Biology

बंद सिस्टम सेल संस्कृति गैस पारगम्य सामग्री प्रौद्योगिकी के साथ HYPERStack वेसल्स का उपयोग प्रोटोकॉल

Published: November 29, 2010 doi: 10.3791/2499

Kim Titus*¹, Vitaly Klimovich*², Mark Rothenberg², Pilar Pardo*², Allison Tanner*³, Greg Martin³

¹Business Development, Corning Life Science, ²Applications, Corning Life Science, ³Product Development, Corning Life Science

* These authors contributed equally

Summary

प्रौद्योगिकी, प्रोटोकॉल, और Corning HYPERStack वेसल्स और उच्च उपज पक्षपाती सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया सामान की हैंडलिंग में एक परिचय. प्रोटोकॉल दिखाएगा कैसे वर्तमान खड़ी प्लेट उत्पादों पर बढ़ती सेल को एकत्रित करने के लिए बंद प्रणाली वाहिकाओं का उपयोग करने के लिए.

Abstract

वर्तमान में बड़ी मात्रा में पक्षपाती सेल संस्कृति खड़ी प्लेट सेल के विकास उत्पादों पर मानकीकृत जब microcarrier मोती एक इष्टतम पसंद नहीं कर रहे हैं. HYPERStack जहाजों बंद प्रणाली पैमाने अनुमति देते हैं और वर्तमान खड़ी प्लेट उत्पादों से ही बड़ा पदचिह्न में> 2.5X अधिक कक्षों उद्धार. HYPERStack गैस पारगम्य सामग्री है जो गैस विनिमय होने के लिए अनुमति देता है के माध्यम से समारोह वाहिकाओं, इसलिए एक पोत के भीतर आंतरिक headspace लिए नष्ट करने की जरूरत है. headspace के उन्मूलन के डिब्बे जहां सेल के विकास के लिए कम से कम हो होता है अंतरिक्ष को कम करने के लिए, एक ही बड़ा पदचिह्न भीतर सेल के विकास सतह क्षेत्र के अधिक परतों की अनुमति देता है.

सेल थेरेपी या टीका उत्पादन के रूप में कई अनुप्रयोगों के लिए, एक बंद व्यवस्था सेल के विकास और एकत्रित करने के लिए आवश्यक है. HYPERStack पोत सेल और अभिकर्मक इसके अलावा और मीडिया बैग या अन्य तरीकों से टयूबिंग के माध्यम से हटाने की अनुमति देता है.

इस प्रोटोकॉल गैस पारगम्य सामग्री HYPERStack वाहिकाओं, गैस प्रसार परिणामों में कोशिकाओं, बंद प्रणाली सेल के विकास प्रोटोकॉल और विभिन्न कटाई तरीकों के चयापचय जरूरतों को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया प्रौद्योगिकी के पीछे समझा जाएगा.

Protocol

1. HYPERStack पोत - गैस पारगम्य सामग्री प्रौद्योगिकी पृष्ठभूमि

HYPERStack पोत कोशिकाओं है कि एक 76.2micron गैस पारगम्य बहुलक फिल्म के माध्यम से गैस आदान - प्रदान पर सेलुलर चयापचय के लिए निर्भर करता है की बंद प्रणाली संवर्धन के लिए एक multilayered पोत है.
HYPERStack पोत अधिक परंपरागत सेल संस्कृति वाहिकाओं में है कि यह पोत के अंदर की कोशिकाओं के ऊपर एक "headspace" नहीं है से अलग है. पोत के भीतर गैस आदान - प्रदान के लिए इस "headspace" युक्त बजाय, गैस पारगम्य उत्पादों प्रत्येक संस्कृति कक्ष है जो वातावरण के लिए खुला है हवा के रिक्त स्थान ("tracheal" रिक्त स्थान के रूप में भेजा) के नीचे है.
इस पोत के प्रत्येक सेल संस्कृति डिब्बे में बढ़ती के बराबर गैस विनिमय tracheal अंतरिक्ष कोशिकाओं सक्षम बनाता है.
गैस पारगम्य फिल्म गैस विनिमय जबकि एक बाँझ वातावरण बनाए रखने के होने के लिए अनुमति देता है. कई परतों में से प्रत्येक के लिए एक एकल प्रविष्टि पोर्ट के माध्यम से सभी तरल पदार्थ जोड़तोड़ होते हैं.

2. HYPERStack पोत घटक सारांश

Stackette व्यक्तिगत सेल संस्कृति कम्पार्टमेंट है कि ऊपर थाली और गैस पारगम्य फिल्म से बना है. कोशिकाओं को इस डिब्बे के भीतर सुसंस्कृत हैं.
तरल कई गुना 12 stackette परतों के प्रत्येक एक HYPERStack मॉड्यूल के भीतर एक साथ जोड़ता है. मॉड्यूल टयूबिंग के साथ जुड़े हुए हैं के लिए 12 परतों के गुणकों में जहाजों फार्म. कई गुना उपयोगकर्ता पूरे पोत के लिए एक तरल पदार्थ हेरफेर करने के लिए अनुमति देता है.
एयर कई गुना भी stackette परतों को एक साथ जोड़ता है, लेकिन यह पोत से हवा विस्थापित जब तरल पदार्थ परिवर्धन होते थे. यह भरने के दौरान उपयोग के लिए भरण लाइन शामिल हैं.
Tracheal अंतरिक्ष प्रत्येक stackette परत के बीच खुली हवा स्थान है, गैस विनिमय प्रत्येक परतों 'गैस पारगम्य फिल्म के माध्यम से होने के लिए अनुमति देता है.
तरल हैंडलिंग टयूबिंग तरल कई गुना से जुड़े है और सभी बंद प्रणाली द्रव जोड़तोड़ बनाने के लिए इस्तेमाल किया. इस घटक को अनुकूलित किया जा सकता है.
वेंट टयूबिंग हवा कई गुना जुड़ा हुआ है, एक हवा फिल्टर होता है, और अतिरिक्त हवा रिलीज जबकि बाँझपन बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया है.
पीछा टयूबिंग एक फिल्टर और दबाना है और तरल से निपटने टयूबिंग से जुड़े हैं और पोत भरने के बाद तरल से निपटने टयूबिंग से तरल पदार्थ को खाली करने के लिए इस्तेमाल किया.
Corning ढेर मैनिप्युलेटर या CSM प्रयोग के दौरान सही स्थिति में जहाजों को रखने में सहायता के लिए एक से निपटने के लिए डिवाइस है.
भरना कील एक स्टेनलेस स्टील सहायता प्रयोग किया जाता है जब स्वयं HYPERStack वाहिकाओं भरने है.

3. गैस गैस पारगम्य HYPERStack वेसल्स में खेतों में प्रयुक्त किए गए फिल्म के माध्यम से प्रसार परिणाम

दिए headspace के साथ परंपरागत सेल के विकास प्रणालियों में, मीडिया में ऑक्सीजन संस्कृति में 3 दिन से अधिक 50% के एक औसत समाप्त हो गया है. (चित्रा 1)
एक ही सेल के विकास प्रणाली में मीडिया के एक 3mm ऊंचाई में ऑक्सीजन ढाल मीडिया में headspace जंक्शन लगभग 50% से अधिक यह सेल परत में है. (चित्रा 2)
76.2micron गैस पारगम्य polystyrene फिल्म के माध्यम से ऑक्सीजन का प्रसार मीडिया के 2.6mm के माध्यम से प्रसार के बराबर है. गैस पारगम्य HYPERStack वाहिकाओं में इस्तेमाल फिल्म गैस विनिमय सेल परत में होने के लिए अनुमति देता है.
HYPERStack वाहिकाओं के tracheal अंतरिक्ष में ऑक्सीजन का प्रतिशत निरंतर बनी हुई है के रूप में कक्षों संगम विकसित करने के लिए. (चित्रा 3)

4. मीडिया थैला तैयार

HYPERStack 12-परत पोत मीडिया के 1.3L लेता है और HYPERStack-36 परत पोत 3.9L मीडिया के लेता है.
अपने जीता मीडिया inoculating से पहले, अगर सीरम इस्तेमाल किया जा रहा है, ट्यूब मीडिया बैग सीरम बैग वेल्ड और मिश्रण अच्छी तरह से.
बंद बैग में बड़े थैले clamps का उपयोग मीडिया के लगभग 300 एमएल दबाना. इससे यह सुनिश्चित होगा सभी inoculated कोशिकाओं को भरने और कोई भी मीडिया बैग में शेष रहे हैं के दौरान इस्तेमाल किया जाता है. बैग स्टैंड पर प्लेस मीडिया बैग.

5. Inoculating मीडिया

सेल निलंबन के साथ संलग्न टयूबिंग के साथ एक सिरिंज भरें. ट्यूब वेल्ड 3 / 16 टयूबिंग मीडिया बैग सेल निलंबन युक्त सिरिंज से ".
मीडिया थैला में सेल सस्पेंशन इंजेक्षन और अच्छी तरह मिक्स.

6. प्रक्रिया भरें

ट्यूब HYPERStack इस पोत 3 / 8 "तरल से निपटने टयूबिंग (बाँझ जोड़ता या जोड़ता है (MPCs) बहुउद्देशीय का उपयोग, आप भी पोत के लिए मीडिया बैग संलग्न कर सकते हैं) inoculated मीडिया बैग वेल्ड.
तरल हैंडलिंग और HYPERStack पर पीछा ट्यूब पर clamps बंद करें.
CSM पर पकड़े दबाना में वेंट फिल्टर ट्यूब हुक, लोड की स्थिति में CSM में HYPERStack 36 लेयर पोत रखें. ढक्कन कस और भरण स्थिति के लिए ले जाने के CSM. सही भरण स्थिति में पोत डाल करके, हवा फिल्टर भरने के आपरेशन के दौरान गीला रोकने के उच्चतम स्थिति में अब है. 10 ° कोण परमिट equilibrपरतों के लिए तरल के भरने के दौरान समझना. HYPERStack-12 परत भरने कील पर अपने पक्ष पर रखा पोत भरने के लिए सही स्थिति में है.
HYPERStack पोत नहीं है (अधिक) के रूप में एक ही स्तर पर बैग की स्थिति से भरण लाइन से साफ हवा. पीछा ट्यूब दबाना बंद रखते हुए, तरल से निपटने ट्यूब दबाना और मीडिया बैग दबाना खोलने के लिए तरल पदार्थ के लिए जहाज में प्रवेश की अनुमति.
बैग स्टैंड का प्रयोग, मीडिया बैग उठाने के बर्तन में सेल निलंबन प्रवाह में मदद करने के लिए.
पोत भरें जब तक inoculated मीडिया के सभी पोत में प्रवेश करती है, मीडिया के 300 एमएल अभी भी मीडिया बैग के शीर्ष भाग में रहना चाहिए. मीडिया बैग से दबाना पोत भरने जारी निकालें. के रूप में तरल ऊपरी हवा कई गुना दृष्टिकोण, नीचे मीडिया बैग कम क्रम में भरने पर रोक के द्वारा भरण दर धीमी है. धीरे धीरे भरने के लाइन तरल स्तर लाने के लिए और तरल से निपटने टयूबिंग दबाना.

7. अलगाव प्रक्रिया परतों में लिक्विड लॉक

अलगाव की स्थिति के लिए CSM में HYPERStack पोत लाओ तो manifolds के दोनों सेट उच्चतम स्थिति में हैं और मीडिया बैग पोत की ऊंचाई से नीचे कम. HYPERStack 12-परत पोत पोत के किनारे पर एक हाथ रखकर और अन्य का उपयोग करने के लिए भरने कील लिफ्ट से अलगाव की स्थिति में उठाया जा सकता है.
पीछा एक ईमानदार स्थिति में आयोजित फिल्टर के साथ, पीछा ट्यूब दबाना खुला. यह खाली या मीडिया का पीछा तरल से निपटने ट्यूब में मीडिया बैग में वापस. एक बार टयूबिंग खाली है, मीडिया बैग टयूबिंग पर दबाना बंद.
एक ईमानदार स्थिति में पीछा ट्यूब फिल्टर को ध्यान में रखते हुए, HYPERStack पर तरल से निपटने ट्यूब पर दबाना किसी भी शेष तरल दर्ज करें और पोत में संतुलित अनुमति खुला. यह घटित करने के लिए 1-2 मिनट रुको.
CSM ताकि manifolds बाईं तरफ मुड़ें HYPERStack पोत. लोअर CSM पर लोड स्थिति के लिए जहाज. बाईं ओर थोड़ा HYPEStack-12 परत पोत कमाल भरने कील को हटाने की अनुमति होगी. दोनों का पीछा और तरल से निपटने टयूबिंग पर clamps बंद करें.
अब मीडिया बैग जहाज से हटा दिया जा सकता है या उपयोग के लिए फसल प्रक्रिया में बाद जुड़ा रह सकता है. संलग्न मीडिया बैग स्टोर करने के लिए, HYPERStack पोत के भंडारण ट्रे में बनाए रखना है बैंड के तहत खाली बैग और थैले में किसी भी शेष मीडिया, और जगह का रोल.
इनक्यूबेटर HYPERStack पोत ले जाएँ. हवा वेंट फिल्टर में प्रवेश करने से तरल रखना जब पोत देखभाल ले लिया जाना चाहिए. यह थोड़ा ऊपर की ओर कई गुना HYPERStack के अंत ढोने के द्वारा पूरा किया है.

8. फसल काटने वाले प्रोटोकॉल

फसल प्रक्रिया शुरू करने के लिए, ट्यूब कटाई बैग विधानसभा फार्म सेल हदबंदी समाधान और बुझाना बैग के साथ वेल्ड. सुनिश्चित करें कि सभी टयूबिंग clamps बंद हो जाती हैं. (प्रदर्शित करने के लिए कार्टून का प्रयोग करें)
इनक्यूबेटर से HYPERStack पोत निकालें, मीडिया बैग को बनाए रखना है बैंड के नीचे से जारी है, और बैग स्टैंड पर लटका. लोड स्थिति में CSM में पोत प्लेस और पोत सुरक्षित ढक्कन को कस लें. पकड़े दबाना में टयूबिंग वेंट हुक और भरण स्थिति के लिए ले जाने के CSM.
मीडिया बैग टयूबिंग और पोत के तरल से निपटने के लिए मीडिया को संलग्न बैग में प्रवाह करने की अनुमति टयूबिंग पर दबाना खुला, सुनिश्चित करें कि बैग स्टैंड पर बैग मीडिया HYPERStack की तुलना में कम लटका हुआ है.
एक बार पोत के बारे में है ¾ खाली खाली स्थिति के लिए अंतिम CSM सेटिंग्स को बदलने. जब HYPERStack पोत और तरल से निपटने टयूबिंग खाली हैं, टयूबिंग लिफ्ट खर्च मीडिया बैग टयूबिंग पर दबाना अतीत मीडिया पीछा, तब तरल से निपटने टयूबिंग पर दोनों दबाना और खर्च मीडिया बैग टयूबिंग पर दबाना बंद.
कटाई ट्यूब वेल्डिंग द्वारा बैग विधानसभा के साथ बिताया मीडिया बैग बदलें और सेल हदबंदी बैग विधानसभा HYPERStack बैग स्टैंड के उपयोग की ऊंचाई से ऊपर की ऊंचाई बढ़ा.
संतुलन की स्थिति में CSM रखें. ओपन सेल हदबंदी समाधान ट्यूब दबाना और HYPERStack में समाधान स्थानांतरण. जब स्थानांतरण पूरा हो गया है, तरल से निपटने टयूबिंग और सेल हदबंदी समाधान टयूबिंग पर clamps के करीब है.
लोड स्थिति के लिए CSM लाओ. क्षैतिज स्थिति लीवर खुला धारण करके धीरे पहिया का उपयोग पक्ष करने के लिए पोत पक्ष रॉक, सेल परतों पर समाधान वितरण. पोत कभी कभी समाधान के समान वितरण को बनाए रखने के लिए घोड़ा के दौरान संतुलन की स्थिति को लौट जा सकता है. यह नेत्रहीन स्पष्ट है कि परतों पूरी तरह से लेपित हैं नहीं हो सकता है, लेकिन हदबंदी समाधान समान रूप से कोशिकाओं की सतह भर में वितरित किया जाएगा हो सकता है. एक बार समाधान पर्याप्त रूप से वितरित किया गया है, CSM पर लीवर लोड की स्थिति में HYPERStack ताला जारी है. इस स्थिति में HYPERStack छोड़ दोअपनी कोशिकाओं के लिए आवश्यक हदबंदी समय के दौरान.
एक बार कोशिकाओं अलग है, एक गाइड के रूप में turbidity का उपयोग, संतुलन की स्थिति के लिए CSM कदम. केयर कक्षों पर हजम नहीं लिया जाना चाहिए. बुझाना बैग दबाना और HYPERStack तरल से निपटने टयूबिंग दबाना खोलें बुझाना मीडिया पोत में प्रवेश करने की अनुमति है. HYPERStack तरल से निपटने ट्यूबिंग पर दबाना बंद एक बार स्थानांतरण पूरा हो गया है.
लोड स्थिति CSM वापस जाएँ और क्षैतिज स्थिति लीवर पकड़ पोत पक्ष की ओर से रॉक.
बैग स्टैंड का प्रयोग, HYPERStack के स्तर के नीचे फसल बैग विधानसभा की स्थिति कम है. खाली स्थिति को CSM समायोजित करने के लिए, खोलने के पोत तरल से निपटने ट्यूब दबाना और बुझाना बैग में सेल समाधान हस्तांतरण वापस. लोड स्थिति CSM लौटें और एक ट्यूब मुहर का उपयोग पोत से फसल बैग विधानसभा डिस्कनेक्ट. सेल समाधान प्रसंस्करण के लिए तैयार है.

9. प्रतिनिधि परिणाम

फसल काटने वाले समय के लिए अनुकूलित किया जाना है जब एक मानक polystyrene सतह से गैस पारगम्य polystyrene सतह को परिवर्तित की जरूरत है. कक्ष HYPERStack उत्पाद पर तेजी से रिलीज करते हैं.
एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं को देखने के वेंट और तरल से निपटने टयूबिंग के लिए रवाना clamped की जरूरत है. HYPERStack पोत उल्टा manifolds के नीचे खुर्दबीन मंच पर ओर इशारा करते हुए के साथ प्लेस,.
निवारण चरणों के उपयोग के दौरान फिल्टर है जो उन्हें कामकाज को रोकने के लिए कारण होगा गीला करने से बचने के लिए लिया जा सकता है है. HYPERStack पोत भरने और रखने वेंट और पीछा टयूबिंग ऊंचा जब clamps खुले हैं पर नहीं करके, कोई गीला हो जाना चाहिए.
टयूबिंग पर बंद clamps के दबाव के कारण इसे बंद रहने के लिए बाद clamps खोल रहे हैं. विपरीत दिशा में टयूबिंग pinching यह खुल जाएगा.
मीडिया प्रवाह समय में प्रवेश करने और गुरुत्व फ़ीड के माध्यम से HYPERStack पोत निकल HYPERStack पोत में मीडिया और मीडिया कंटेनर में मीडिया के शीर्ष स्तर के शीर्ष स्तर के बीच मीडिया की ऊंचाई अंतर पर आधारित है. अधिक से अधिक दूरी, तेजी से प्रवाह. अधिकतम प्रवाह 1.5L/min के लिए फिल्टर की रेटिंग द्वारा सीमित है.
HYPERStack बर्तन में उचित भरण मात्रा को बनाए रखने सेल के विकास कक्षों में हवा बुलबुला गठन को रोकने जाएगा. वायु बुलबुले नमूने या एक unhumidified बाष्पीकरणीय पानी की कमी की वजह से वातावरण में incubating के कारण हो सकता है. नमूना राशि और आवृत्ति के रूप में ऊष्मायन शर्तों के रूप में अच्छी तरह से अगर अतिरिक्त तरल पदार्थ अंत उपयोगकर्ता द्वारा जोड़ा जाना चाहिए का निर्धारण करेगा.

चित्रा 1 में एक मानक सेल संस्कृति बर्तन में मीडिया के आक्सीजन रिक्तीकरण . आंकड़ा 3 दिन से अधिक कोशिकाओं के स्तर पर ऑक्सीजन की मिलीग्राम / एल में कमी से पता चलता है.

चित्रा 2. आक्सीजन एक मानक सेल संस्कृति बर्तन में मीडिया में ढाल. आंकड़ा दिखाता है मिलीग्राम / आक्सीजन के एल सेल परत में से headspace चौराहे मीडिया पर सबसे बड़ा है.

चित्रा 3 सेल के विकास के दौरान HYPERStack के tracheal अंतरिक्ष में ऑक्सीजन का प्रतिशत . आंकड़ा पता चलता है कि 96 घंटे से अधिक परतों के बीच ऑक्सीजन का प्रतिशत है, जो प्रत्येक गैस पारगम्य फिल्म नीचे की आपूर्ति निरंतर बनी हुई है. यह कोशिकाओं की क्षमता के विकास के दौरान ऑक्सीजन confluency करने के लिए उपयोग को दर्शाता है.

Discussion

HYPERStack पोत सफलतापूर्वक वृद्धि हुई इंजीनियर है, प्राथमिक और स्टेम कोशिकाओं. पोत में द्रव परिवर्धन भी गुरुत्व फ़ीड और एक बाँझ मीडिया कंटेनर से पम्पिंग द्वारा सड़न रोकनेवाला बैग कनेक्शन के माध्यम से आयोजित किया गया है. पोत विकास के क्षेत्र में एक से अधिक 2.5X वृद्धि बनाम खड़ी एक ही बड़ा पदचिह्न की थाली उत्पाद प्रदान करता है. HYPERStack-12 ६,००० ² सेमी विकास क्षेत्र, HYPERStack 36 +१८००० ² सेमी विकास क्षेत्र, और HYPERStack-120 विकास क्षेत्र के 60,000 ² सेमी है. सतह क्षेत्र को बढ़ाने से, उपयोगकर्ताओं के लिए एक ही सेल की आबादी या बहुत से अधिक कोशिकाओं का उत्पादन और परिवर्तनशीलता को कम करने में सक्षम हैं. उन्होंने यह भी कम जहाजों का उपयोग करने के लिए एक ही सेल उत्पादन प्राप्त करने के लिए, या लोगों, cleanroom सूट, या इन्क्यूबेटरों जोड़ने के बिना सेल का उत्पादन बढ़ाने के द्वारा अंतरिक्ष और / या श्रम को बचाने के लिए सक्षम हैं. प्रणाली कम कण विधानसभा तरीकों के साथ और चिपकने के उपयोग के बिना उत्पादन किया है. यह एक बंद व्यवस्था है जो टयूबिंग सेट और फिल्टर, ट्रिपल जीता और बाँझ प्रदान के साथ preassembled है.

Disclosures

: HYPERStack पोत गैस पारगम्य प्रौद्योगिकी अमेरिकी पेटेंट # 7745209 के तहत कवर किया जाता है. लेखकों Corning लाइफ साइंसेज, इंक कि इस लेख में प्रयोग किया जाता साधन उत्पादन के कर्मचारी हैं.

Acknowledgments

लेखकों के लिए बंद प्रणाली ज्ञान, बैग डिजाइन, बैग sealers और वेल्डर के ऋण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से HYPERStack schematics के लिए बैग बनाने के साथ उनकी सहायता के लिए Lonza Walkersville धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	1350ml media + 150ml serum (if required)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml media + 400ml serum (if required)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	Lonza Inc.	TBD