Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

Summary

Une introduction à la technologie, le protocole et la manutention des navires HyperStack Corning et accessoires utilisés pour le rendement élevé de culture de cellules adhérentes. Le protocole va montrer comment utiliser le système fermé des navires pour la récolte de cellules augmente plus les produits actuels plaques empilées.

Abstract

Grand volume de culture de cellules adhérentes est actuellement standardisées sur les produits plaques empilées croissance cellulaire lorsqu'ils ne sont pas des perles microporteur un choix optimal. Vaisseaux HyperStack permettent échelle du système fermé à partir des produits actuels plaques empilées et offre> 2.5X plus de cellules dans le bilan volumétrique même. Les navires HyperStack fonction via matériau perméable au gaz qui permet l'échange de gaz de se produire, éliminant ainsi le besoin d'espace libre interne au sein d'un navire. L'élimination de l'espace libre permet le compartiment où la croissance des cellules se produit à minimiser afin de réduire l'espace, permettant ainsi de plusieurs couches de surface de croissance des cellules dans l'empreinte volumétrique même.

Pour de nombreuses applications telles que la thérapie cellulaire ou la production de vaccins, un système fermé est nécessaire pour la croissance cellulaire et la récolte. Le navire HyperStack permet l'ajout de cellules et de réactifs et la suppression via un tube à partir de sacs médias ou d'autres méthodes.

Ce protocole sera d'expliquer la technologie derrière le matériel perméables aux gaz utilisés dans les vaisseaux HyperStack, les résultats de diffusion des gaz pour satisfaire les besoins métaboliques des cellules, fermées protocoles du système de la croissance cellulaire, et les méthodes de récolte différentes.

Protocol

1. Navire HyperStack - Gaz de fond la technologie des matériaux perméables

1. Le navire est un navire HyperStack multicouche pour la culture système fermé de cellules qui s'appuie sur les échanges gazeux à travers un film 76.2micron perméables aux gaz de polymères pour le métabolisme cellulaire.
2. Le navire HyperStack diffère de plus traditionnel des récipients de culture cellulaire en ce qu'elle n'a pas un "espace libre" au-dessus des cellules à l'intérieur du navire. Plutôt que de contenant cette "headspace" pour l'échange de gaz dans la cuve, les produits perméables aux gaz ont des espaces d'air (appelée «la trachée" espaces) sous chaque chambre de culture qui est ouvert à l'atmosphère.
3. Cet espace permet aux cellules trachéales croissante dans chaque compartiment de culture cellulaire du navire d'avoir un échange de gaz équivalent.
4. Le film de gaz perméable permet les échanges gazeux de se produire tout en préservant un environnement stérile. Toutes les manipulations des fluides pour chacune des couches multiples se produisent à travers un port d'entrée unique.

2. Résumé HyperStack Component navire

1. Le Stackette est le compartiment des cellules individuelles de la culture qui est constitué de la plaque supérieure et le film perméable au gaz. Les cellules sont cultivées dans ce compartiment.
2. Le collecteur de liquide relie chacune des 12 couches stackette ensemble au sein d'un module HyperStack. Les modules sont connectés avec des tubes pour former des vaisseaux dans les couches multiples de 12. Le collecteur permet à l'utilisateur de faire une manipulation fluide à l'ensemble du navire.
3. Le collecteur d'air relie également les couches stackette ensemble, mais elle sert à déplacer l'air à partir du navire lorsque des ajouts d'huile se produisent. Il contient une ligne de remplissage à utiliser pendant le remplissage.
4. L'espace trachéale est l'espace en plein air entre chaque couche stackette, permettant les échanges gazeux de se produire à travers le cinéma perméables aux gaz de chaque couches.
5. Le tube de manipulation liquide est reliée au collecteur de liquide et est utilisé pour faire toutes les manipulations fermée fluide du système. Ce composant peut être personnalisée.
6. Le tube d'évent est relié au collecteur d'air, contient un filtre à air, et est utilisée pour libérer l'excès d'air tout en préservant la stérilité.
7. Le tube Chase a un filtre et la pince et sont reliés à la tubulure de manipulation de liquides et sont utilisées pour évacuer le liquide de la tubulure de manipulation de liquides après remplissage de la cuve.
8. Le Manipulateur Stack Corning ou CSM est un dispositif de manutention pour faciliter le chargement des navires dans les positions correctes pendant l'utilisation.
9. Le coin de remplissage est en acier inoxydable d'aider utilisé lorsque remplissage manuel des vaisseaux HyperStack.

3. Résultats Diffusion du gaz à travers du film de gaz perméable utilisée dans les récipients HyperStack

1. Dans les systèmes traditionnels de la croissance cellulaire avec headspace ventilé, de l'oxygène dans les médias est appauvri une moyenne de 50% sur 3 jours de culture. (Figure 1)
2. Dans le système de la croissance des cellules mêmes, le gradient d'oxygène dans une hauteur de 3mm de médias est presque 50% supérieur à la presse à la jonction headspace que c'est à la couche de cellules. (Figure 2)
3. La diffusion de l'oxygène à travers le film de gaz 76.2micron polystyrène perméable est égale à la diffusion à travers des médias 2.6mm. Le film perméables aux gaz utilisés dans les vaisseaux HyperStack permet l'échange de gaz se produire à la couche de cellules.
4. Le% d'oxygène dans l'espace trachéal des vaisseaux HyperStack reste constant que les cellules se développent au point de confluence. (Figure 3)

4. Préparation sac médias

1. Le navire HyperStack-couche 12 prend 1.3L de médias et de l'HyperStack-36 navires couche prend 3.9L de médias.
2. Avant d'inoculer vos médias ensachées, si le sérum doit être utilisé, tube à souder le sac de sérum dans le sac des médias et bien mélanger.
3. Pince off environ 300 mL de médias dans le sac de l'aide de colliers grand sac. Cela permettra d'assurer toutes les cellules inoculées sont utilisés pendant le remplissage et aucun n'est restant dans le sac des médias. Placez les médias sac sur le stand de sac.

5. Médias inoculation

1. Remplir une seringue avec des tubes attachés avec une suspension cellulaire. Tube à souder 3 / 16 "tube d'une seringue contenant la suspension cellulaire dans le sac des médias.
2. Injecter la suspension cellulaire dans le sac avec les médias et bien mélanger.

6. Remplissez la procédure

1. Tube à souder le sac inoculé des médias à 3 / 8 "tube de manipulation de liquides. Navire HyperStack (en utilisant stérile se connecte ou se connecte polyvalent (PPM), vous pouvez aussi attacher le sac des médias à la cuve).
2. Fermer les pinces sur la manipulation des liquides et des tubes sur la chasse HyperStack.
3. Placer le récipient HyperStack couche 36 dans le CSM dans la position de la charge; accrocher le tube d'évent filtre dans la pince de fixation sur le CSM. Serrez le couvercle et placez le CSM à la position de remplissage. En mettant le bateau dans la bonne position de remplir, le filtre à air est maintenant dans la position la plus élevée pour empêcher mouillage pendant le fonctionnement de remplissage. L'angle de 10 ° permet equilibrtion du liquide dans les couches lors du remplissage. Le navire couche HyperStack-12 placé sur le côté sur le coin de remplissage est dans la position correcte pour le remplissage.
4. Air pur de la ligne de remplissage par le positionnement du sac au même niveau que le navire HyperStack (non plus). Garder la bride du tube chasse fermée; ouvrir la pince de manipulation de liquides du tube et la pince sac de médias pour permettre au fluide d'entrer dans le navire.
5. Utilisation du support sac, soulever le sac des médias pour aider à l'écoulement de suspension de cellules dans le vaisseau.
6. Remplissez la cuve jusqu'à ce que l'ensemble des milieux inoculés entre dans le bateau, le 300 ml de support doit toujours rester dans la partie supérieure du sac médias. Retirer le collier du sac des médias de continuer à remplir la cuve. Comme liquide s'approche du collecteur d'air supérieur, de ralentir le taux de remplissage en abaissant le sac des médias afin d'éviter de trop remplir. Porter lentement le niveau du liquide à la ligne de remplissage et de serrer le tube de manipulation de liquides.

7. Procédure d'isolement de l'écluse de liquide dans les couches

1. Amener le navire HyperStack dans le CSM à la position de l'isolement afin que les deux ensembles de collecteurs sont dans la position la plus élevée et inférieure du sac des médias en dessous de la hauteur du récipient. Le navire HyperStack-12 couche peut être soulevé dans la position d'isolement en plaçant une main sur le côté du navire et en utilisant l'autre pour soulever le coin de remplissage.
2. Avec le filtre course tenue à une position verticale, ouvrez la bride du tube chasse. Ce sera vide ou chasser les médias dans le tube de manipulation de liquides dans le sac des médias. Une fois que le tube est vide, fermer la pince sur le tube sac de médias.
3. Garder le filtre du tube chasse dans une position verticale, ouvrir la pince sur le tube de manipulation liquides sur l'HyperStack pour permettre à tout le liquide restant d'entrer et de s'équilibrer dans la cuve. Attendre 1-2 minutes pour que cela se produise.
4. Faire tourner le bateau HyperStack dans le CSM afin que les collecteurs sont sur la gauche. Abaissez le navire à la position de la charge sur le CSM. Rocking l'HYPEStack-12 navires couche légèrement vers la gauche, permettre l'enlèvement de la cale de remplissage. Fermer les pinces sur les deux tubes de la chasse et la manipulation de liquides.
5. Le sac des médias peuvent maintenant être retiré de la cuve ou il peut rester attaché pour une utilisation ultérieure dans la procédure de récolte. Pour stocker le sac attaché médias, rouler le sac vide et tout support restant dans le sac, et les placer sous les bandes de retenue dans le plateau de stockage du navire HyperStack.
6. Déplacer le navire HyperStack à l'incubateur. Lors de la prise en charge des navires doivent être prises pour empêcher le liquide de pénétrer dans le filtre d'aération. Ceci est accompli par la fin de basculement multiple de la HyperStack légèrement vers le haut.

8. Protocole de récolte

1. Pour commencer la procédure de récolte, tube à souder la solution la dissociation cellulaire et sacs étancher ensemble pour former l'ensemble de sac de récolte. S'assurer que tous les colliers de tuyau sont fermées. (Utilisez bande dessinée pour montrer)
2. Retirer des navires HyperStack de l'incubateur, la libération du sac des médias sous les bandes de soutènement, et accrocher sur le stand sac. Placer le récipient dans le CSM dans la position de la charge et serrer le couvercle pour sécuriser le bateau. Accrocher le tuyau d'aération dans la pince de fixation et déplacer le CSM à la position de remplissage.
3. S'assurer que le sac des médias sur le stand sac est suspendu inférieur au HyperStack; ouvrir la pince sur le tube sac de médias et de tubes du navire de manipulation de liquides pour permettre aux médias de couler dans le sac attaché.
4. Une fois que le navire est d'environ ¾ vide, modifier les paramètres du CSM à la position finale vides. Lorsque le navire HyperStack et tubes de manipulation de liquides sont vides, soulevez le tube pour chasser les médias après la pince sur le tube sac de médias passé, puis fermez la fois la pince sur le tube de manipulation de liquides et de la pince sur le tube sac de médias passé.
5. Remplacer le sac passé médias avec l'ensemble de sac de récolte par soudage de tubes et augmenter la hauteur de l'assemblée sac de dissociation cellulaire dessus de la hauteur de l'HyperStack l'aide du support sac.
6. Placez le CSM dans la position d'équilibration. Ouvrir le tube solution de dissociation cellulaire pince et le transfert de la solution dans la HyperStack. Lorsque le transfert est terminé, fermer les pinces sur le tube de manipulation de liquides et de la tuyauterie solution de dissociation cellulaire.
7. Apportez CSM à la position de chargement. En tenant le levier de positionnement horizontale ouverte, secouez légèrement le côté bateau à côté en utilisant la roue, la distribution de la solution sur les couches de cellules. Le navire peut parfois être retourné à la position d'équilibration au cours bascule à maintenir une répartition égale de la solution. Il peut ne pas être visuellement évident que les couches sont complètement couché, mais la solution de dissociation sera également répartie sur toute la surface des cellules. Une fois la solution a été convenablement réparties, relâchez le levier sur le CSM pour verrouiller le HyperStack en position de chargement. Laissez le HyperStack dans cette positionpendant le temps nécessaire dissociation pour vos cellules.
8. Une fois que les cellules se sont détachées; utilisant la turbidité comme un guide, déplacez le CSM à la position de l'équilibration. Il faut prendre soin de ne pas trop assimiler les cellules. Ouvrir la pince sac de trempe et le liquide de manipulation HyperStack pince tube pour permettre aux médias d'entrer étancher le navire. Fermez la pince sur le tube HyperStack la manipulation de liquides lorsque le transfert est terminé.
9. Retour au CSM de la position de charge et maintenir le levier de positionnement horizontal au rock le côté bateau à côté.
10. Utilisation du support sac, abaisser la position de l'assemblée sac de récolte en dessous du niveau de l'HyperStack. Réglez le CSM à la position vide, ouvrez le tube de manutention des navires de liquide pince et transférer la solution de cellules dans le sac étancher. Retour au CSM de la position de chargement et de déconnecter l'ensemble de sac de récolte de la cuve en utilisant un scellant le tube. La solution la cellule est prête pour la transformation.

9. Les résultats représentatifs

• La récolte de temps doit être optimisé lors de la conversion d'une surface de polystyrène standard à la surface de polystyrène perméable au gaz. Les cellules ont tendance à libérer plus rapidement sur le produit HyperStack.
• Pour visualiser les cellules sous un microscope le tube d'aération et de manipulation de liquide doit être serré au large. Placer le récipient HyperStack tête en bas, avec les collecteurs pointant vers le bas, sur la platine du microscope.
• Mesures de prévention peuvent être prises pour éviter de mouiller les filtres lors de l'utilisation qui sera amener à cesser de fonctionner. En ne plus remplir la cuve HyperStack et en gardant l'évent et le tube chasse élevés lorsque les pinces sont ouvertes, aucune humidification devrait se produire.
• La pression des pinces fermées sur le tube provoque de rester fermée après les pinces sont ouvertes. Pincer le tuyau dans la direction opposée de l'ouvrir.
• Temps d'écoulement des médias entrant et sortant du navire HyperStack via l'alimentation par gravité est basé sur la différence de hauteur entre le support de haut niveau des médias dans la cuve HyperStack et le niveau supérieur des médias dans le récipient médias. La plus grande distance, plus le débit. Le débit maximal est limité par la notation des filtres pour 1.5L/min.
• Maintenir bon volume de remplissage de la cuve HyperStack permettra d'éviter la formation de bulles d'air dans les chambres à la croissance cellulaire. Les bulles d'air peuvent se produire en raison de l'échantillonnage ou en incubation dans un environnement unhumidified due à la perte d'eau par évaporation. Le montant et la fréquence d'échantillonnage ainsi que les conditions d'incubation va déterminer si le liquide supplémentaires devraient être ajoutés par l'utilisateur final.

Figure 1. Appauvrissement en oxygène des médias dans un récipient de culture cellulaire standard. La figure montre la diminution en mg / L d'oxygène au niveau des cellules sur 3 jours.

Figure 2. Gradient d'oxygène dans les médias dans un récipient de culture cellulaire standard. La figure montre l'mg / L d'oxygène est plus grande au média à l'intersection headspace qu'à la couche de cellules.

Figure 3. Pourcentage d'oxygène dans l'espace trachéale de l'HyperStack pendant la croissance cellulaire. La figure montre que plus de 96 heures, le pourcentage d'oxygène entre les couches, qui fournit chaque fond films perméables aux gaz, reste constante. Ceci démontre la capacité des cellules à l'accès d'oxygène pendant la croissance jusqu'à la confluence.

Discussion

Navire HyperStack a cultivé avec succès d'ingénierie, des cellules primaires et des souches. Ajouts de liquide dans la cuve ont été menées via des connexions sac aseptique par alimentation par gravité et par pompage à partir d'un contenant stérile médias. Le navire prévoit une augmentation supérieure à la croissance dans la zone de 2.5X contre un produit de plaques empilées le même encombrement volumétrique. Le HyperStack-12 a 6000 secteur de croissance cm ^2, la HyperStack-36 a 18000 secteur de croissance cm ^2, et le HyperStack-120 a 60 000 cm ² de surface de croissance. En augmentant la surface, les utilisateurs sont capables de produire plus de cellules provenant de la même population cellulaire ou un lot et de réduire la variabilité. Ils sont également capables d'économiser de l'espace et / ou de travail en utilisant moins de bateaux pour atteindre la sortie même cellule, ou d'augmenter la production de cellules sans ajout de personnes, des suites de salle blanche, ou les incubateurs. Le système est produit avec des méthodes d'assemblage des particules faibles et sans l'utilisation d'adhésifs. C'est un système fermé qui est prémonté avec des ensembles de tubes et les filtres, triple ensachés et fournis stériles.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	1350ml media + 150ml serum (if required)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml media + 400ml serum (if required)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	Lonza Inc.	TBD