Summary
Teknoloji, protokol ve yüksek verim yapışık hücre kültürü için kullanılan Corning HYPERStack gemiler ve aksesuarları işlenmesi halinde bir giriş. Protokol, mevcut yığılmış plaka ürünler üzerinde artan hücre hasat için kapalı sistem gemileri nasıl kullanılacağını gösterecektir.
Abstract
Büyük hacimli yapışık hücre kültürü microcarrier boncuk optimal bir tercih değildir yığılmış plaka hücre büyümesi ürünler üzerinde standardize edilmiştir. HYPERStack gemiler mevcut yığılmış plaka ürünleri kapalı sistem ölçekli kadar izin verir ve aynı hacimsel ayak izi> 2.5X daha fazla hücre sunar. Bu nedenle HYPERStack damarları gaz değişimi meydana sağlar gaz geçirgen malzeme ile fonksiyon, bir geminin içinde iç headspace ihtiyacını ortadan kaldırır. Headspace ortadan kaldırılması, hücre büyümesini en aza indirilecektir oluşur bölmesi aynı hacimsel ayak izi içinde hücre büyümesi yüzey alanı daha fazla katman izin azaltmak için, uzay sağlar.
Hücre tedavi veya aşı üretimi gibi birçok uygulama için, kapalı bir sistem, hücre büyümesi ve hasat için gereklidir. HYPERStack damar medya çanta veya diğer yöntemlerle tüp yoluyla hücre ve reaktif ekleme ve çıkarma sağlar.
Bu protokol HYPERStack kaplar, gaz difüzyon sonuçları hücreleri, kapalı sistem hücre büyümesi protokolleri ve çeşitli hasat yöntemleri metabolik ihtiyaçlarını karşılamak için kullanılan gaz geçirgen malzeme arkasındaki teknoloji açıklayacağız.
Protocol
1. HYPERStack Gemi - Gaz Geçirgen Malzeme Teknolojisi Arkaplan
- HYPERStack Gemi hücre metabolizması için bir 76.2micron gaz geçirgen polimer film ile gaz alışverişi dayanmaktadır hücreleri kapalı sistem kültür için çok katmanlı bir gemi.
- HYPERStack damar damar içindeki hücreler üzerinde bir "headspace" sahip olmadığını daha geleneksel hücre kültürü gemileri farklıdır. Damar içinde gaz değişimi için bu "headspace" yerine, gaz geçirgen ürünleri, atmosfere açık, her kültür odası altında hava boşluk ("trakea" alanları "olarak anılacaktır) var.
- Bu trakeal alan eşdeğer gaz değişimi, geminin her bir hücre kültürü bölmesi büyüyen hücreleri sağlar.
- Gaz geçirgen film, steril bir ortamda korurken gaz değişimi meydana sağlar. Çoklu katmanlardan her biri için tüm sıvı manipülasyonlar tek bir giriş portu aracılığıyla oluşur.
2. HYPERStack Gemi Bileşen Özet
- Stackette üst plaka ve gaz geçirgen film oluşan tek bir hücre kültürü bölmesi. Hücreleri bu bölmesi içinde kültür.
- Sıvı Manifold, 12 stackette katmanlarının her bir HYPERStack modül içinde birlikte bağlanır. Modüller, 12 katmanları katları gemilerin oluşturmak için boru ile bağlanır. Manifoldu kullanıcı bir sıvı manipülasyon yapmak için tüm gemi sağlar.
- Hava Manifold stackette katmanları bir araya bağlanır, ama sıvı eklemeler meydana geldiğinde, geminin hava yerinden. Bu dolgu sırasında kullanılmak üzere bir dolgu hattı içerir.
- Trakeal Uzay gaz değişimi her katmanları 'gaz geçirgen film yoluyla gerçekleşmesini sağlayan, her stackette katmanı arasında açık hava alanıdır.
- Sıvı taşıma boru sıvı manifolduna bağlı olan ve tüm kapalı sistem sıvı manipülasyonlar yapmak için kullanılır. Bu bileşen, özelleştirilebilir.
- Havalandırma hortumu, hava manifolduna bağlı bir hava filtresi içeren ve sterilite korurken aşırı hava serbest bırakmak için kullanılır.
- Kovalamak boru, filtre ve kelepçe ve sıvı taşıma boru bağlanır ve geminin doldurduktan sonra sıvı taşıma boru içindeki sıvıyı tahliye etmek için kullanılır.
- Corning Yığın Manipulator veya CSM gemilerin kullanım sırasında doğru pozisyonlara yerleştirerek yardımcı olmak için bir işleme cihazı.
- Dolum Kama, bir paslanmaz çelik, el ile HYPERStack damarları doldururken kullanılan yardımcı.
3. Gaz Geçirgen Film HYPERStack gemiler kullanılır sayesinde Gaz Difüzyon Sonuçlar
- Bacalı headspace geleneksel hücre büyümesi sistemleri, medya oksijen, kültür 3 gün içinde ortalama% 50 tükenmiş. (Şekil 1)
- Aynı hücre büyümesi sistemi, medya 3mm yüksekliğinde oksijen gradiyenti hücre katmanı daha headspace kavşak medya neredeyse% 50 daha fazla. (Şekil 2)
- 76.2micron gaz geçirgen polistiren film aracılığıyla oksijen difüzyon, medya 2.6mm aracılığıyla difüzyon eşit. HYPERStack damarlarda kullanılan gaz geçirgen film gaz alışverişi hücre tabakasının ortaya sağlar.
- Trakeal HYPERStack gemilerin uzayda oksijen% hücreleri izdiham büyüdükçe sabit kalır. (Şekil 3)
4. Medya Çanta Hazırlık
- HYPERStack-12 katman damar medya 1.3L HYPERStack-36 kat gemi alır ve medya 3.9L alır.
- Torbalı medya aşılamak için önce serum kullanılacak ise, tüp medya çanta serum çanta kaynak ve iyice karıştırın.
- Kelepçe medya yaklaşık 300 ml, büyük çanta kelepçeler kullanarak çanta. Bu inoküle edilen tüm hücrelerin hiçbiri medya torba içinde kalan ve dolum sırasında kullanılan sağlayacaktır. Yeri medya çanta çanta standında.
5. Aşılamak Medya
- Hücre süspansiyonu ile bağlı tüp ile bir şırınga doldurun. Tüp kaynak medya çanta hücre süspansiyonu içeren bir şırınga 3 / 16 "boru.
- Medya Çanta Hücre Süspansiyon içine enjekte edilir ve iyice karıştırın.
6. Prosedür doldurun
- Tüp HYPERStack geminin 3 / 8 "sıvı taşıma boru (bağlar Steril veya Çok Amaçlı (MPCs) bağlanır, aynı zamanda damar medya çanta ekleyebilirsiniz) inoküle medya çanta kaynak.
- HYPERStack sıvı taşıma ve kovalamaca tüpler kelepçeler kapatın.
- Kanca havalandırma filtresi tüp CSM tutan kelepçe, yük pozisyonda CSM HYPERStack 36 Katman Gemi yerleştirin. Kapağı sıkın ve CSM dolgu konumu taşımak. Gemi doğru dolgu pozisyon içine koyarak; hava filtresi dolgu işlemi sırasında ıslanma önlemek için en yüksek konumda şu anda. 10 ° açı izinleri equilibrdolum esnasında sıvı katmanları ation. Dolum kama yan yerleştirilen HYPERStack-12 tabaka damar doldurmak için doğru pozisyonda.
- Çanta HYPERStack gemi (yüksek olmayan) olarak aynı seviyede konumlandırarak doldurma çizgisine temizleyin hava. Kovalamaca tüp kelepçe kapalı tutulması; gemi girmek için sıvının sıvı taşıma tüp kelepçe ve medya çanta kelepçe açmak.
- Çanta standı kullanarak, kabına hücre süspansiyonu akışını yardımcı olmak için medya çanta yükseltmek.
- Gemi inoküle medyanın tüm gemi girinceye kadar doldurun; 300 ml medya hala medya çanta üst kısmında kalmalıdır. Gemi dolum devam etmek için medya çanta kelepçeyi çıkarın. Sıvı üst hava manifoldu yaklaşırken, dolgu üzerinde önlemek için medya çanta düşürerek dolgu hızını yavaşlatır. Yavaş yavaş sıvı seviyesi doldurma çizgisine getirmek ve sıvı taşıma boru kelepçe.
7. Into Katmanlar Sıvı Lock İzolasyon Prosedürü
- Manifoldu, her iki seti de en yüksek konumda böylece izolasyon konumuna CSM HYPERStack gemi getirin ve altındaki medya çanta geminin yüksekliği daha düşük. HYPERStack-12 katman gemi, geminin yan tarafında bir el koyarak ve diğer dolum kama asansör kullanarak izolasyon pozisyona kaldırılabilir.
- Dik bir pozisyonda yapılan kovalamaca filtresi ile kovalayan, tüp kelepçe açın. Bu medya torbaya geri sıvı tüp içinde ele medya boş ya da kovalamak olacak. Hortumun boş sonra medya çanta boru, kelepçe kapatın.
- Takip tüp filtre dik bir pozisyonda tutmak, kalan herhangi bir kap içinde sıvı girin ve denge sağlaması için izin HYPERStack sıvı taşıma boru kelepçe açmak. Bunun gerçekleşmesi için 1-2 dakika bekleyin.
- Manifoldlar soldaki böylece CSM HYPERStack gemi açın. CSM üzerindeki yükü konumuna geminin indirin. HYPEStack-12 kat gemi biraz sola Sallanır dolum kama kaldırılması izin verecektir. Kovalamak ve sıvı taşıma boru kelepçeleri kapatın.
- Şimdi medya çanta gemiden kaldırılır ya da daha sonra hasat yordamı kullanmak için bağlı kalır. Ekli medya çanta saklamak için HYPERStack geminin depolama tepsisi tespit bantları altında boş çanta ve torba içinde kalan herhangi bir medya, yer ve döndürün.
- Inkübatör HYPERStack geminin hareket ettirin. Gemi bakım taşırken havalandırma filtreye giren sıvı tutmak için önlemler alınmalıdır. Bu biraz yukarı HYPERStack manifoldu sonuna devrilme tarafından gerçekleştirilir.
8. Hasat Protokolü
- Hasat işlemi başlatmak için, tüp hasat çanta montaj oluşturmak üzere bir araya hücre disosiasyon çözüm ve quench çanta kaynak. Tüm boru kelepçeleri kapalı olduğundan emin olun. (Göstermek için karikatür)
- Inkübatör HYPERStack gemi çıkarın tespit bantları altında medya çanta bırakın ve çanta standı asmak. Geminin yük pozisyonda CSM geminin güvenli kapak yerleştirin ve sıkın. Holding kıskaç içine havalandırma boru Kanca CSM ve dolgu konumuna taşımak.
- Medya çanta boru ve medya ekli torba içine akmasını sağlamak için geminin sıvı taşıma boru kelepçe açık; medya çanta çanta standında HYPERStack daha asılı emin olun.
- Sonra gemi hakkında ¾ boş, son boş pozisyon CSM ayarlarını değiştirmek. HYPERStack gemi ve sıvı taşıma boru boş zaman, harcanan medya çanta boru kelepçe geçmişte medya kovalamak için boru kaldırın, sonra sıvı taşıma boru, kelepçe ve harcanan medya çanta boru kelepçe kapatın.
- Harcanan medya çanta boru kaynağı ile hasat çanta montaj ile değiştirin ve çanta standı kullanarak HYPERStack yüksekliği yukarıda hücre disosiasyon torba montaj yüksekliği yükseltmek.
- CSM dengeleme pozisyonda yerleştirin. Hücre disosiasyon çözüm tüp HYPERStack çözüm kelepçe ve transfer açın. Transfer tamamlandığında, sıvı taşıma boru ve hücre disosiasyon çözüm boru kelepçeleri kapatın.
- CSM yük konumuna getirin. Yatay konumlandırma kolu açık tutarak, yavaşça hücre katmanları üzerinden çözüm dağıtmak, geminin yan tarafına tekerleğini kullanarak kaya. Gemi zaman zaman çözümün eşit dağılımını sağlamak için sallanan sırasında dengeleme konumuna iade edilebilir. Katmanları tamamen kaplı olduğunu görsel olarak belirgin olmayabilir, ancak ayrışma çözümü hücrelerin yüzeye eşit dağılmış olacak. Çözüm yeterince dağıtılan edildikten sonra, yük konumu HYPERStack kilitlemek için CSM kolunu serbest bırakın. Bu pozisyonda HYPERStack bırakınhücreleri için gerekli disosiasyon süre içinde.
- Sonra hücreleri müstakil, bir kılavuz olarak bulanıklık kullanarak, dengeleme konumuna CSM taşımak. Bakım hücreler üzerinde sindirmek için alınmalıdır. Quench medya gemi girmesine izin quench çanta kelepçe ve HYPERStack sıvı taşıma boru kelepçe açın. HYPERStack sıvı taşıma boru kelepçe transferi tamamlandıktan sonra kapatın.
- CSM yük pozisyonuna dönün ve geminin yan tarafına rock yatay konumlandırma kolunu tutun.
- Çanta standı HYPERStack seviyesinin altında hasat torba montaj konumunu kullanarak, daha düşüktür. Damar sıvı taşıma tüpü söndürmeye torbaya geri hücre çözümü kelepçe ve transfer açık, boş pozisyon için CSM ayarlayın. CSM yük pozisyonuna dönün ve bir tüp macunu kullanarak geminin hasat çanta montaj bağlantısını. Hücre çözümü işlem için hazırdır.
9 - Temsilcisi Sonuçlar
- Hasat zamanı, standart bir polistiren yüzeyinden gaz geçirgen polistiren yüzeye dönüştürürken optimize edilmesi gerekiyor. Hücreler HYPERStack ürünü daha hızlı serbest eğilimindedir.
- Hücreleri mikroskop altında görmek için havalandırma ve sıvı taşıma boru bağlanarak gerekir. Manifoldlar mikroskop sahnede aşağı dönük HYPERStack geminin baş aşağı yerleştirin.
- Önleme adımları çalışmamasına neden olacak kullanım sırasında filtreler ıslatma önlemek için alınabilir. Değil HYPERStack gemi doldurma ve kelepçeler açık olduğunda, havalandırma ve kovalamaca tüp yüksekte tutmak içinde, hiçbir ıslatma meydana gelmelidir.
- Tüp kapalı kelepçeler basınç kelepçeler açıldıktan sonra kapalı kalmaya neden olur. Ters yönde boru pinching açacaktır.
- Medya akış süresi giren ve yerçekimi linki üzerinden HYPERStack gemi çıkmadan HYPERStack damar medyanın üst düzey ve üst düzey medya konteyner medya medya arasındaki yükseklik farkı dayanmaktadır. Daha fazla mesafe, daha hızlı akışını. Maksimum akış 1.5L/min filtreleri derece sınırlıdır.
- HYPERStack geminin uygun dolgu hacmi bakımı, hücre büyümesi odaları hava kabarcığı oluşumunu önlemek. Evaporatif su kaybı nedeniyle unhumidified ortamda alma ya da kuluçka için hava kabarcıkları nedeniyle oluşabilir. Son kullanıcı tarafından ek sıvı eklenmelidir inkübasyon koşullarının yanı sıra, örnekleme miktarı ve sıklığı belirleyecektir.
Şekil 1, standart hücre kültürü damar medya Oksijen tükenmesi . Bu rakam, 3 gün içinde hücreleri düzeyinde mg / L oksijen azalması gösterir.
Şekil 2, standart hücre kültürü gemisi medya Oksijen degrade . Bu rakam, Oksijen mg / L medya headspace kesiştiği hücre tabakasının daha büyük gösterir.
Şekil 3 HYPERStack hücre büyümesi sırasında trakeal boşluk Oksijen yüzdesi. Bu rakam, 96 saat boyunca, her bir gaz geçirgen film alt malzemeleri katmanları arasındaki oksijen yüzdesi, sabit kaldığını gösteriyor. Bu hücrelerin büyüme confluency sırasında oksijen erişim yeteneğini göstermektedir.
Discussion
HYPERStack damar başarılı bir şekilde büyüdü, birincil ve kök hücre mühendislik vardır. Agirlik yem ve steril bir ortam konteyner pompalama aseptik torbada bağlantıları aracılığıyla damar içine Akışkan eklemeler yapılmıştır. Geminin büyüme alanında daha fazla 2.5X artış vs aynı hacimsel ayak izi yığılmış plaka ürünü sağlar. HYPERStack-12 6.000 cm 2 büyüme alanı, HYPERStack-36 18.000 cm 2 büyüme alanı ve HYPERStack-120 60.000 cm 2 büyüme alanı vardır. Yüzey alanını arttırarak, kullanıcıların aynı hücrede nüfus veya çok daha fazla hücre üretmek ve değişkenliği azaltmak mümkün. Ayrıca, aynı hücre çıkışı elde, ya da insanların, temiz oda suit, veya inkübatör eklemeden hücre çıkış artırmak için daha az damarları kullanarak, uzay ve / veya işçilikten tasarruf edebiliyoruz. Sistem, düşük partikül montaj yöntemleri ve yapıştırıcı kullanılmadan üretilmektedir. Üçlü Torbalı ve steril sağlanan boru setleri ve filtreler ile önceden monte edilmiş kapalı bir sistem.
Disclosures
7745209: HYPERStack gemi gaz geçirgen teknoloji, ABD Patent # kapsamında. Yazarlar, bu yazıda kullanılan alet üreten Corning, Yaşam Bilimleri, Inc çalışanları.
Acknowledgments
Yazarlar Lonza Walkersville kapalı bir sistem bilgisi, çanta tasarımı, çanta Avcılar ve kaynakçılar kredi, çanta gibi HYPERStack şemadaki oluşturarak onların yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 1350ml media + 150ml serum (if required) |
| 4.0L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 3600ml media + 400ml serum (if required) |
| HYPERStack Vessel-12 | Corning | 10012 | |
| HYPERStack Vessel-36 | Corning | 10036 | |
| Filling Wedge | Corning | 10040 | |
| Stack Manipulator | Corning | TBD | |
| HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device | Hyclone | SH3B0324.01 | |
| 600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM) | Lonza Inc. | TBD | |
| 600ml Cell Dissociation Solution | Lonza Inc. | TBD |
