Закрытая система культуре клеток протокола Использование HyperStack Суда с газопроницаемых Технология Материал

Summary

Введение в технологию, протокол и обработки судов Corning HyperStack и аксессуары для высокой урожайности приверженцем культуры клеток. Протокол будет показано, как использовать закрытых сосудах системы для повышения ячейки уборки по сравнению с нынешним пластины сложены продукты.

Abstract

Большой объем приверженцем культуры клеток в настоящее время стандартизированы по укладываются пластины продуктов клеточного роста, когда микроносителей бисер не оптимальный выбор. HyperStack судов позволит замкнутой системе масштабе по сравнению с текущей стек продуктов пластины и обеспечивает> 2,5 раза больше клеток в той же занимаемой площади объемными. HyperStack судам функции по газопроницаемых материал, который позволяет газообмен происходит, таким образом устраняя потребность в свободном пространстве в пределах внутренних судна. Ликвидация свободного пространства позволяет отсек, где происходит рост клеток должны быть минимизированы, чтобы уменьшить пространство, что позволяет более слоев клеточной поверхности роста в рамках той же занимаемой площади объемными.

Для многих приложений, таких как клеточной терапии или для производства вакцин, замкнутая система необходима для роста клеток и уборки урожая. Судно HyperStack позволяет клетке и добавки реагентов и удаление с помощью трубки из мешков СМИ или другими методами.

Этот протокол будет объяснить, технология, лежащая газопроницаемых материалов, используемых в судах HyperStack, результаты диффузии газа для удовлетворения метаболических потребностей клетки, закрытые протоколы клеточной системы роста, а также различные методы сбора урожая.

Protocol

1. HyperStack судно - газопроницаемых Фон Технология материал

1. Судно HyperStack является многослойный сосуд для закрытой системы культивирования клеток, которая опирается на газообмен через 76.2micron газа фильма проницаемой полимер для клеточного метаболизма.
2. Судно HyperStack отличается от более традиционной культуре клеток судов в том, что у него нет "свободного пространства" выше клетки внутри судна. Вместо того, содержится такое "свободное пространство" для газообмена в сосуд, газопроницаемых продукты воздушные пространства (называемый "трахеи" пространства) под каждую культуру камеру, которая открыта в атмосферу.
3. Это пространство позволяет трахеи клеток, растущих в каждом отделении культуре клеток судна иметь эквивалентный обмен газов.
4. Фильм газопроницаемых позволяет газообмен происходит при сохранении стерильной среде. Все манипуляции с жидкостью для каждого из нескольких слоев происходит через один порт ввода.

2. HyperStack судна Сводка компонентов

1. Stackette является отдельным отсеком культуры клеток, что состоит из верхней плиты и газового проницаемой пленкой. Клетки культивируют в этом отсеке.
2. Жидкие многообразие соединяет каждый из 12 слоев stackette вместе в рамках модуля HyperStack. Модули соединяются с трубками для формирования судов в кратные 12 слоев. Многообразии позволяет пользователю сделать одной жидкости манипуляции все судно.
3. Воздух Многообразие также подключается stackette слои вместе, но он используется для вытеснения воздуха из сосуда, когда жидкость дополнения происходят. Он содержит линии заполнения для использования во время заполнения.
4. Трахеи пространство является открытым воздушным пространством между слоями stackette, позволяя газообмен происходит через каждый слоев газопроницаемых фильма.
5. Жидкие трубы обработки связана с жидким многообразие и используется, чтобы сделать все закрытые манипуляции жидкости системы. Этот компонент может быть изменен.
6. Вентиляционная трубка подключена к воздушной многообразие, содержит фильтр воздуха, и будет использоваться для выпуска избыточного воздуха при сохранении стерильности.
7. Трубы погони имеет фильтра и зажим и подключены к жидкости трубы обработки и используются для эвакуации жидкости из трубы жидкость обработки после заполнения емкости.
8. Манипулятор Corning стека или CSM является манипулятором для оказания содействия в размещении судов в правильное положение во время использования.
9. Заполнение клин из нержавеющей стали помогать использоваться при ручном заполнении HyperStack судов.

3. Газодиффузионных Результаты Через газопроницаемых фильмов, используемых в судах HyperStack

1. В традиционных рост клеток системы с вентилируемым свободное пространство, кислород в СМИ обедненного среднем на 50% в течение 3 дней в культуре. (Рис. 1)
2. В этой же системе клеточного роста, кислорода градиент в 3 мм высота СМИ почти на 50% больше в СМИ к переходу свободного пространства, чем на клеточном уровне. (Рис. 2)
3. Диффузии кислорода через газ 76.2micron проницаемой фильм полистирола равна 2,6 мм диффузии через СМИ. Газопроницаемых фильме используются в судах HyperStack позволяет газообмен происходит на клеточном уровне.
4. % Кислорода в трахеи пространства судов HyperStack остается постоянным, как клетки растут до слияния. (Рис. 3)

4. Медиа-сумка подготовка

1. HyperStack-12 слоем судно выходит 1.3L средств массовой информации и HyperStack-36 слоем судно выходит 3.9l средств массовой информации.
2. До прививки ваши мешки средства массовой информации, если сыворотки, которые будут использоваться, трубы сварные сыворотке сумку сумку средств массовой информации и тщательно перемешать.
3. Зажим с примерно 300 мл СМИ в сумке с использованием больших зажимов сумку. Это будет гарантировать, что все прививки клетки используются во время наполнения и ни одна из них остается в сумке средства массовой информации. Место СМИ мешок на мешок стоять.

5. Прививании СМИ

1. Заполните шприц со шлангом крепится с клеточной суспензии. Трубы сварные 3 / 16 "трубки из шприц, содержащий клеточной суспензии к сумке средства массовой информации.
2. Inject клеточной суспензии в сумку СМИ и хорошо перемешать.

6. Заполните Процедура

1. Трубы сварные прививку СМИ мешок на 3 / 8 "трубки жидкость обработки. Судно HyperStack (используя стерильные подключение или многоцелевые соединяет (ПДК), вы также можете прикрепить сумку СМИ, чтобы судно).
2. Закрыть зажимы на наливных и погони трубок на HyperStack.
3. Место HyperStack 36 Слой судна в CSM в нагрузку положение; крюк вентиляционный фильтр трубку в проведении зажим на CSM. Затяните крышку и двигаться CSM, чтобы заполнить положение. Поставив судно в правильное заполнение позиции; воздушный фильтр сейчас находится в верхнем положении, чтобы предотвратить увлажнение во время операции заполнения. Под углом 10 ° позволяет эквилибрЭйшен жидкости в слоях при заполнении. HyperStack-12 слоем судна размещены на его стороне от заполнения клин находится в правильном положении для заполнения.
4. Чистый воздух от линии заполнения, позиционируя сумку на том же уровне, что и судно HyperStack (не выше). Хранение погони зажим трубки закрыты; открытые жидкости зажим трубки обработки и зажим СМИ мешок, чтобы позволить жидкости внутрь судна.
5. Использование мешок стоять, поднимать сумки СМИ, чтобы помочь потока суспензии клеток в сосуд.
6. Заполнить емкость, так чтобы все прививки СМИ входит судна; 300 мл СМИ должны по-прежнему остаются в верхней части сумки СМИ. Удалить хомут из сумки СМИ, чтобы продолжить заполнение сосуда. В качестве жидких приближается к верхней многообразии воздуха, замедлить скорость заполнения за счет снижения сумку средств массовой информации для того, чтобы предотвратить чрезмерное заполнение. Медленно довести уровень жидкости до линии заполнения и зажим трубки жидкость обработки.

7. Изоляция Процедура блокировки жидкости в слоях

1. Принесите судна HyperStack в CSM для изоляции положении, так как наборы многообразия в верхнее положение и нижний мешок среды ниже высоты емкости. HyperStack-12 слоем судно может быть поднято в изоляции позицию, поставив руки на борту судна и с помощью других поднимать заполнения клина.
2. С помощью фильтра погони состоялась в вертикальном положении, откройте погони зажим трубки. Это будет пустая или преследовать СМИ в жидкость трубку обработки обратно в сумку СМИ. Как только трубка пуста, закройте зажим на трубку сумку СМИ.
3. Хранение погони фильтр трубки в вертикальном положении, открыть зажим на трубке жидкость управляемость на HyperStack, чтобы позволить любому оставшуюся жидкость на въезд и равновесие в сосуде. Подождите 1-2 минуты, чтобы это произошло.
4. Включите судна HyperStack в CSM, так что многообразия слева. Нижний сосуд с нагрузкой позицию по CSM. Раскачивание HYPEStack-12 слоем судно чуть левее будет разрешение на снятие заполнения клина. Закрыть зажимы на обеих погони и жидкие трубки обработки.
5. Сумка СМИ теперь могут быть удалены с судна или он может оставаться прикрепленной для дальнейшего использования в урожай процедуры. Для хранения прилагается сумка СМИ, рулон пустой мешок и все оставшиеся средства массовой информации в сумку, и места, при сохранении полосы в лоток хранения судна HyperStack.
6. Перемещение судна HyperStack в инкубаторе. При проведении судно следует позаботиться, чтобы держать жидкость от входа в воздушный фильтр вентиляции. Это достигается за счет чаевых многообразии конце HyperStack немного вверх.

8. Урожай протокола

1. Для начала процедуры сбора, трубы сварные решение клеточной диссоциации и утолить мешки вместе, чтобы сформировать уборки мешок сборки. Убедитесь, что все трубы зажимы закрыты. (Используйте для демонстрации мультфильма)
2. Удалить HyperStack сосуд из инкубатора, выпуск средств массовой информации мешок из-под сохранением полосы, и повесить на сумку стенда. Место судна в CSM в нагрузку положение и затяните крышку для обеспечения судна. Хук вентиляционные трубы в холдинг зажим и перемещать CSM, чтобы заполнить положение.
3. Убедившись, сумки СМИ на мешок стоять висит ниже, чем HyperStack, открой зажим на трубку СМИ сумку и жидкие трубки обработки судна, чтобы средства массовой информации течь в прилагаемой сумке.
4. Как только судно составляет около ¾ пуст, изменять настройки CSM в финал из свободных позиций. Когда судно HyperStack и жидкие трубки обработки пусты, поднять трубку, чтобы преследовать СМИ прошлом зажим провели трубы сумку СМИ, то закрыть оба зажима на жидком трубы обработки и зажим провели трубы сумку СМИ.
5. Замените провел СМИ сумку с уборки мешок сборку, сварка труб и увеличить высоту сумки клеточной диссоциации сборки выше высоты HyperStack использованием мешок стоять.
6. Место КСМ в уравновешивания позиции. Откройте решение клеточной диссоциации трубки зажима и передачи решения в HyperStack. Когда передача завершена, закройте зажимы на жидком трубы обработки и решения клеточной диссоциации труб.
7. Принесите CSM, чтобы нагрузка позиции. Путем проведения горизонтального положения рычага открытой, мягко рок судно из стороны в сторону с помощью колеса, распределяя решение по ячейке слоев. Судно может иногда быть возвращены в положение равновесия при укачивании для поддержания равномерного распределения раствора. Оно не может быть визуально видно, что слои были полностью покрыты, но решение диссоциации будет равномерно распределена по всей поверхности клетки. Как только решение было адекватно распределенных, отпустите рычаг на CSM для блокировки HyperStack в нагрузку позиции. Оставьте HyperStack в этом положениив течение требуемого времени диссоциации для ваших клеток.
8. Как только отдельные клетки, использование мутности в качестве руководства, двигаться CSM для уравновешивания позиции. Следует проявлять осторожность, чтобы не более переваривать клетки. Открытое утолить зажим сумку и обработки HyperStack жидкости трубы хомут, чтобы утолить СМИ внутрь судна. Закройте зажим на обработку трубы жидкость HyperStack раз передача завершена.
9. Вернуться CSM, чтобы нагрузка позицию и удерживать горизонтальный рычаг позиционирования до рока судно стороны в сторону.
10. Использование мешок стоять, ниже положение сборки урожая мешок ниже уровня HyperStack. Отрегулируйте CSM для свободных позиций, открытых обработки судна жидких трубки зажима и передачи ячейки решение вернуться в утолить сумку. Вернуться CSM, чтобы нагрузка положение и отключите сборки урожая мешок с судна использованием трубки герметик. Клетка решение готово к обработке.

9. Представитель Результаты

• Сбор время должен быть оптимизирован при преобразовании из стандартной поверхности полистирола газопроницаемых поверхности полистирола. Клетки, как правило, быстрее на выпуск продукта HyperStack.
• Для просмотра клетки под микроскопом, трубы вентиляционные и наливных должна быть прикреплена прочь. Место судна HyperStack вверх дном, с многообразия направлен вниз, на столик микроскопа.
• Предупреждение шаги могут быть предприняты, чтобы избежать смачивания фильтров во время работы которого заставит их перестать функционировать. Но, не за заполнением судна HyperStack и поддержание вентиляционной трубы и погони, когда повышенный зажимы открыты, не смачивания должно произойти.
• Давление закрытой зажимы на трубы заставляет его оставаться закрытым после зажимы открыты. Сжатие трубки в обратном направлении будет открыть его.
• Медиа поток времени входа и выхода судна HyperStack через самотеком основан на разнице между СМИ высота верхнего уровня средств массовой информации в сосуд HyperStack и верхний уровень средств массовой информации в контейнере СМИ. Чем больше расстояние, тем быстрее потока. Максимальный поток ограничен рейтинг фильтров для 1.5L/min.
• Поддержание надлежащего заполнения объема в сосуде HyperStack позволит предотвратить образование пузырьков воздуха в камерах роста клеток. Пузырьки воздуха могут возникать из-за отбора проб или в стадии инкубационного периода unhumidified окружающую среду за счет потери воды испарения. Объем выборки и частоты, а также условия инкубации будет определить, если дополнительная жидкость должна быть добавлены конечным пользователем.

Рисунок 1. Кислородному истощению средств массовой информации в сосуд со стандартным культуре клеток. На рисунке показано снижение мг / л кислорода на уровне клеток в течение 3 дней.

Рисунок 2. Кислород градиент в СМИ в сосуд со стандартным культуре клеток. На рисунке показана мг / л кислорода наибольшая в средствах массовой информации до пересечения свободного пространства, чем на клеточном уровне.

Рисунок 3. Процентное содержание кислорода в трахеи пространство HyperStack во время роста клеток. Рисунок показывает, что более 96 часов, процентное содержание кислорода между слоями, которая поставляет каждый газопроницаемых нижней пленки, остается постоянным. Это демонстрирует способность клеток для доступа кислорода во время роста до слияния.

Discussion

HyperStack судно успешно выращивают инженерии, первичных и стволовых клеток. Жидкость дополнений в судне были проведены через асептический мешок соединений под действием силы тяжести кормов, а также путем откачки из стерильный контейнер СМИ. Судно обеспечивает больше 2.5X увеличение темпов роста по сравнению области укладываются пластины продукт одного и того же объемного следа. HyperStack-12 имеет 6000 см ² рост области, HyperStack-36 имеет 18000 см ² роста области, и HyperStack-120 имеет 60000 см ² рост области. За счет увеличения площади поверхности, пользователь в состоянии производить больше клеток из одной популяции клеток или партии и уменьшить изменчивость. Они также имеют возможность для экономии места и / или родов, используя меньше судов для достижения того же выход ячейки, или увеличить выход ячейки без добавления людей, чистых комнат апартаментов, или инкубаторов. Системы производится с низкой методы сборки частиц и без использования клея. Это закрытая система, которая уже оснащены трубка наборы и фильтров, трех мешках и при условии, стерильны.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	1350ml media + 150ml serum (if required)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml media + 400ml serum (if required)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	Lonza Inc.	TBD