Biology

Sistema de célula cerrada Cultura protocolo mediante buques HyperStack con la tecnología de materiales permeables al gas

Published: November 29, 2010 doi: 10.3791/2499

Kim Titus*¹, Vitaly Klimovich*², Mark Rothenberg², Pilar Pardo*², Allison Tanner*³, Greg Martin³

¹Business Development, Corning Life Science, ²Applications, Corning Life Science, ³Product Development, Corning Life Science

* These authors contributed equally

Summary

Una introducción a la tecnología, el protocolo y el manejo de los vasos Corning HyperStack y accesorios utilizados para el alto rendimiento de la cultura de células adherentes. El protocolo se mostrará cómo utilizar los vasos sistema cerrado para la recolección de células cada vez más de los productos actuales de la placa de apilado.

Abstract

Cultivo a gran volumen de células adherentes se encuentra estandarizado en productos apilados placa de crecimiento celular cuando microportadores cuentas no son una elección óptima. Vasos HyperStack permitir escala un sistema cerrado a partir de los productos apilados corriente de placa y entrega> 2,5 veces más células de la huella volumétrica mismo. Los vasos HyperStack función a través de materiales permeables al gas que permite el intercambio de gases que se produzcan, por lo tanto, eliminando la necesidad de espacio libre interior de un buque. La eliminación de espacio libre permite que el compartimiento donde el crecimiento celular se produce a minimizar para reducir el espacio, permitiendo que más capas de la superficie de crecimiento de las células dentro de la huella volumétrica mismo.

Para muchas aplicaciones, tales como la terapia celular o la producción de vacunas, un sistema cerrado es necesario para el crecimiento celular y la cosecha. El buque HyperStack permite la adición de células y el reactivo y la eliminación a través de tubos de las bolsas de los medios de comunicación u otros métodos.

Este protocolo se explicará la tecnología detrás de los materiales permeables al gas utilizado en los vasos HyperStack, los resultados de difusión de gas para satisfacer las necesidades metabólicas de las células, células del sistema cerrado protocolos de crecimiento, y los distintos métodos de recolección.

Protocol

1. Buque HyperStack - Gas Permeable Antecedentes Tecnología de Materiales

El buque es un buque HyperStack multicapa para el cultivo de un sistema cerrado de las células que se basa en el intercambio de gases a través de una película de gas 76.2micron polímero permeable para el metabolismo celular.
El buque HyperStack diferencia de más embarcaciones tradicionales de cultivo celular en el que no tiene un "espacio de cabeza" por encima de las células en el interior del buque. En vez de contener este "espacio libre" para el intercambio de gas dentro del recipiente, los productos de gas permeable con espacios de aire (conocido como "traqueal" espacios) debajo de cada cámara de la cultura que está abierta a la atmósfera.
Este espacio traqueal permite a las células que crecen en cada compartimiento de cultivo de células de la embarcación para que el intercambio de gas equivalente.
La película de gas permeable permite el intercambio de gases que se produzcan al mismo tiempo mantener un ambiente estéril. Todas las manipulaciones de fluidos para cada una de las múltiples capas se producen a través de una puerta de entrada única.

2. Buque HyperStack Resumen de Componente

El Stackette es el compartimiento de cultivo de células individuales que se compone de la placa superior y la película de gas permeable. Las células se cultivan en este compartimento.
El colector de líquido se conecta cada una de las 12 capas stackette juntos dentro de un módulo HyperStack. Los módulos están conectados con la tubería a la formación de vasos en múltiplos de 12 capas. El colector permite al usuario realizar una manipulación de fluidos a todo el buque.
El distribuidor de aire también conecta las capas stackette juntos, pero es utilizado para desplazar el aire del recipiente de líquido cuando se producen incorporaciones. Contiene una línea de llenado para su uso durante el llenado.
El espacio de la tráquea es el espacio al aire libre entre cada capa stackette, lo que permite el intercambio de gases que se produzcan a través de películas permeables al gas cada capa.
La tubería de manejo de líquidos está conectado al colector de líquidos y se usa para hacer todas las manipulaciones del sistema cerrado de fluidos. Este componente se puede personalizar.
El tubo de ventilación conectado al colector de aire, contiene un filtro de aire, y se utiliza para liberar el exceso de aire mientras se mantiene la esterilidad.
La tubería de persecución tiene un filtro y la abrazadera y se conectan a la tubería de manejo de líquidos y se utilizan para evacuar el líquido de la tubería de manejo de líquidos después de llenar el vaso.
El manipulador de la pila Corning o CSM es un dispositivo de manipulación para ayudar en la colocación de los vasos en las posiciones correctas durante el uso.
La cuña de relleno es un acero inoxidable ayudar a utilizar cuando rellenar manualmente los vasos HyperStack.

3. Los resultados de difusión de gas a través del cine permeables al gas usada en los recipientes HyperStack

En los sistemas tradicionales de crecimiento de las células con espacio de cabeza de ventilación, el oxígeno en los medios de comunicación se ha agotado un promedio de 50% más de 3 días de cultivo. (Figura 1)
En el sistema de crecimiento de las células mismas, el gradiente de oxígeno en una altura de 3 mm de los medios de comunicación es casi un 50% mayor en los medios de comunicación hasta la salida del espacio de cabeza de lo que está en la capa de células. (Figura 2)
La difusión de oxígeno a través de la película de gas permeable 76.2micron poliestireno es igual a la difusión a través de 2,6 mm de los medios de comunicación. La película permeable a los gases utilizados en los vasos HyperStack permite el intercambio de gases a ocurrir en la capa de células.
El% de oxígeno en el espacio de la tráquea de los vasos HyperStack se mantiene constante en las células crecen a la confluencia. (Figura 3)

4. Los medios de preparación de bolsas

El HyperStack-12 vasos de capa se 1.3L de los medios de comunicación y la HyperStack-36 vasos de 3,9 litros de capa tiene los medios de comunicación.
Antes de la inoculación de sus medios de comunicación en bolsa, si el suero se va a utilizar, el tubo de soldadura de la bolsa de suero a la bolsa de los medios de comunicación y mezclar bien.
Abrazadera de aproximadamente 300 ml de los medios de comunicación en la bolsa utilizando pinzas bolsa grande. Esto asegurará que todas las células inoculadas se utilizan durante el llenado y no se quedan en la bolsa de los medios de comunicación. Coloque la bolsa de los medios de comunicación en el stand de la bolsa.

5. Medios de inoculación

Llene una jeringa con un tubo conectado con la suspensión celular. Soldadura del tubo 3 / 16 "tubo de la jeringa que contiene una suspensión de células a la bolsa de los medios de comunicación.
Se inyecta la suspensión celular en la bolsa de los medios de comunicación y mezclar bien.

6. Rellene Procedimiento

Tubo de soldadura de la bolsa inoculados los medios de comunicación a la embarcación HyperStack de 3 / 8 "tubería de manejo de líquidos. (Con estéril Conecta o multiusos se conecta (PSM), también puede conectar la bolsa de los medios de comunicación en la vasija).
Cerrar las pinzas en el manejo de líquidos y las trompas de caza en el HyperStack.
Coloque el HyperStack 36 buques en la capa de CSM en la posición de carga, conectar el tubo de ventilación del filtro en la abrazadera de sujeción en el CSM. Apriete la tapa y mover el CSM a la posición de llenado. Al poner el barco en la posición de llenado correcto, el filtro de aire se encuentra en la posición más alta para evitar que se moje durante la operación de relleno. El ángulo de 10 ° permite equilibrción del líquido a las capas durante el llenado. El buque capa HyperStack-12 situado en el lado de la cuña de relleno está en la posición correcta para el relleno.
Aire claro de la línea de llenado mediante la colocación de la bolsa en el mismo nivel que el buque HyperStack (no más). Mantener la abrazadera de la manguera perseguir cerrado, abra la pinza de manipulación tubo de líquidos y la pinza de bolsa de los medios de comunicación para permitir que el líquido entre en el buque.
Uso del soporte bolsa, aumentar la bolsa de los medios de comunicación para ayudar al flujo de la suspensión de células en el vaso.
Llenar el depósito hasta que todos los medios inoculados entra en el recipiente, el de 300 ml de los medios de comunicación todavía debe permanecer en la parte superior de la bolsa de los medios de comunicación. Retire la abrazadera de la bolsa de los medios de comunicación para seguir llenando el vaso. Como líquido se aproxima el colector de aire superior, disminuir la tasa de relleno mediante la reducción de la bolsa de los medios de comunicación a fin de prevenir sobre el relleno. Lentamente que el nivel de líquido a la línea de llenado y la abrazadera de la manguera de manejo de líquidos.

7. Procedimiento para el aislamiento de bloqueo de líquido en las capas

Llevar el buque HyperStack en el CSM en la posición de aislamiento para los dos conjuntos de colectores se encuentran en la posición más alta y más baja la bolsa de los medios de comunicación por debajo de la altura de la nave. El HyperStack-12 vasos de capa se pueden levantar en la posición de aislamiento mediante la colocación de una mano en el costado del barco y usa la otra para levantar la cuña de relleno.
Con el filtro de perseguir a cabo en una posición vertical, abra la abrazadera de la manguera persecución. Se eliminará o perseguir a los medios de comunicación en el tubo de manejo de líquidos en la bolsa de los medios de comunicación. Una vez que la tubería está vacía, cierre la pinza en el tubo de la bolsa de los medios.
Mantener el filtro del tubo de persecución en una posición vertical, abra la pinza en el tubo de manejo de líquidos en el HyperStack para permitir que el líquido restante para entrar y equilibrar en el vaso. Esperar 1-2 minutos para que esto ocurra.
A su vez el buque HyperStack en el CSM para que los colectores están a la izquierda. Inferior del buque a la posición de carga en el CSM. Balanceo de la embarcación-12 HYPEStack capa ligeramente a la izquierda permitirá la eliminación de la cuña de relleno. Cerrar las pinzas en ambos la persecución y el tubo de manejo de líquidos.
La bolsa de los medios de comunicación ahora puede ser removido de la embarcación, o puede permanecer unidos para su uso posterior en el procedimiento de la cosecha. Para guardar el adjunto bolsa de los medios de comunicación, rollo de la bolsa vacía y cualquier otro medio que queda en la bolsa, y de lugar en las bandas de retención en la bandeja de almacenamiento del buque HyperStack.
Mover el barco HyperStack a la incubadora. Al llevar a la atención de buques deben tomar para evitar que el líquido penetre en el filtro de ventilación de aire. Esto se logra por el depósito al final del colector de la HyperStack ligeramente hacia arriba.

8. Protocolo de Cosecha

Para comenzar el procedimiento de la cosecha, la soldadura del tubo de la solución de disociación celular y bolsas de apagar juntos para formar el conjunto de la bolsa de recolección. Asegurar que todas las pinzas de la línea están cerrados. (El uso de dibujos animados para demostrar)
Retire vaso HyperStack de la incubadora, la liberación de la bolsa de los medios de comunicación de debajo de las bandas de retención, y pasar el rato en el stand de la bolsa. Colocar el recipiente en el CSM en la posición de carga y apretar la tapa para asegurar la embarcación. Gancho de la tubería de ventilación en la abrazadera de sujeción y mover el CSM a la posición de llenado.
Asegurarse de que la bolsa de los medios de comunicación en el stand de la bolsa cuelga más bajo que el HyperStack, abrir la pinza en el tubo de la bolsa los medios de comunicación y la tubería del buque de manejo de líquidos para permitir que los medios de comunicación de flujo en la bolsa adjunta.
Una vez que el buque está a punto ¾ vacío, cambiar la configuración de CSM en la posición de vacío final. Cuando el buque HyperStack y tubos de manejo de líquidos están vacías, levantar el tubo para perseguir a los medios de comunicación más allá de la pinza en el tubo de la bolsa pasó medios de comunicación, a continuación, cierre tanto de la pinza del tubo de manejo de líquidos y la pinza en el tubo de la bolsa pasó de los medios.
Vuelva a colocar la bolsa pasó los medios de comunicación con el conjunto de bolsa de recolección de soldadura de tubos y elevar la altura de la asamblea celular bolsa de disociación por encima de la altura de la HyperStack utilizando el soporte de la bolsa.
Coloque el CSM en la posición de equilibrio. Abrir el tubo de disociación celular solución pinza y la transferencia de la solución en el HyperStack. Cuando se complete la transferencia, cierre las abrazaderas en el tubo de manejo de líquidos y el tubo de disociación celular solución.
Traiga CSM a la posición de carga. Mediante la celebración de la palanca de posicionamiento horizontal abierta, agite suavemente el lado del depósito a otro usando la rueda, la distribución de la solución sobre las capas de células. El buque de vez en cuando puede ser devuelto a la posición de equilibrio durante el balanceo de mantener una distribución equitativa de la solución. Puede que no sea visualmente evidente que las capas están completamente cubiertas, pero la solución de disociación se distribuyen por igual en toda la superficie de las células. Una vez que la solución ha sido adecuadamente distribuido, comunicado de la palanca de la CSM para bloquear el HyperStack en la posición de carga. Deje el HyperStack en esta posicióndurante el tiempo necesario para la disociación de las células.
Una vez que las células se han desprendido, con turbidez como una guía, mueva el CSM en la posición de equilibrio. Se debe tener cuidado de no digerir más de las células. Abra la pinza de la bolsa de enfriamiento y el líquido HyperStack pinza de la línea de manejo para que los medios de saciar a entrar en el buque. Cierre la pinza del tubo de manejo HyperStack líquido una vez se complete la transferencia.
Volver al CSM a la posición de carga y mantenga la palanca de posicionamiento horizontal de roca el lado del depósito a otro.
Uso del soporte bolsa, bajar la posición del conjunto de bolsa de la cosecha por debajo del nivel de la HyperStack. Ajuste el CSM en la posición vacía, abrir el recipiente de líquido del tubo de sujeción y manejo de la transferencia de la solución de células en la bolsa de apagar. Volver al CSM a la posición de carga y desconexión de la bolsa de montaje de la cosecha de la embarcación con un sellador de tubo. La solución celular está listo para su procesamiento.

9. Resultados representante

Momento de la cosecha debe ser optimizado cuando se convierte de una superficie de poliestireno estándar de gas a la superficie de poliestireno permeable. Las células tienden a liberar más rápidamente en el producto HyperStack.
Para ver las células bajo un microscopio los tubos de ventilación y manejo de líquidos debe ser fijada apagado. Colocar el recipiente HyperStack al revés, con los colectores hacia abajo, en la platina del microscopio.
Medidas de prevención se pueden tomar para evitar que se moje los filtros durante el uso que hará que deje de funcionar. Por no más de llenar el vaso HyperStack y mantener la ventilación y el tubo de persecución elevada cuando las pinzas están abiertas, no mojar debe ocurrir.
La presión de las pinzas cerradas en el tubo hace que permanecen cerradas después de que las pinzas se abren. Pellizcar el tubo en la dirección opuesta, lo abrirá.
Tiempo de los medios de comunicación de flujo de entrada y salida del buque HyperStack a través de la alimentación por gravedad se basa en la diferencia de altura media entre el nivel superior de los medios de comunicación en el vaso HyperStack y el nivel superior de los medios de comunicación en el contenedor de los medios de comunicación. La mayor distancia, más rápido será el flujo. El caudal máximo está limitado por la calificación de los filtros para 1.5L/min.
Mantener un volumen adecuado llenar el vaso HyperStack evitará la formación de burbujas de aire en las cámaras de crecimiento de las células. Las burbujas de aire puede ocurrir debido a la toma de muestras o en incubación en un entorno unhumidified debido a la pérdida de agua por evaporación. La cantidad y frecuencia de muestreo, así como las condiciones de incubación se determinará si el exceso de líquidos deben ser añadidos por el usuario final.

Figura 1. El agotamiento del oxígeno de los medios de comunicación en un recipiente de cultivo celular estándar. La figura muestra la disminución en mg / L de oxígeno a nivel de las células durante 3 días.

Figura 2. Gradiente de oxígeno en los medios de comunicación en un recipiente de cultivo celular estándar. La figura muestra el mg / L de oxígeno es mayor en los medios de comunicación a la intersección del espacio de cabeza que en la capa de células.

Figura 3. Porcentaje de oxígeno en el espacio de la tráquea de la HyperStack durante el crecimiento celular. La figura muestra que más de 96 horas, el porcentaje de oxígeno entre las capas, lo que proporciona a cada parte inferior de gases de película permeable, se mantiene constante. Esto demuestra la capacidad de las células para el acceso de oxígeno durante el crecimiento de la confluencia.

Discussion

Buques HyperStack ha crecido con éxito ingeniería, pilas y madre. Adiciones de líquido en el vaso se han realizado a través de conexiones bolsa aséptica por gravedad y por bombeo de un recipiente estéril, los medios de comunicación. El buque ofrece un aumento de 2,5 veces mayor que en el área de crecimiento frente a un producto de la placa de apilado de la huella volumétrica mismo. El HyperStack-12 tiene 6.000 cm ² área de crecimiento, el HyperStack-36 cuenta con 18.000 cm ² área de crecimiento, y el HyperStack 120 cuenta con 60.000 cm ² de área de crecimiento. Al aumentar la superficie, los usuarios son capaces de producir más células de la misma población celular o lote y reducir la variabilidad. También son capaces de ahorrar espacio y / o mano de obra mediante el uso de menos buques para lograr la salida de la misma célula, o aumentar la producción de células sin la adición de las personas, suites para salas blancas, o incubadoras. El sistema se produce con métodos de bajo de partículas de montaje y sin el uso de adhesivos. Se trata de un sistema cerrado que es confeccionado con juegos de tubos y filtros, triple bolsa y siempre estériles.

Disclosures

El buque HyperStack permeables a los gases de tecnología está cubierta por la Patente de EE.UU. #: 7745209. Los autores son empleados de Corning Life Sciences, Inc, que produce el instrumento utilizado en este artículo.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Lonza Walkersville por su ayuda con el conocimiento del sistema cerrado, diseño de la bolsa, el préstamo de selladores de bolsa y soldadores, así como la creación de la bolsa a los esquemas HyperStack.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	1350ml media + 150ml serum (if required)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml media + 400ml serum (if required)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	Lonza Inc.	TBD