Gesloten systeem Cultuur van de Cel Protocol gebruik HyperStack Schepen met een zuurstofdoorlatende Material Technology

Summary

Een inleiding in de techniek, het protocol en de behandeling van de Corning HyperStack Schepen en toebehoren gebruikt voor het hoog rendement aanhanger celcultuur. Het protocol zal laten zien hoe het gesloten systeem vaten voor het vergroten van cel-oogst te gebruiken dan de huidige gestapeld plaat producten.

Abstract

Groot volume aanhanger celcultuur is op dit moment gestandaardiseerd op gestapelde plaat celgroei producten die op de microdrager kralen niet een optimale keuze. HyperStack recipiënten gesloten systeem opschalen van de huidige gestapelde plaat producten en levert> 2,5 maal meer cellen in dezelfde volumetrische footprint. De HyperStack schepen functie via gas doorlatend materiaal waardoor gasuitwisseling optreden, dus het elimineren van de noodzaak van interne vrije ruimte in een schip. De eliminatie van headspace kan het compartiment waar de celgroei plaatsvindt tot een minimum beperkt om ruimte te verminderen, waardoor meer lagen van de celgroei oppervlakte binnen hetzelfde volumetrische footprint.

Voor vele toepassingen, zoals cel-therapie of productie van vaccins, is een gesloten systeem die nodig zijn voor celgroei en oogsten. De HyperStack schip maakt cel en reagens toevoegen en verwijderen via de slang van de media zakken of andere methoden.

Dit protocol geeft uitleg over de technologie achter de gas doorlatend materiaal dat wordt gebruikt in de HyperStack schepen, gasdiffusie resultaten aan de metabole behoeften van de cellen, gesloten systeem celgroei protocollen, en verschillende oogstmethoden te voldoen.

Protocol

1. HyperStack Vessel - zuurstofdoorlatende Material Technology Achtergrond

1. De HyperStack Schip is een meerlaags vat voor gesloten systeem kweken van cellen die op gas uitwisseling steunt door middel van een 76.2micron gasdoorlatend polymeerfilm voor cellulaire stofwisseling.
2. De HyperStack schip onderscheidt zich van de meer traditionele celkweek schepen in dat het niet over een "head space" boven de cellen in het vat. In plaats van met deze "headspace" voor gas-uitwisseling binnen het vaartuig, de zuurstofdoorlatende producten zijn voorzien van ruimtes (aangeduid als "tracheale" spaties) onder elke cultuur kamer die open is naar de atmosfeer.
3. Deze tracheale ruimte maakt de cellen groeien in elke cel cultuur compartiment van het schip gelijkwaardige gasuitwisseling hebben.
4. Het gas permeabele laat gasuitwisseling plaatsvinden met behoud van een steriele omgeving. Alle vloeistof manipulaties voor elk van de meerdere lagen plaatsvinden door middel van een single entry poort.

2. HyperStack Vessel Component Summary

1. De Stackette is de individuele cel cultuur compartiment dat bestaat uit de bovenste plaat en zuurstofdoorlatende film. De cellen worden gekweekt in dit compartiment.
2. De Liquid Manifold verbindt elk van de 12 stackette lagen samen in een HyperStack module. Modules zijn verbonden met de buis aan schepen vorm in veelvouden van 12 lagen. Het spruitstuk kan de gebruiker een vloeistof manipulatie aan te brengen in het gehele vaartuig.
3. De Air Manifold verbindt ook de stackette lagen aan elkaar, maar het gebruikt om de lucht te verplaatsen van het schip als vloeistof aanvullingen optreden. Het bevat een vullijn voor gebruik tijdens het vullen.
4. De Tracheale Space is de open lucht ruimte tussen elke stackette laag, waardoor gasuitwisseling plaatsvinden door elke lagen 'zuurstofdoorlatende film.
5. De Liquid handling slang is verbonden met de vloeistof en het spruitstuk wordt gebruikt om alle gesloten systeem vloeistof manipulaties te maken. Deze component kan worden aangepast.
6. De Vent slang is verbonden met de lucht spruitstuk, bevat een luchtfilter, en wordt gebruikt om overtollige lucht vrij met behoud van steriliteit.
7. De achtervolging buis heeft een filter en klem en zijn verbonden met de liquid handling slangen en worden gebruikt om de vloeistof te evacueren uit het hanteren van vloeistoffen slang na het vullen van het schip.
8. De Corning Stack Manipulator of CSM is een handling-apparaat om te helpen bij het plaatsen van de schepen in de juiste positie tijdens het gebruik.
9. Het vullen van Wedge is een roestvrij stalen assisteren gebruikt bij het handmatig vullen van de HyperStack schepen.

3. Gas Diffusion Resultaten door zuurstofdoorlatende Film gebruikt in de HyperStack Vessels

1. In traditionele celgroei systemen met geventileerde headspace, wordt de zuurstof in de media uitgeput een gemiddelde van 50% over 3 dagen in cultuur. (Figuur 1)
2. In dezelfde cel groei van het systeem, de zuurstof gradiënt in een 3 mm hoogte van de media is bijna 50% groter is bij de media om kopruimte knooppunt dan is het op de cel-laag. (Figuur 2)
3. De diffusie van zuurstof door het 76.2micron zuurstofdoorlatende polystyreen film is gelijk aan de verspreiding door middel van 2,6 mm van de media. Het gas permeabele gebruikt in de HyperStack vaten kan de gasuitwisseling zullen optreden bij de cel-laag.
4. Het% van de zuurstof in de tracheale ruimte van de HyperStack schepen blijft constant als cellen groeien tot confluentie. (Figuur 3)

4. Media-Bag Voorbereiding

1. De HyperStack-12 laag schip duurt 1,3 van media en de HyperStack-36 laag schip duurt 3,9 l van de media.
2. Voorafgaand aan inenten van uw zakken media, als het serum wordt gebruikt, buis lassen het serum zak om de media-zak en meng goed.
3. Klem uit ongeveer 300 ml van media in de zak met behulp van grote tas klemmen. Dit zal ervoor zorgen dat alle geënte cellen worden gebruikt tijdens het vullen en niemand zijn die nog in de media zak. Leg media tas op zak staan.

5. Enten Media

1. Vul een spuit met slang bevestigd met celsuspensie. Buis lassen 3 / 16 "slang van een spuit met celsuspensie aan de media tas.
2. Injecteer de celsuspensie in de Media Bag en meng goed.

6. Vul Procedure

1. Buis lassen het geënte medium zak om 3 / 8 "liquid handling buis. Van de HyperStack schip (met een steriele aansluiting of Multipurpose verbindt (MPL), kunt u de media tas ook hechten aan het schip).
2. Sluit de klemmen op de liquid handling en jagen buizen op de HyperStack.
3. Plaats de HyperStack 36 Layer Schip in de CSM in de belasting positie, haak de beluchtingsfilter buis in de holding klem op de CSM. Draai het deksel en zet de CSM op de vulling positie. Door het schip in de juiste positie te vullen, het luchtfilter is nu in de hoogste positie om nat te voorkomen tijdens de werking te vullen. De 10 ° hoek vergunningen equilibratie van de vloeistof die de lagen tijdens het vullen. De HyperStack-12 laag schip op zijn kant op de vulling wig is in de juiste positie voor het vullen.
4. Heldere lucht uit de vullijn door het plaatsen van de zak op hetzelfde niveau als de HyperStack schip (niet hoger). Het houden van de jacht slangklem dicht, open de liquid handling slangklem en de media tas klem om de vloeistof te laten het schip in te voeren.
5. Met behulp van de zak staan, verhogen de media zak om de celsuspensie stroom in het vat te helpen.
6. Vul het vaartuig te schorsen totdat het al het geënte medium komt het schip, de 300 ml van de media moeten nog steeds in het bovenste gedeelte van de media zak. Verwijder de klem van de media zak om verder te gaan vullen van het schip. Als vloeibare benadert de bovenste lucht-spruitstuk, vertragen de fill rate door het verlagen van de media zak om te voorkomen over de vulling. Langzaam breng de vloeistof niveau om de vullijn en klem de liquid handling slang.

7. Isolatie Procedure voor Liquid Lock in de lagen

1. Breng de HyperStack schip in de CSM aan het isolement positie, zodat beide sets spruitstukken zijn in de hoogste stand en laat de media zak onder de hoogte van het schip. De HyperStack-12 laag schip kan worden opgeheven in de isolatie positie door het plaatsen van een hand op de zijkant van het schip en met de andere om de vulling wig lift.
2. Met de jacht filter gehouden in een rechtopstaande positie, opent de jacht slangklem. Dit zal leeg is of de media terug te jagen in de liquid handling buis in de media zak. Zodra de slang leeg is, sluit de klem op de media zak slang.
3. Het houden van de jacht buis filter in een rechtopstaande positie, opent u de klem op de liquid handling buis op de HyperStack om eventuele resterende vloeistof binnen te komen en evenwicht in het vat. Wacht 1-2 minuten om dit te laten gebeuren.
4. Draai de HyperStack schip in de CSM, zodat de spruitstukken worden aan de linkerkant. Verlagen van het schip om de belasting positie op de CSM. Het schommelen van de HYPEStack-12 laag schip iets naar links zal het mogelijk het verwijderen van de vulling wig. Sluit de klemmen op zowel de achtervolging en de liquid handling buizen.
5. De media zak kan nu worden verwijderd uit het schip of het kan blijven zitten voor later gebruik in de oogst procedure. Voor het opslaan van de bijgevoegde media zak, rolt de lege zak en de resterende media in de zak en plaats onder de het behoud van bands in het opbergvak van de HyperStack schip.
6. Verplaats de HyperStack schip naar de incubator. Bij de uitvoering van het schip zorg moeten worden genomen om vloeibaar te houden van het invoeren van de ontluchter filter. Dit wordt bereikt door tikken op de veelvuldige einde van de HyperStack lichtjes omhoog.

8. Oogst Protocol

1. Om te beginnen de oogst procedure, tube elkaar lassen van de cel dissociatie oplossing en lessen zakken naar het oogsten zak geheel vormen. Zorg ervoor dat alle slangen klemmen zijn gesloten. (Gebruik cartoon om aan te tonen)
2. Verwijderen HyperStack schip uit de incubator, laat de media tas van onder de behouden bands, en hang op de zak staan. Plaats het schip in de CSM in de belasting positie en draai de deksel om het schip veilig te stellen. Haak de ontluchting slang in de holding klem en zet de CSM op de vulling positie.
3. Ervoor zorgen dat de media tas op de zak stand is opknoping lager is dan de HyperStack, open de klem op de media zak slang en het schip liquid handling slang om media te stromen in de bijgevoegde zak.
4. Zodra het schip over gaat ¾ leeg is, wijzigt u de CSM instellingen om de laatste lege positie. Wanneer de HyperStack schip en liquid handling slangen leeg zijn, de slang lift naar de media jagen voorbij de klem op de gebruikte media zak slang, sluit zowel de klem op de liquid handling slang en de klem op de gebruikte media zak buizen.
5. Vervang de gebruikte media tas met het oogsten zak montage door buis lassen en verhogen de hoogte van de cel dissociatie zak montage boven de hoogte van de HyperStack met behulp van de tas staan.
6. Plaats de CSM in het evenwicht positie. Open de cel dissociatie oplossing slangklem en de oplossing te zetten in de HyperStack. Wanneer de overdracht voltooid is, sluit de klemmen op de liquid handling slang en de cel dissociatie oplossing buizen.
7. Breng CSM om de lading positie. Door vast te houden de horizontale positionering hendel te openen, schud het schip van links naar rechts met behulp van het wiel, het verdelen van de oplossing over de cel lagen. Het schip kan incidenteel worden teruggegeven aan de equilibratie positie tijdens schommelen om een ​​gelijke verdeling van de oplossing te behouden. Het kan niet duidelijk zichtbaar dat de lagen volledig bedekt, maar de dissociatie oplossing zal gelijkelijk worden verdeeld over het oppervlak van de cellen. Zodra de oplossing is adequate verdeling, laat u de hendel op de CSM om de HyperStack sluis in de belasting positie. Laat de HyperStack in deze positietijdens de vereiste dissociatie tijd voor je cellen.
8. Zodra de cellen hebben losgemaakt, het gebruik van troebelheid als een gids, de CSM naar de equilibratie positie. Zorg ervoor dat u niet meer dan verteren de cellen. Open de quench tas klem en de HyperStack liquid handling slangklem om de quench media om het schip in te voeren. Sluit de klem op de HyperStack liquid handling buis nadat de overdracht is voltooid.
9. Zet de CSM om de belasting positie en houd de horizontale positionering hendel om het schip naast rock kant.
10. Met behulp van de zak staan, hoe lager de positie van de oogst zak montage onder het niveau van de HyperStack. Stel de CSM naar de lege positie, opent u het schip liquid handling buis terug klem en breng de cel oplossing in de quench zak. Zet de CSM om de belasting positie en verwijder de oogst zak montage van het schip met behulp van een buis sealer. De cel oplossing is klaar voor verwerking.

9. Representatieve resultaten

• Oogsten tijd moet worden geoptimaliseerd bij het converteren van een standaard polystyreen oppervlak om de gasdoorlatend polystyreen oppervlak. Cellen hebben de neiging om sneller te release op het HyperStack product.
• Om cellen onder de microscoop van de opening en de liquid handling leidingen dient te worden afgeklemd. Plaats de HyperStack schip ondersteboven, met de manifolds naar beneden, op de microscoop podium.
• Preventie maatregelen kunnen worden genomen om te voorkomen dat het bevochtigen van de filters tijdens het gebruik dat zal ervoor zorgen dat ze ophouden te werken. Door niet meer dan het vullen van het HyperStack schip en houden van de opening en de achtervolging slangen verhoogd wanneer de klemmen open zijn, mag geen nat optreden.
• De druk van de gesloten klemmen op de slang zorgt ervoor dat het gesloten blijven na de klemmen worden geopend. Knijpen de slang in de tegenovergestelde richting zal openen.
• Mediastroom tijd binnenkomen en verlaten van de HyperStack schip via de zwaartekracht is gebaseerd op het media hoogteverschil tussen het hoogste niveau van de media in de HyperStack vat en het hoogste niveau van de media in de media container. De grotere afstand, hoe sneller de stroming. Het maximale debiet is beperkt door de rating van de filters om 1.5L/min.
• Behoud van een goede vullen volume in de HyperStack schip zal voorkomen dat er lucht belvorming in de cel groeikamers. Luchtbellen kunnen optreden als gevolg van bemonstering of incuberen in een unhumidified milieu door verdamping water verlies. De bemonstering hoeveelheid en de frequentie en incubatie-omstandigheden zal bepalen of extra vocht moet worden toegevoegd door de eindgebruiker.

Figuur 1. Zuurstof uitputting van de media in een standaard celkweek schip. De figuur toont de daling in mg / L van zuurstof op het niveau van de cellen meer dan 3 dagen.

Figuur 2. Zuurstof gradiënt in de media in een standaard celkweek schip. De figuur toont de mg / L van zuurstof is het grootst bij de media om kopruimte kruispunt dan op de cel-laag.

Figuur 3. Percentage zuurstof in de tracheale ruimte van de HyperStack tijdens de celgroei. De figuur laat zien dat meer dan 96 uur, het percentage van zuurstof tussen de lagen, die elk gas permeabele bodem benodigdheden, constant blijft. Dit toont het vermogen van de cellen om zuurstof toegang tijdens de groei tot confluentie.

Discussion

HyperStack schip is succesvol uitgegroeid ontworpen, primaire en stamcellen. Vloeistof toevoegingen in het schip zijn uitgevoerd via een aseptische bag-verbindingen door de zwaartekracht voeden en ook door pompen uit een steriele media-container. Het schip biedt een groter dan 2,5 maal de stijging van de groei van een gebied ten opzichte van gestapelde plaat product van dezelfde volumetrische footprint. De HyperStack-12 is 6000 cm ² groeigebied, de HyperStack-36 heeft 18.000 cm ² groeigebied, en de HyperStack-120 heeft 60.000 cm ² van de groei gebied. Door het vergroten van de oppervlakte, gebruikers in staat om meer cellen uit dezelfde cel bevolking of veel te produceren en variabiliteit te verminderen. Ze zijn ook in staat om ruimte en / of arbeid te besparen door het gebruik van minder schepen naar dezelfde cel uitgang te bereiken, of een mobiele productie toenemen zonder dat er mensen, cleanroom suites of incubators. Het systeem is geproduceerd met een laag fijn montage methoden en zonder het gebruik van lijmen. Het is een gesloten systeem dat is voorgemonteerd met slang sets en filters, drie zakken en steriel geleverd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	1350ml media + 150ml serum (if required)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml media + 400ml serum (if required)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	Lonza Inc.	TBD