Closed System Cell Culture Protocol Mit HyperStack Schiffe mit gasdurchlässigen Material Technology

Summary

Eine Einführung in die Technologie, das Protokoll und die Handhabung der Corning HyperStack Schiffe und Zubehör für High-Yield-adhärente Zellkultur verwendet. Das Protokoll wird zeigen, wie man das geschlossene System Schiffe zur Erhöhung der Zellernte über aktuelle Plattenstapelzellen Produkte zu verwenden.

Abstract

Großvolumige adhärente Zellkultur wird derzeit standardisiert Plattenstapelzellen Zellwachstum Produkte, wenn Mikroträger Perlen sind nicht die optimale Wahl. HyperStack Schiffe ermöglichen geschlossenes System Scale-up aus dem aktuellen Plattenstapelzellen Produkte und liefert> das 2,5 fache mehr Zellen in der gleichen volumetrischen Fußabdruck. Die HyperStack Schiffe Funktion über gasdurchlässige Material, das den Gasaustausch stattfinden kann, daher entfällt die Notwendigkeit für die interne Kopfraum innerhalb eines Gefäßes. Die Beseitigung der Kopfraum ermöglicht das Fach, wo das Zellwachstum tritt minimiert werden, um Platz zu reduzieren, so dass mehrere Schichten des Zellwachstums Fläche innerhalb der gleichen volumetrischen Fußabdruck.

Für viele Anwendungen wie z. B. Zelltherapie oder zur Herstellung von Impfstoffen, ist ein geschlossenes System für das Zellwachstum und die Ernte benötigt. Die HyperStack Schiffes ermöglicht Zelle und Reagenz Hinzufügen und Entfernen über Schläuche aus Medien Säcken oder anderen Methoden.

Dieses Protokoll wird erklärt, die Technologie hinter dem Gas-durchlässigen Material in der HyperStack Schiffe, Gasdiffusion Ergebnisse verwendet, um die metabolischen Bedürfnisse von Zellen, geschlossenes System Zellwachstum Protokolle und verschiedene Ernteverfahren gerecht zu werden.

Protocol

1. HyperStack Schiff - gasdurchlässige Material Technology Hintergrund

1. Die HyperStack Schiff ist eine mehrschichtige Gefäß für geschlossenes System Kultivierung von Zellen, die auf den Gasaustausch setzt durch eine 76.2micron gasdurchlässige Polymerfilm für den Zellstoffwechsel.
2. Die HyperStack Schiff unterscheidet sich von traditionellen Zellkulturgefäße, dass es keinen "Headspace" über den Zellen im Inneren des Schiffes. Anstatt mit diesem "Headspace" für den Gasaustausch innerhalb des Gefäßes, die gasdurchlässige Produkte Lufträume (bezeichnet als "Luftröhre" Leerzeichen) unter jeder Kultur Kammer, die zur Atmosphäre offen ist.
3. Das tracheale Raum ermöglicht die wachsenden Zellen in jeder Zellkultur-Fach des Schiffes entspricht Gasaustausch haben.
4. Das Gas durchlässige Folie ermöglicht Gasaustausch stattfinden und gleichzeitig eine sterile Umgebung. Alle Flüssigkeit Manipulationen für jede der mehreren Schichten entstehen durch einen einzigen Eintrag Port.

2. HyperStack Schiff Component Summary

1. Die Stackette ist die individuelle Zellkultur-Fach, das sich aus der oberen Platte und Gas durchlässige Folie hergestellt wird. Die Zellen werden in diesem Kompartiment kultiviert.
2. Das Liquid Manifold verbindet jeder der 12 stackette Schichten zusammen innerhalb eines HyperStack Modul. Die Module sind mit Schläuchen verbunden Schiffe in Vielfachen von 12 Schichten bilden. Die vielfältigen erlaubt dem Benutzer, ein Fluid Manipulation auf das gesamte Schiff zu machen.
3. Der Luftverteiler verbindet auch die stackette Schichten zusammen, aber es verwendet, um Luft aus dem Behälter zu verdrängen, wenn die Flüssigkeit Ergänzungen auftreten. Es enthält eine Markierung für den Einsatz während der Befüllung.
4. Die Tracheal Raum ist die Freifläche zwischen den einzelnen stackette Schicht, so dass der Gasaustausch durch jede Schicht "Gas-durchlässige Folie auftreten.
5. Die Liquid-Handling-Schlauch wird die Flüssigkeit Verteiler verbunden und dient dazu, alle geschlossenen System Fluid-Manipulationen zu machen. Diese Komponente kann angepasst werden.
6. Die Vent-Schlauch wird an die Luft Verteiler verbunden, enthält einen Luftfilter, und wird verwendet, um überschüssige Luft freisetzt und gleichzeitig Aufrechterhaltung der Sterilität.
7. Die Jagd Schlauch hat einen Filter und klemmen und mit dem Liquid-Handling-Schlauch verbunden und werden verwendet, um die Flüssigkeit aus dem Liquid-Handling-Schlauch nach dem Befüllen des Behälters zu evakuieren.
8. Die Corning-Stack Manipulator oder CSM ist ein Handhabungsgerät bei der Platzierung der Schiffe in die richtigen Positionen während des Einsatzes zu unterstützen.
9. Die Füllung Wedge ist ein Edelstahl-Unterstützung verwendet werden, wenn manuellen Befüllen der HyperStack Schiffe.

3. Gas Diffusion Ergebnisse durch gasdurchlässige Film in der HyperStack eingesetzten Schiffe

1. In der traditionellen Zellwachstum Systeme mit innenbelüfteten Kopfraum wird der Sauerstoff in den Medien um durchschnittlich 50% über 3 Tage in Kultur erschöpft. (Abbildung 1)
2. In der gleichen Zelle Wachstum-System wird der Sauerstoff-Gradienten in einem nur 3mm Höhe von Medien fast 50% mehr an die Medien, Kopfraum Kreuzung, als es an der Zellschicht. (Abbildung 2)
3. Die Diffusion von Sauerstoff durch die 76.2micron gasdurchlässige Polystyrol Film ist gleich der Diffusion durch 2.6mm von Medien. Das Gas durchlässige Folie in der HyperStack Schiffe eingesetzt ermöglicht den Gasaustausch an der Zellschicht auftreten.
4. Die% des Sauerstoffs in der Luftröhre Raum des HyperStack Schiffe konstant bleibt, wie Zellen bis zur Konfluenz wachsen. (Abbildung 3)

4. Medien Bag Vorbereitung

1. Die HyperStack-12-Schicht Schiff nimmt 1.3L der Medien und der HyperStack-36-Schicht Schiff nimmt 3.9L von Medien.
2. Vor Beimpfung Ihrer eingesackt Medien, wenn Serum verwendet werden soll, schweißen Rohr das Serum Tasche, um die Medien Tasche und gründlich mischen.
3. Clamp off etwa 300 ml von Medien in der Tasche mit großen Sackklemmen. Dies wird sicherstellen, dass alle inokulierten Zellen während der Befüllung und keiner in den Medien Tasche verbleibenden verwendet werden. Legen Sie die Medien Tasche auf Tasche stehen.

5. Impfen Medien

1. Füllen Sie eine Spritze mit Schlauch mit Zellsuspension befestigt. Rohr schweißen 3 / 16 "Schlauch aus einer Spritze mit Zellsuspension zu den Medien Tasche.
2. Inject der Zellsuspension in die Media-Tasche und gut mischen.

6. Füllen Procedure

1. Rohr schweißen die beimpfte Medien Tasche, um die HyperStack Schiffes 3 / 8 "Liquid-Handling-Schlauch. (Mit sterilen Verbindet oder Multipurpose verbindet (MPL), können Sie auch legen die Medien Tasche, um das Schiff).
2. Schließen Sie die Klemmen auf der Liquid-Handling-und jagen Rohre auf der HyperStack.
3. Legen Sie die HyperStack 36 Layer-Schiff in das CSM in der Last Position; Haken der Entlüftungsfilter Schlauch in die Halteklammer auf der CSM. Ziehen Sie den Deckel ab und bewegen Sie den CSM, um die Füllung Position. Indem das Schiff in die richtige Position zu füllen, die Luft-Filter ist nun in die höchste Position, um die Benetzung während füllen Betrieb zu verhindern. Die 10 °-Winkel ermöglicht equilibrATION der Flüssigkeit, um die Schichten während der Befüllung. Die HyperStack-12-Schicht Schiff auf seiner Seite auf dem Füllkeil gelegt wird in die richtige Position für die Abfüllung.
4. Klare Luft von der Füllhöhe durch die Positionierung der Tasche auf dem gleichen Niveau wie die HyperStack Gefäß (nicht höher). Keeping the chase Schlauchklemme geschlossen; öffnen Sie das Liquid-Handling-Schlauchklemme und Medien Tasche Klemme an Flüssigkeit ermöglichen, das Schiff betreten.
5. Mit der Tasche stehen, erhöhen die Medien Tasche, um die Zellsuspension fließen in das Schiff zu helfen.
6. Füllen Sie den Behälter, bis die alle geimpft Medien betritt das Schiff, das 300 ml Medien sollten noch in den oberen Teil der Medien Tasche bleiben. Entfernen Sie die Klammer aus den Medien Tasche, um weiterhin Befüllen des Behälters. Als flüssige Ansätze der oberen Luft-Verteiler, verlangsamen die Füllrate durch eine Senkung der Medien Tasche, um Überfüllung zu vermeiden. Langsam bringen den Flüssigkeitsstand auf die Markierung und klemmen Sie die Liquid-Handling-Schlauch.

7. Isolation Vorgehensweise, um Flüssigkeit in der Ebenen-Sperre

1. Bringen Sie die HyperStack Schiff in der CSM für die Isolierung so zu positionieren, beide Arten von Verteilern in die höchste Position und senken Sie die Medien Tasche unterhalb der Höhe des Schiffes. Die HyperStack-12-Schicht Schiffes können in die Isolation Position, indem sie eine Hand an der Seite des Schiffes und mit dem anderen auf die Füllkeil Lift angehoben werden.
2. Mit der Jagd-Filter in einer aufrechten Position gehalten wird, öffnen die Jagd Schlauchklemme. Dies wird leer oder jagen die Medien in der Liquid-Handling-Rohr wieder in den Medien Tasche. Sobald der Schlauch leer ist, schließen Sie die Klemme an die Medien bag Schlauch.
3. Keeping the chase Schlauchfilter in einer aufrechten Position, öffnen Sie die Klemme an der Liquid-Handling-Rohr auf der HyperStack, damit alle verbleibenden Flüssigkeit zu betreten und in das Gefäß ins Gleichgewicht. Warten Sie 1-2 Minuten für diese auftreten.
4. Drehen Sie den HyperStack Schiff in der CSM, so dass die Verteiler auf der linken Seite. Senken Sie den Behälter, um die Last Position auf dem CSM. Rocking the HYPEStack-12-Schicht Schiff leicht nach links wird die Beseitigung der die Füllung Keil. Schließen Sie die Klemmen auf beiden die Verfolgung auf und Liquid-Handling-Schlauch.
5. Die Medien Beutel kann nun aus dem Gefäß entfernt werden oder es kann für den Einsatz befestigt später in der Ernte Verfahren bleiben. So speichern Sie das beigefügte Medien Tasche, rollen Sie die leere Tasche und alle übrigen Medien in der Tasche, und unter der Haltebänder in der Ablage der HyperStack Schiff.
6. Bewegen Sie den HyperStack Schiff in den Inkubator. Bei der Durchführung des Schiffes ist darauf zu halten, vom Betreten des Belüftungsfilter Flüssigkeit sein. Dies wird durch Kippen der vielfältigen Ende des HyperStack leicht nach oben erreicht.

8. Ernte-Protokoll

1. Zu Beginn der Ernte Verfahren, schweißen Rohr der Zelle Dissoziationslösung und Quench Beutel zusammen, um die Ernte Tasche zu bilden. Sicherstellen, dass alle Schlauchklemmen geschlossen sind. (Verwenden Karikatur zu zeigen)
2. Entfernen HyperStack Schiff aus dem Inkubator, lassen Sie die Medien Tasche unter der Haltebänder und hänge auf der Tasche stehen. Legen Sie das Schiff in der CSM in der Last Position und ziehen Sie den Deckel auf das Gefäß zu sichern. Haken Sie die Entlüftung Schlauch in die Halteklammer und bewegen Sie den CSM, um die Füllung Position.
3. Sicherstellen, dass die Medien Tasche auf der Tasche stand hängt niedriger als die HyperStack; öffnen Sie die Klemme an die Medien bag Schlauch und das Schiff ist Liquid-Handling-Schlauch, damit Medien in der beiliegenden Tasche fließen.
4. Sobald das Schiff geht ¾ leer, ändern Sie die CSM-Einstellungen, um die endgültige Position leer. Wenn die HyperStack Schiff und Liquid-Handling-Schläuche leer sind, heben Sie den Schlauch an den Medien vorbei die Klemme an der verbrauchten Medien bag Schlauch jagen, dann schließen Sie die Klemme an der Liquid-Handling-Schläuche und die Klemme an der verbrauchten Medien bag Schlauch.
5. Ersetzen Sie die verbrauchte Medien Tasche mit der Ernte Tasche Montage von Rohr Schweißen und erhöhen die Höhe der Zelle Dissoziation Tasche Montage über die Höhe des HyperStack mit der Tasche stehen.
6. Setzen Sie den CSM in der Äquilibrierung Position. Öffnen Sie die Zelle Dissoziationslösung Schlauchklemme und die Lösung in die HyperStack. Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, schließen Sie die Klemmen auf der Liquid-Handling-Schläuche und die Zelle Dissoziationslösung Schlauch.
7. Bringen CSM, um die Last Position. Durch das Halten der horizontalen Positionierung Hebel öffnen, schaukeln das Schiff hin und her mit dem Rad, Verteilen der Lösung in den Zellschichten. Das Schiff kann gelegentlich zu den Ausgleich Position beim Wippen auf eine gleichmäßige Verteilung der Lösung zu halten zurückgegeben werden. Es kann nicht visuell erkennbar, dass die Schichten völlig überzogen sind, aber die Dissoziation Lösung wird gleichmäßig über die Oberfläche der Zellen verteilt werden. Sobald die Lösung angemessen verteilt wurden, lassen Sie den Hebel auf der CSM die HyperStack in der Last seiner Position einrasten. Verlassen Sie die HyperStack in dieser Positionwährend der notwendigen Dissoziation Zeit für Ihre Zellen.
8. Sobald die Zellen abgelöst haben, mit Trübung als Leitfaden, bewegen Sie den CSM zur Equilibrierung Position. Es sollte darauf geachtet werden, dass über verdauen die Zellen sein. Öffnen Sie die stillen Tasche Klemme und die HyperStack Liquid-Handling-Schlauchklemme, damit die stillen Medien in das Gefäß geben. Schließen Sie die Klemme an der HyperStack Liquid-Handling-Schlauch, wenn die Übertragung abgeschlossen ist.
9. Senden Sie das CSM, um die Last Position und halten Sie die horizontale Positionierung Hebel, um das Schiff seitlich Felsen.
10. Mit der Tasche stehen, senken Sie die Position der Ernte Tasche Montage unter dem Niveau des HyperStack. Passen Sie die CSM auf die leere Stelle, öffnen Sie das Gefäß Liquid-Handling-Schlauchklemme und übertragen Sie die Zelle Lösung wieder in die stillen Tasche. Senden Sie das CSM, um die Last Position und trennen Sie die Ernte Tasche Montage aus dem Behälter mit einem Schlauch Versiegelung. Die Zell-Lösung zur Verarbeitung bereit ist.

9. Repräsentative Ergebnisse

• Erntezeit muss optimiert bei der Umwandlung von einer Standard-Polystyrol-Oberfläche, um das Gas durchlässig Polystyrol-Oberfläche sein. Zellen neigen dazu, schneller Freisetzung auf der HyperStack Produkt.
• Um Zellen unter dem Mikroskop die Lüftungs-und Liquid-Handling-Schlauch muss abgeklemmt werden. Legen Sie die HyperStack Schiff auf den Kopf, mit dem Verteiler nach unten, auf dem Mikroskoptisch.
• Prävention Schritte unternommen werden können, um zu vermeiden Benetzung der Filter während des Gebrauchs, die dazu führen sie nicht mehr funktioniert werden. Mit nicht mehr als Füllung der HyperStack Schiff und halten die Luft jagen und Schläuche erhöht, wenn die Klemmen offen sind, sollten keine Benetzung auftreten.
• Der Druck der geschlossenen Klammern an den Schlauch verursacht es geschlossen bleiben, nachdem die Klammern geöffnet werden. Kneifen Sie den Schlauch in die entgegengesetzte Richtung zu öffnen.
• Medien Fließzeit Ein-und Aussteigen HyperStack Schiff via Schwerkraft ist auf dem Medium Höhenunterschied zwischen der obersten Ebene der Medien in der HyperStack Schiff und die oberste Ebene der Medien in den Medien Behälter. Der größere Abstand ist, desto schneller fließen. Der maximale Durchfluss wird durch die Bewertung der Filter 1.5L/min begrenzt.
• Ausreichender Füllvolumen in der HyperStack Schiff wird verhindern, dass Luft Blasenbildung in das Zellwachstum Kammern. Luftblasen können entstehen durch Stichproben oder Inkubation in einem unhumidified Umwelt durch Wasserverlust durch Verdunstung. Die Probenahme Menge und Häufigkeit sowie Inkubationsbedingungen wird entscheiden, ob zusätzliche Flüssigkeit durch den Endbenutzer hinzugefügt werden sollte.

Abbildung 1. Oxygen Depletion von Medien in einem Standard-Zellkulturschale. Die Abbildung zeigt die Abnahme in mg / L Sauerstoff auf der Ebene der Zellen über 3 Tage.

Abbildung 2. Oxygen Gradienten in den Medien in einer Standard-Zellkulturschale. Die Abbildung zeigt die mg / l Sauerstoff am größten ist die Medien-Headspace-Kreuzung als an der Zellschicht.

Abbildung 3. Sauerstoffanteil in der Luftröhre Raum des HyperStack während des Zellwachstums. Die Abbildung zeigt, dass mehr als 96 Stunden ist der Anteil von Sauerstoff zwischen den Schichten, die jeweils gasdurchlässigen Folie unten liefert, konstant bleibt. Dies demonstriert die Fähigkeit der Zellen mit Sauerstoff während des Wachstums den Zugang zur Konfluenz.

Discussion

HyperStack Schiff erfolgreich gewachsen entwickelt, Primär-und Stammzellen. Fluid-Ergänzungen in den Behälter müssen über aseptische Beutel Verbindungen wurden durch Schwerkraft und auch durch Pumpen aus einem sterilen Medien Behälter geleitet. Das Schiff bietet eine mehr als das 2,5 fache Erhöhung der Wachstumsbereich im Vergleich zu einem Plattenstapelzellen Produkt der gleichen volumetrischen Fußabdruck. Die HyperStack-12 ist mit 6.000 cm ² Wachstumsbereich, der HyperStack-36, 18.000 cm ² Wachstumsbereich, und das HyperStack-120 hat 60.000 cm ² der Wachstumsbereich. Durch Vergrößerung der Oberfläche, werden die Benutzer in der Lage, mehr Zellen aus der gleichen Zellpopulation oder viel zu schaffen und Variabilität. Sie sind auch in der Lage, Raum und / oder Arbeit mit weniger Schiffe auf der gleichen Zelle Output zu erzielen, oder erhöhen Messsignaländerung ohne Zusatz von Menschen, Reinraum-Suiten oder Inkubatoren zu speichern. Das System ist mit niedrigen Partikel-Montageverfahren und ohne die Verwendung von Klebstoffen hergestellt. Es ist ein geschlossenes System, mit Schlauch und Filtern, dreifach verpackt und steril geliefert vormontiert ist.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	1350ml media + 150ml serum (if required)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml media + 400ml serum (if required)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	Lonza Inc.	TBD