Summary
Una introduzione nel protocollo tecnologia, e la gestione dei Vasi HyperStack Corning e accessori utilizzati per l'alta cultura resa cellule aderenti. Il protocollo mostrerà come utilizzare i vasi sistema chiuso per la raccolta delle cellule aumentando rispetto agli attuali prodotti di Piastra impilati.
Abstract
Grandi colture di cellule aderenti del volume è attualmente standardizzate sui prodotti cartilagine di accrescimento delle cellule impilate quando perline microcarrier non sono una scelta ottimale. Vasi HyperStack permettono scala sistema chiuso a partire dai prodotti attuali piastra impilati e fornisce> 2,5 volte più cellule nel ingombro volumetrico stesso. I vasi HyperStack funzione di tramite materiale permeabile ai gas, che consente lo scambio di gas si verifichi, eliminando quindi la necessità di spazio di testa interna all'interno di una nave. L'eliminazione di spazio di testa permette il vano in cui la crescita delle cellule avviene per essere minimizzato per ridurre lo spazio, permettendo più strati di superficie crescita cellulare all'interno della stesso ingombro volumetrico.
Per molte applicazioni, come la terapia cellulare o di produzione di vaccini, un sistema chiuso è necessario per la crescita cellulare e la raccolta. La nave HyperStack consente inoltre di cellule e reagenti e la rimozione mediante sonda dai sacchetti media o altri metodi.
Questo protocollo spiegherà la tecnologia alla base del materiale permeabile ai gas utilizzati nei vasi HyperStack, i risultati diffusione del gas per soddisfare le esigenze metaboliche di cellule, sistema chiuso protocolli di crescita cellulare, e diversi metodi di raccolta.
Protocol
1. HyperStack nave - gas permeabili Background Material Technology
- La nave è una nave HyperStack multistrato per la coltura di cellule del sistema chiuso che si basa sullo scambio di gas attraverso un film di gas 76.2micron permeabile polimero per il metabolismo cellulare.
- La nave HyperStack differisce dai vasi delle cellule più tradizionali della cultura, nel senso che non ha una "spazio di testa" al di sopra delle celle all'interno della nave. Piuttosto che contiene questo "spazio di testa" per lo scambio di gas all'interno della nave, i prodotti del gas permeabili sono spazi aerei (di seguito "tracheale" spazi) sotto ogni camera di cultura che è aperto verso l'atmosfera.
- Questo spazio tracheale permette alle cellule in crescita in ogni comparto coltura cellulare della nave per avere scambi di gas equivalente.
- Il film di gas permeabile permette lo scambio di gas si verifichi, pur mantenendo un ambiente sterile. Tutte le manipolazioni di liquidi per ciascuno degli strati più avvenire attraverso una porta singola voce.
2. HyperStack nave Component Summary
- Il Stackette è l'individuo vano di coltura cellulare che si compone della piastra superiore e la pellicola di gas permeabili. Le cellule sono coltivate all'interno di questo comparto.
- Il collettore liquido collega ciascuno dei 12 strati stackette insieme all'interno di un modulo HyperStack. I moduli sono collegati con tubi a formare vasi in multipli di 12 strati. Il collettore permette all'utente di fare una manipolazione di liquidi per l'intero vaso.
- Il collettore Air collega anche gli strati stackette insieme, ma è usato per spostare l'aria dalla nave quando si verificano le aggiunte di liquidi. Esso contiene una linea di riempimento per l'utilizzo durante il riempimento.
- Lo spazio tracheale è lo spazio all'aperto tra ogni strato stackette, permettendo lo scambio di gas si verifichi attraverso il cinema gas permeabili ogni layer '.
- Il tubo di manipolazione dei liquidi è collegato al collettore liquido e viene usato per fare tutto chiuso manipolazioni fluido sistema. Questo componente può essere personalizzato.
- Il tubo di sfiato è collegato al collettore dell'aria, contiene un filtro dell'aria, ed è utilizzato per rilasciare l'aria in eccesso mantenendo la sterilità.
- Il tubo caccia dispone di un filtro e morsetto e sono collegati al tubo di gestione dei liquidi e vengono utilizzati per evacuare il fluido dal tubo di gestione dei liquidi dopo il riempimento della nave.
- Il manipolatore Stack Corning o CSM è un dispositivo di gestione per aiutare a collocare i vasi nelle posizioni corrette durante l'uso.
- Il cuneo di riempimento è un acciaio inossidabile assistere utilizzato quando compilare manualmente i vasi HyperStack.
3. Diffusione risultati di gas attraverso film permeabile ai gas usato nei vasi HyperStack
- Nei sistemi tradizionali la crescita cellulare con spazio di testa ventilati, l'ossigeno nei media è impoverito una media del 50% nell'arco di 3 giorni in coltura. (Figura 1)
- Nello stesso sistema crescita cellulare, il gradiente di ossigeno in un altezza di 3 mm di media è quasi il 50% maggiore alla media per spazio di testa all'incrocio di quanto lo sia a livello cellulare. (Figura 2)
- La diffusione di ossigeno attraverso il film di polistirene 76.2micron gas permeabili è uguale alla diffusione attraverso i media di 2,6 millimetri. La pellicola permeabile ai gas utilizzati nei vasi HyperStack permette lo scambio di gas si verifichi a livello cellulare.
- La% di ossigeno nello spazio tracheale dei vasi HyperStack rimane costante, come le cellule crescono a confluenza. (Figura 3)
4. Borsa media Preparazione
- I-12 HyperStack nave strato prende 1.3L dei media e il HyperStack-36 nave strato prende 3.9l dei media.
- Prima di inoculare il supporto insaccato, se i livelli sierici deve essere utilizzato, tubo di saldare il sacchetto siero alla borsa media e mescolare accuratamente.
- Morsetto fuori circa 300 ml di mezzi di comunicazione nella busta utilizzando fascette grossa borsa. Questo garantirà tutte le cellule inoculate vengono utilizzati durante il riempimento e nessuno è ancora nel sacchetto dei media. Luogo borsa multimediale su supporto borsa.
5. Media inoculando
- Riempire una siringa con un tubo attaccato con sospensione cellulare. Tubo di saldatura "tubo 3 / 16 da una siringa contenente sospensione cellulare alla borsa media.
- Iniettare la sospensione cellulare in Borsa Media e mescolare bene.
6. Compila procedura
- Tubo di saldare il sacchetto inoculati media della nave HyperStack di 3 / 8 "tubing manipolazione dei liquidi. (Utilizzando sterili collega o collega Multipurpose (PPM), è possibile anche allegare la borsa media per nave).
- Chiudere i morsetti sulla gestione dei liquidi e tubi inseguire sul HyperStack.
- Posizionare i 36 Vessel strato HyperStack nel CSM in posizione di carico; agganciare il tubo di sfiato del filtro nel morsetto tenendosi il CSM. Serrare il coperchio e spostare il CSM in posizione di riempimento. Mettendo la nave nella posizione corretta riempimento, il filtro dell'aria è ora in posizione più alta per evitare bagnare durante il funzionamento di riempimento. L'angolo di 10 ° permette equilibrzione del liquido negli strati durante il riempimento. Il HyperStack-12 nave strato posizionato su un lato sul cuneo di riempimento è nella posizione corretta per il riempimento.
- Aria limpida dalla linea di riempimento posizionando la borsa allo stesso livello della nave HyperStack (non superiore). Mantenere la fascetta del tubo caccia chiusa, aprire la fascetta del tubo liquido manipolazione e la pinza borsa mezzi di comunicazione per consentire fluido per entrare nella nave.
- Utilizzando il supporto borsa, sollevare la borsa media per aiutare il flusso di sospensione cellulare nel vaso.
- Riempire il serbatoio, fino tutti i supporti inoculati entra nella nave, il ml 300 di media dovrebbero ancora rimanere nella parte superiore della borsa media. Rimuovere la fascetta dal sacchetto supporto per continuare riempire il serbatoio. Come liquido si avvicina il collettore d'aria superiore, rallentare il tasso di riempimento abbassando la borsa media al fine di prevenire più di riempimento. Portare lentamente il livello del liquido per la linea di riempimento e bloccare il tubo liquido di movimentazione.
7. Procedura per l'isolamento di blocco a liquido negli strati
- Portare la nave HyperStack nel CSM in posizione di isolamento in modo entrambe le serie di collettori sono nella posizione più alta e più bassa la borsa dei media sotto l'altezza del vaso. I-12 HyperStack nave livello può essere sollevato in posizione di isolamento mettendo una mano sul fianco della nave e con l'altra per sollevare il cuneo di riempimento.
- Con il filtro di caccia tenuto in posizione verticale, aprire il morsetto caccia tubo. Questo vuoto o inseguire i media nel tubo di gestione dei liquidi nuovamente dentro il sacchetto dei media. Una volta che il tubo è vuoto, chiudere il morsetto sul tubo borsa media.
- Mantenere il filtro caccia tubo in posizione verticale, aprire il morsetto sul tubo di gestione dei liquidi sul HyperStack per consentire eventuali residui di liquido di entrare ed equilibrare nel vaso. Attendere 1-2 minuti per questo si verifichi.
- Girare la nave HyperStack nel CSM in modo che i collettori sono a sinistra. Abbassare la nave alla posizione del carico sul CSM. Dondolo la HYPEStack-12 nave strato leggermente a sinistra consentirà la rimozione del cuneo di riempimento. Chiudere i morsetti sia sulla caccia e il tubo di gestione dei liquidi.
- La borsa media possono ora essere smontato o può rimanere attaccato per un uso successivo nella procedura di raccolta. Per memorizzare il sacchetto attaccato i media, tira il sacchetto vuoto e tutta la carta rimasta nel sacco, e posto sotto le bande conservando nel cassetto di stoccaggio della nave HyperStack.
- Spostare la nave HyperStack alla incubatrice. Nell'effettuare la cura nave da adottare per mantenere liquido di entrare nel filtro di sfiato. Questo si ottiene inclinando la fine del molteplice HyperStack leggermente verso l'alto.
8. Harvest protocollo
- Per iniziare la procedura di raccolta, tubo saldare la soluzione delle cellule dissociazione e borse spegnere insieme per formare l'assemblea sacchetto di raccolta. Assicurarsi che tutte le fascette tubi sono chiusi. (Usa cartoon dimostrare)
- Rimuovere nave HyperStack dal termostato, rilasciare il sacchetto dei media da sotto le bande di sostegno, e appendere allo stand borsa. Mettere il recipiente nel CSM in posizione di carico e serrare il coperchio per fissare il vaso. Agganciare il tubo di sfiato nel morsetto holding e spostare il CSM in posizione di riempimento.
- Assicurarsi che il sacchetto dei media presso lo stand sacchetto è appeso inferiore al HyperStack, aprire il morsetto sul tubo borsa media e tubi di gestione dei liquidi della nave di consentire ai media di fluire nel sacchetto attaccato.
- Una volta che la nave è di circa ¾ vuoto, modificare le impostazioni del CSM per la posizione finale vuota. Quando la nave HyperStack e il tubo di gestione dei liquidi sono vuote, sollevare il tubo di inseguire i media oltre il morsetto sul tubo speso borsa media, quindi chiudere sia il morsetto sul tubo di gestione dei liquidi e la fascetta sul tubo speso borsa media.
- Sostituire il sacchetto passato mezzi di comunicazione con l'assemblea sacchetto di raccolta mediante saldatura di tubi e aumentare l'altezza della riunione di cella borsa dissociazione sopra l'altezza del HyperStack utilizzando il supporto borsa.
- Posizionare il CSM in posizione di equilibrio. Aprire la cella tubo soluzione dissociazione morsetto e trasferire la soluzione nella HyperStack. Quando il trasferimento è stato completato, chiudere le fascette sul tubo di gestione dei liquidi e la cellula tubi soluzione dissociazione.
- Portare CSM in posizione di carico. Tenendo premuto il posizionamento orizzontale leva di apertura, agitare delicatamente la parte nave a fianco con la ruota, distribuendo la soluzione negli strati di cellule. La nave può occasionalmente essere restituiti alla posizione di equilibrio durante dondolo per mantenere un'equa distribuzione della soluzione. Esso non può essere visivamente evidente che gli strati sono completamente rivestiti, ma la soluzione dissociazione sarà equamente distribuita su tutta la superficie delle cellule. Una volta che la soluzione è stata adeguatamente distribuito, rilasciare la leva del CSM per bloccare il HyperStack in posizione di carico. Lasciare la HyperStack in questa posizioneper il tempo necessario per la dissociazione delle cellule.
- Una volta che le cellule hanno staccato; torbidità utilizzando come guida, spostare il CSM in posizione di equilibrio. Si deve prestare attenzione a non digerire sulle celle. Aprire il morsetto spegnere borsa e il morsetto liquido HyperStack movimentazione tubi per consentire ai media spegnere per entrare nella nave. Chiudere il morsetto sul tubo di gestione dei liquidi HyperStack una volta completato il trasferimento.
- Riportare il CSM in posizione di carico e tenere premuto la leva di posizionamento orizzontale al rock lato nave a lato.
- Utilizzando il supporto borsa, abbassare la posizione del gruppo raccolta borsa sotto il livello del HyperStack. Regolare il CSM in posizione di vuoto, aprire il tubo liquido nave gestione morsetto e trasferire la soluzione cellulare nella borsa spegnere. Riportare il CSM in posizione di carico e scollegare l'assemblea sacchetto raccolta dalla nave usando un sigillante tubo. La soluzione cellula è pronta per l'elaborazione.
9. Rappresentante Risultati
- Raccogliendo tempo ha bisogno di essere ottimizzato per la conversione da una superficie di polistirene standard per la superficie permeabile polistirolo gas. Le cellule tendono a rilasciare velocemente sul prodotto HyperStack.
- Per visualizzare le cellule al microscopio la gestione di sfiato e tubi liquido deve essere bloccato al largo. Mettere il recipiente HyperStack a testa in giù, con i collettori verso il basso, sul palco microscopio.
- Passi di prevenzione possono essere adottate per evitare di bagnare i filtri durante l'uso che li farà smettere di funzionare. Da non più di riempire il serbatoio HyperStack e mantenendo il tubo di sfiato e di inseguire elevati quando i morsetti sono aperti, nessun bagnante dovrebbe verificarsi.
- La pressione dei morsetti chiuso il tubo induce a rimanere chiuso dopo che i morsetti sono aperti. Pizzicare il tubo nella direzione opposta lo aprirà.
- Tempo di flusso dei media entrando ed uscendo dal vaso HyperStack via a gravità si basa sulla differenza di altezza media tra il livello superiore della media della nave HyperStack e il livello superiore dei media nel contenitore multimediale. La distanza maggiore, più velocemente il flusso. La portata massima è limitata dalla valutazione dei filtri per 1.5L/min.
- Mantenere adeguato volume di riempimento del serbatoio HyperStack impedirà la formazione di bolle d'aria nelle camere di crescita della cellula. Le bolle d'aria può verificarsi a causa di campionamento o incubando in un ambiente unhumidified a causa di perdita di acqua per evaporazione. La quantità e la frequenza di campionamento, nonché condizioni di incubazione determinerà se liquido, aggiungere da parte dell'utente finale.
Figura 1. Esaurimento di ossigeno dei media in un vaso standard di coltura cellulare. La figura mostra la diminuzione in mg / L di ossigeno a livello delle cellule in 3 giorni.
Figura 2. Gradiente di ossigeno in media in un vaso standard di coltura cellulare. La figura mostra la mg / L di ossigeno è maggiore ai media di intersezione spazio di testa che a livello cellulare.
Figura 3. Percentuale di ossigeno nello spazio tracheale del HyperStack durante la crescita delle cellule. La figura mostra che oltre il 96 ore, la percentuale di ossigeno tra gli strati, che fornisce ogni permeabile fondo pellicola di gas, rimane costante. Questo dimostra la capacità delle cellule di accesso di ossigeno durante la crescita di confluenza.
Discussion
Nave HyperStack ha coltivato con successo progettato, cellule primarie e staminali. Integrazioni del liquido all'interno del serbatoio, sono stati condotti tramite connessioni sacco asettico da alimentazione per gravità e anche mediante pompaggio da un contenitore sterile media. La nave offre una maggiore di 2,5 volte aumento della superficie di crescita rispetto a un prodotto piatto impilati su lo stesso ingombro volumetrico. Il HyperStack-12 ha 6.000 cm 2 area di crescita, il HyperStack-36 ha 18 mila centimetri 2 Superficie crescita, e la HyperStack-120 ha 60.000 cm 2 di area di crescita. Aumentando la superficie, gli utenti sono in grado di produrre più cellule dalla popolazione stessa cella o lotto e ridurre la variabilità. Essi sono anche in grado di risparmiare spazio e / o lavoro utilizzando un numero di navi per raggiungere la stessa uscita cellulare, o aumentare la produzione di cellule senza l'aggiunta di persone, suite camera bianca, o incubatori. Il sistema è prodotto con metodi a basso assemblaggio di particolato e senza l'uso di collanti. Si tratta di un sistema chiuso che è confezionato con set di tubi e filtri, triple insaccate e fornito sterile.
Disclosures
La nave HyperStack tecnologia gas permeabile è coperta da brevetto US #: 7745209. Gli autori sono dipendenti di Corning Life Sciences, Inc., che produce lo strumento utilizzato in questo articolo.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Lonza Walkersville per la loro assistenza con conoscenza del sistema chiuso, il design borsa, prestito di sigillanti borsa e saldatori, oltre a creare la borsa a schemi HyperStack.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 1350ml media + 150ml serum (if required) |
| 4.0L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 3600ml media + 400ml serum (if required) |
| HYPERStack Vessel-12 | Corning | 10012 | |
| HYPERStack Vessel-36 | Corning | 10036 | |
| Filling Wedge | Corning | 10040 | |
| Stack Manipulator | Corning | TBD | |
| HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device | Hyclone | SH3B0324.01 | |
| 600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM) | Lonza Inc. | TBD | |
| 600ml Cell Dissociation Solution | Lonza Inc. | TBD |
