Slutet system Cell Culture protokoll Använda HyperStack Fartyg med gas genomsläppligt material Technology

Summary

En introduktion till teknik, protokoll och hantering av Corning HyperStack Fartyg och tillbehör som används för hög avkastning anhängare cellkultur. Protokollet kommer att visa hur man använder det slutna systemet fartyg för att öka cell skörd under innevarande staplade plåtprodukter.

Abstract

Stor volym anhängare cellkultur är för närvarande standardiserat på staplade epifysplattan cell produkter när microcarrier pärlor är inte ett optimalt val. HyperStack fartyg tillåter slutet system skala upp från staplade nuvarande plåtprodukter och ger> 2,5 gånger fler celler i samma volymetriska fotavtryck. Den HyperStack fartyg funktion via gas genomsläppligt material som tillåter gasutbyte att inträffa, vilket eliminerar därför behovet av intern headspace inom ett fartyg. Elimineringen av headspace låter det utrymme där celltillväxt sker ska minimeras för att minska utrymmet, vilket flera skikt av celltillväxt yta inom samma volymetriska fotavtryck.

För många applikationer såsom cellterapi eller vaccintillverkning, är ett slutet system som krävs för celltillväxt och skörd. Den HyperStack Fartyget kan cell och reagens addition och borttagning via slangar från media väskor eller andra metoder.

Detta protokoll kommer att förklara tekniken bakom den gas genomsläppliga material som används i HyperStack fartyg, gasdiffusion resultat för att möta de metaboliska behov av celler, slutet system celler protokoll tillväxten, och olika metoder skörd.

Protocol

1. HyperStack fartyg - Gas genomsläppligt material Teknik Bakgrund

1. Den HyperStack Fartyget är ett mångbottnat fartyg för slutna system odling av celler som är beroende av gasutbytet genom ett 76.2micron gas permeabla polymerfilm för cellulära metabolism.
2. Den HyperStack fartyg skiljer sig från mer traditionella fartyg cellkultur genom att den inte har en "headspace" ovanför celler inuti fartyget. I stället innehåller denna "headspace" för gas utbyte inom fartyget, gas genomsläppliga produkter har luftvolymer (kallad "endotrakeal" mellanslag) under varje kultur kammare som är öppen till atmosfären.
3. Detta luftrör utrymme gör att cellerna växer i varje cell kultur fack av fartyget har motsvarande gas utbyte.
4. Gasen genomsläppliga Filmen låter gasutbyte att inträffa samtidigt som en steril miljö. Alla vätska manipulationer för varje flera lager sker genom en enda ingång port.

2. HyperStack Vessel Component Summary

1. Det Stackette är den enskilda cellen kulturen facket som utgörs av den övre plattan och gas genomsläppliga film. Cellerna odlas inom detta fack.
2. Liquid Manifold kopplar varje 12 stackette lagren tillsammans inom en HyperStack modul. Moduler är anslutna med slang för att bilda fartyg i multiplar av 12 lager. Fördelaren tillåter användaren att göra en vätska manipulation till hela fartyget.
3. Air Manifold ansluter också stackette lagren tillsammans, men det används för att tränga undan luften från fartyget när vätskan tillägg förekomma. Den innehåller en fyllning linje för användning vid fyllning.
4. Den Trakealtuber Rymden är det fria utrymmet mellan varje stackette lager, vilket gör att gasutbyte ske genom varje lager "gas genomsläppliga film.
5. Liquid hantering av slang är ansluten till den flytande grenröret och används för att göra alla stängda manipulationer systemet vätska. Denna komponent kan anpassas.
6. Den Vent slangen är ansluten till luften grenrör, innehåller ett luftfilter, och används för att frigöra luftöverskott bibehållen sterilitet.
7. Jakten slangen har ett filter och klämma och är anslutna till vätskehantering slang och används för att evakuera vätska från vätskehantering slangen efter fyllning av fartyget.
8. Den Corning Stack Manipulator eller CSM är en lyftanordning för att hjälpa till att placera kärl i rätt positioner under användning.
9. Fyllningen Wedge är en rostfri hjälpa användas vid manuell fyllning av HyperStack fartyg.

3. Gasdiffusion Resultat Genom gas permeable film som används i HyperStack Fartyg

1. I traditionella system celltillväxt med ventilerade headspace är syret i media utarmat i genomsnitt 50% under 3 dagar i kulturen. (Figur 1)
2. I samma celltillväxt systemet är syret gradient i en 3 mm höjd media nästan 50% större i media att headspace korsning än det är på cell-lager. (Figur 2)
3. Spridning av syre genom 76.2micron gas permeabla polystyren film är lika med diffusion genom 2,6 mm av media. Gasen genomsläppliga film som används i HyperStack fartyg tillåter gasutbyte ske i cellager.
4. I% av syre i luftstrupen utrymme på HyperStack fartyg förblir konstant som celler växer till sammanflödet. (Figur 3)

4. Media Bag Förberedelser

1. Den HyperStack-12 lagers fartyg tar 1.3L av media och HyperStack-36 lagers fartyg tar 3.9L av media.
2. Innan ympa dina säckar media, om serum ska användas, rör svetsa serumet påsen till media påsen och blanda väl.
3. Kläm ut cirka 300 ml av media i påsen med stor väska klämmor. Detta kommer att säkerställa alla inympade celler används vid fyllning och ingen är kvar i media påsen. Placera media väska på väskan står.

5. Ympa Media

1. Fyll en spruta med slang fäst med cellsuspension. Rör svetsa 3 / 16 "slang från en spruta med cellsuspension till media påsen.
2. Injicera cellsuspension i media Bag och blanda väl.

6. Fyll Förfarande

1. Rör svetsa inokulerade medierna påsen till HyperStack fartygets 3 / 8 "vätskehantering slang. (Med steril Ansluter eller Multipurpose ansluter (Medelhavsländerna), kan du även bifoga media väska till fartyget).
2. Stäng klämmorna på vätskehantering och jaga tuber på HyperStack.
3. Placera HyperStack 36 lager Vessel i CSM i lastens läge, krok ventilen filtret röret i hållklämma på CSM. Dra åt locket och flytta CSM till fylla positionen. Genom att sätta fartyget i rätt fylla position, luftfiltret är nu i högsta läge för att förhindra att väta under fylla drift. De 10 graders vinkel möjliggör equilibrring av vätskan till lagren vid fyllning. Den HyperStack-12 skikt fartyg som har ställts på sin sida på att fylla wedge är i rätt position för att fylla.
4. Rensa luften från fyllningen linje genom att placera väskan på samma nivå som den HyperStack fartyget (inte högre). Att hålla jakten slanghållare stängd, öppna den flytande klämman hantering röret och media påsen klämman så att vätskan att komma in i fartyget.
5. Använda påsen stå, höja media påsen för att hjälpa flödet cellsuspension i kärlet.
6. Fyll kärlet tills alla inokulerade medierna kommer in i fartyget, den 300 ml medier bör fortfarande kvar i den övre delen av medierna påsen. Ta bort klämman från media påsen för att fortsätta fylla på fartyget. Som likvida närmar sig övre luften grenrör, bromsa fyllnadsgrad genom att sänka media påsen för att förhindra över fyllningen. Sakta låt vätskan nivå för att fyllningen linjen och klämma vätskehantering slangen.

7. Isoleringsförfarande till Lock vätska i lager

1. Ta HyperStack fartyg i CSM till isolering position så båda uppsättningarna av grenrör är i högsta läget och sänk media påsen nedanför höjden på fartyget. Den HyperStack-12 skikt fartyg kan lyftas in i isoleringen position genom att placera en hand på sidan av fartyget och använda den andra för att lyfta fyllningen kilen.
2. Med jakten filtret hålls i upprätt läge, öppna jakten slanghållare. Detta kommer tom eller jaga media i vätskehantering röret tillbaka in i medierna påsen. När slangen är tom, stäng klämman på media påsen slangen.
3. Att hålla jakten röret filtret i en upprätt position, öppna klämman på vätskehantering slangen på HyperStack att eventuella kvarvarande vätska att komma in och balansera i fartyget. Vänta 1-2 minuter för att detta ska inträffa.
4. Vrid HyperStack fartyget i CSM så att fördelare till vänster. Sänk fartyget till lasten position på CSM. Rocking den HYPEStack-12 lager fartyg något till vänster kommer att möjliggöra undanröjande av fyllningen kilen. Stäng klämmorna på både jakt-och vätskehantering slangen.
5. Medierna väskan kan nu avlägsnas från fartyget eller det kan sitta kvar för att användas senare under skörden förfarande. För att lagra bifogade media påsen, rulla den tomma påsen och kvarvarande media i påsen och placera under behålla banden i avställningsplats av HyperStack fartyget.
6. Flytta HyperStack fartyget till inkubatorn. När du bär fartyget försiktighet bör iakttas för att hålla vätska tränger in i filtret luftventilen. Detta sker genom att tippa den mångfaldiga slutet av HyperStack något uppåt.

8. Harvest Protokoll

1. Till att börja skörden förfarande, slang svetsa cellen dissociation lösningen och påsar släcka samman för att bilda skörd väskan montering. Se till att alla slangar klämmor är stängda. (Använd tecknade att visa)
2. Ta bort HyperStack fartyg från inkubatorn, släpp media påsen från under behålla banden, och hänga på påsen står. Placera fartyget i CSM i lastens läge och dra åt locket för att säkra fartyget. Haka vent slang in i hållklämma och flytta CSM till fylla positionen.
3. Att se medierna påsen på påsen står hänger lägre än den HyperStack, öppna klämman på media påsen slangar och fartygets vätskehantering slang så att media kan flöda in den bifogade påsen.
4. När fartyget är cirka ¾ tomt, ändra CSM inställningarna till den sista tomma positionen. När HyperStack fartyget och vätskehantering slangar är tomma, lyfta slangen att jaga media förbi klämman på det använda media påsen slangar, stäng sedan både klämman på vätskehantering slang och klämma på det använda media påsen slang.
5. Byt ut det använda medierna påsen med skörd påsen montering av slang svetsning och öka höjden på cellen dissociation påsen montering ovanför höjd HyperStack använda påsen står.
6. Placera CSM i jämvikt läge. Öppna cellen dissociation lösningen slanghållare och överför lösningen i HyperStack. När överföringen är klar stänger klämmor på vätskehantering slang och cellen dissociation lösningen slang.
7. Ta CSM till lastens läge. Genom att hålla den horisontella öppna positionering spaken, skaka på fartyget i sidled med hjälp av hjulet, distribuera lösningen över cellen lager. Fartyget kan ibland vara tillbaka till jämvikt position under gunga för att bibehålla en jämn fördelning av lösningen. Det kanske inte är synliga för blotta ögat att lagren är helt belagd, men dissociation lösningen kommer att vara lika fördelad över ytan av cellerna. När lösningen har tillräckligt ut, släpp spaken på CSM att låsa HyperStack i lasten läge. Lämna HyperStack i detta lägeunder den föreskrivna dissociation tid för dina celler.
8. När cellerna har lossnat, med hjälp av grumlighet som guide, flytta CSM till jämvikt position. Försiktighet bör iakttas inte över smälta celler. Öppna släcka påsen klämman och HyperStack vätskehantering slang klämman så att släcka media att komma in i fartyget. Stäng klämman på HyperStack vätskehantering slang när överföringen är klar.
9. Returnera CSM till lastens läge och håll den horisontella placeringen spaken till rock fartyget sida till sida.
10. Med hjälp av väskan står, sänka placeringen av skörden påsen församlingen under nivån för de HyperStack. Justera CSM till den tomma plats, öppna fartyget vätskehantering slanghållare och överför cellen lösningen tillbaka in i släcka påsen. Returnera CSM till lastens läge och koppla ur församlingen skörden påsen från fartyget med hjälp av en slang sealer. Cellen lösningen är färdig för bearbetning.

9. Representativa resultat

• Skörden måste optimeras vid konvertering från en vanlig polystyren yta till gas genomsläppliga polystyren yta. Celler har en tendens att släppa snabbare på HyperStack produkten.
• För att se celler i mikroskop ventilen och vätskehantering slang måste spännas av. Placera HyperStack fartyget upp och ner, med grenrör nedåt på mikroskop scenen.
• Förebyggande åtgärder kan vidtas för att undvika blöta filtren under användning som kommer att få dem att sluta fungera. Genom att inte över att fylla HyperStack fartyget och hålla ventilen och jaga slang förhöjda när klämmor är öppna, bör ingen vätning inträffa.
• Trycket på den slutna klämmorna på slangen gör att den fortfarande stängda efter klämmorna öppnas. Klämmande slangen i motsatt riktning kommer att öppna den.
• Media flödestid ingående och uppsägning av HyperStack fartyget genom självtryck är baserad på mediernas höjdskillnaden mellan den högsta nivån av media i HyperStack fartyget och den högsta nivån av media i media behållaren. Ju större avstånd, desto snabbare flödet. Det maximala flödet begränsas av rating filtren för att 1.5L/min.
• Att upprätthålla god fyll volym i HyperStack fartyget kommer att förhindra bildning luftbubbla i kamrarna celltillväxt. Luftbubblor kan uppstå på grund av provtagning eller inkubera i en unhumidified miljön på grund av avdunstning vatten förlust. Provtagningen belopp och frekvens samt inkubationsförhållanden kommer att avgöra om ytterligare vätska bör läggas av slutanvändaren.

Figur 1. Syrebrist av media i en standard cellkultur fartyg. Figuren visar minskningen i mg / L av syre i nivå med de celler under 3 dagar.

Figur 2. Syre gradient i media i en vanlig cell kultur fartyg. Figuren visar mg / L Syre är störst i media att headspace korsningen än vid cellager.

Figur 3. Procent syre i den trakeal utrymme på HyperStack under celltillväxt. Figuren visar att över 96 timmar är den andel av syre mellan skikten, som levererar varje gas permeabla film botten, konstant. Detta visar på cellernas förmåga att få tillgång till syre under tillväxt confluency.

Discussion

HyperStack fartyg har framgångsrikt vuxit konstruerad, grundskola och stamceller. Fluid tillägg till fartyget har genomförts via aseptisk väska anslutningar av tyngdkraften foder och även genom pumpning från en steril media container. Fartyget erbjuder en större än 2,5 X ökning tillväxtområde kontra en staplade tallrik produkt av samma volymetriska fotavtryck. Den HyperStack-12 har 6000 cm ² tillväxtområde, den HyperStack-36 har 18 tusen cm ² tillväxtområde och HyperStack-120 har 60 tusen cm ² tillväxtområde. Genom att öka ytan, användare har möjlighet att producera fler celler från samma cell population eller mycket och minska variationen. De kan också spara utrymme och / eller arbete genom att använda färre fartyg för att uppnå samma cell utgång, eller öka cellens produktion utan att lägga till folk, sviter renrum eller inkubatorer. Systemet är producerade med låga metoder partiklar montering och utan användning av lim. Det är ett slutet system som är förmonterad med slang-apparater och filter, tredubbla påsar och levereras sterila.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	1350ml media + 150ml serum (if required)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml media + 400ml serum (if required)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	Lonza Inc.	TBD