ainda deve permanecer na parte superior do saco de mídia. Retire o grampo do saco de mídia para continuar enchimento do reservatório. Como o líquido se aproxima do coletor de ar superior, retardar a taxa de preenchimento, reduzindo o saco da mídia, a fim de evitar o excesso de enchimento. Levar lentamente o nível de líquido para a linha de enchimento e prender o tubo de manipulação de líquidos.

7. Procedimento de isolamento para bloquear líquido nas camadas

1. Trazer o navio HYPERStack no CSM a posição de isolamento para os dois conjuntos de coletores estão em posição mais alta e mais baixa a bolsa de mídia abaixo da altura do vaso. O HYPERStack-12 navio camada pode ser levantado para a posição de isolamento, colocando uma mão no lado do navio e usar a outra para levantar a cunha de enchimento.
2. Com o filtro de perseguição realizada em uma posição ereta, abra o grampo do tubo perseguição. Isto vazio ou perseguição da mídia no tubo de manipulação de líquidos de volta para o saco de mídia. Uma vez que o tubo está vazio, fechar a braçadeira no tubo de bolsa de mídia.
3. Manter o filtro do tubo de perseguição em uma posição ereta, abra o grampo do tubo de manipulação de líquidos na HYPERStack para permitir que qualquer líquido restante para entrar e se equilibram no vaso. Espere 1-2 minutos para que isso ocorra.
4. Por sua vez o navio HYPERStack no CSM, para que os manifolds estão à esquerda. Inferior da embarcação para a posição carga no CSM. Balançando o HYPEStack-12 navio camada ligeiramente para a esquerda vai permitir a eliminação da cunha de enchimento. Fechar os grampos em ambos a perseguição e tubulação para manipulação de líquidos.
5. O saco de mídia pode agora ser removido do navio ou que podem permanecer presos para uso posterior no processo de colheita. Para armazenar o saco da mídia anexada, role o saco vazio e qualquer outra mídia restante no saco, e colocar sob as faixas de retenção na bandeja de armazenamento do navio HYPERStack.
6. Mover o navio HYPERStack para a incubadora. Quando transportar o cuidado navio devem ser tomadas para manter líquidos de entrar no filtro de ventilação de ar. Isso é realizado por depósito no final do coletor HYPERStack ligeiramente para cima.

8. Protocolo de colheita

1. Para iniciar o procedimento de colheita, tubo de solda a célula solução dissociação e sacos de saciar-se para formar a montagem saco de colheita. Garantir que todos os grampos de tubo estão fechados. (Use cartoon para demonstrar)
2. Remover navio HYPERStack da incubadora, solte o saco de mídia sob a bandas de retenção, e pendurar no stand saco. Coloque o recipiente no CSM com a carga e aperte a tampa para proteger o navio. Gancho da tubulação de ventilação para o grampo holding e mova o CSM para a posição de enchimento.
3. Certificando-se o saco de mídia no stand saco está pendurado inferior ao HYPERStack; abra o grampo no tubo saco de mídia e tubulação do navio para manipulação de líquidos para permitir o fluxo de mídia para dentro do saco em anexo.
4. Uma vez que o navio é de cerca de ¾ vazia, altere as configurações CSM para a posição final vazio. Quando o navio HYPERStack e tubulação para manipulação de líquidos estão vazios, levante a tubulação para perseguir os meios de comunicação além do grampo no tubo passou saco de mídia, em seguida, feche ambos prender o tubo na manipulação de líquidos ea braçadeira no tubo passou media saco.
5. Substituir o saco de gastos de mídia com a montagem saco de colheita por soldagem do tubo e aumentar a altura do conjunto de saco de dissociação de células acima da altura da HYPERStack usando o suporte de saco.
6. Coloque o CSM na posição de equilíbrio. Abra a célula de tubo solução dissociação grampo e transferir a solução para o HYPERStack. Quando a transferência estiver concluída, feche os grampos na tubulação de manipulação de líquidos ea célula tubulação solução dissociação.
7. CSM trazer para a posição de carga. Mantendo o posicionamento da alavanca horizontal aberta, agite levemente o lado navio para o lado usando a roda, distribuindo a solução sobre as camadas de células. O navio pode ocasionalmente ser devolvido para a posição de equilíbrio durante o balanço para manter a distribuição igual da solução. Pode não ser visualmente evidente que as camadas são completamente revestido, mas a solução dissociação serão distribuídos igualmente por toda a superfície das células. Uma vez que a solução tem sido adequadamente distribuídos, solte a alavanca do CSM para bloquear o HYPERStack na posição de carga. Deixe o HYPERStack nesta posiçãodurante o tempo necessário para a dissociação de suas células.
8. Uma vez que as células têm destacado, usando turbidez como um guia, mover o CSM para a posição de equilíbrio. Cuidados devem ser tomados para não mais de digerir as células. Abra o grampo saco saciar eo líquido HYPERStack abraçadeira de tubo para permitir a manipulação da mídia saciar a entrar no navio. Feche a braçadeira no tubo de manipulação de líquidos HYPERStack uma vez que a transferência estiver completa.
9. Devolver o CSM para a posição de carga e segure a alavanca de posicionamento horizontal para balançar o navio lado a lado.
10. Usando o suporte de saco, baixar a posição da assembléia saco safra abaixo do nível do HYPERStack. Ajustar o CSM para a posição vazia, abra o recipiente para manipulação de líquidos tubo braçadeira e transferir a solução de células de volta para o saco de matar. Devolver o CSM para a posição de carga e desconecte o conjunto da bolsa colheita do navio usando um aferidor tubo. A solução celular está pronto para processamento.

9. Resultados representante

• Tempo da colheita precisa ser otimizado ao converter de uma superfície padrão de poliestireno para a superfície de poliestireno gás-permeáveis. Células tendem a liberar mais rapidamente sobre o produto HYPERStack.
• Para visualizar as células sob um microscópio o tubo de ventilação e tratamento de líquidos precisa ser pinçada fora. Colocar o recipiente HYPERStack cabeça para baixo, com os manifolds apontando para baixo, no palco microscópio.
• Medidas de prevenção podem ser tomadas para evitar molhar os filtros durante o uso que fará com que eles parem de funcionar. Por não mais do enchimento do reservatório HYPERStack e manter a ventilação e os tubos de perseguição elevado quando os grampos estão abertas, não molhar deve ocorrer.
• A pressão dos grampos fechados no tubo faz com que ela permaneça fechada após os grampos são abertas. Beliscar o tubo na direção oposta irá abri-lo.
• Tempo de fluxo de mídia que entram e saem do navio HYPERStack via feed gravidade é baseado na diferença de altura de mídia entre o nível mais alto de mídia no vaso HYPERStack e no nível superior de mídia no recipiente de mídia. Quanto maior a distância, mais rápido o fluxo. A vazão máxima é limitada pela classificação dos filtros para 1.5L/min.
• Manutenção de volume de enchimento adequada no vaso HYPERStack irá prevenir a formação de bolhas de ar nas câmaras de crescimento celular. Bolhas de ar podem ocorrer devido à amostragem ou incubar em um ambiente unhumidified devido à evaporação da água. O valor de amostragem ea frequência, assim como condições de incubação vai determinar se o fluido deve ser adicionado pelo usuário final.

Figura 1. Depleção de oxigênio dos meios de comunicação em um recipiente padrão de cultura celular. A figura mostra a redução em mg / L de oxigênio ao nível das células ao longo de 3 dias.

Figura 2. Gradiente de oxigênio na mídia em um recipiente padrão de cultura celular. A figura mostra a mg / L de oxigênio é maior no cruzamento de mídia para headspace do que na camada de células.

Figura 3. Percentual de oxigênio no espaço traqueal do HYPERStack durante o crescimento celular. A figura mostra que mais de 96 horas, a porcentagem de oxigênio entre as camadas, que abastece de gás a cada fundo de película permeável, permanece constante. Isso demonstra a capacidade das células para o acesso de oxigênio durante o crescimento de confluência.

Discussion

HYPERStack navio tem crescido com sucesso engenharia, pilhas e tronco. Adições fluido no vaso foram realizados através de conexões asséptico saco de alimentação por gravidade e também pelo bombeamento de um recipiente estéril media. O navio oferece um aumento de 2,5 vezes maior do que em área de crescimento versus um produto chapa empilhados da mesma pegada volumétrica. O HYPERStack-12 tem 6.000 centímetros área de crescimento ^2, o HYPERStack-36 tem 18 mil centímetros área de crescimento ^2, eo HYPERStack-120 tem 60.000 cm ² de área de crescimento. Ao aumentar a área de superfície, os usuários são capazes de produzir mais células da população de células iguais ou muito e reduzir a variabilidade. Eles também são capazes de economizar espaço e / ou de trabalho, recorrendo menos navios para alcançar a saída mesma célula, ou aumentar a produção de células sem adicionar pessoas, suites sala limpa, ou incubadoras. O sistema é produzido com métodos de montagem de partículas de baixa e sem o uso de adesivos. É um sistema fechado, que é pré-montado com conjuntos de tubos e filtros, triple ensacado e fornecidos estéreis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	1350ml media + 150ml serum (if required)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml media + 400ml serum (if required)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	Lonza Inc.	TBD