Summary
מבוא לתוך פרוטוקול הטכנולוגיה, וטיפול של כלי HYPERStack קורנינג ואביזרים המשמשים תרבית תאים תשואה גבוהה חסיד. פרוטוקול יציג כיצד להשתמש בכלי מערכת סגורה לקציר תא הגדלת מעל הנוכחי מוצרים מוערמים צלחת.
Abstract
נפח גדול חסיד תרבית תאים סטנדרטיים כיום על תא מוערמים מוצרים צלחת צמיחה כאשר חרוזים microcarrier הם לא הבחירה האופטימלית. כלי HYPERStack לאפשר מידה מערכת סגורה למעלה מן המוצרים הנוכחי צלחת מוערמים ומספק> 2.5x התאים יותר תפוסת נפח זהה. כלי HYPERStack פונקציה באמצעות חומר חדיר גז המאפשר חילופי גזים להתרחש, ולכן ביטול הצורך אמיץ פנימיים בתוך כלי. חיסול אמיץ מאפשרת לתא שבו מתרחשת צמיחת תאים להיות ממוזער כדי להפחית את החלל, המאפשר לשכבות יותר של האזור צמיחת תאים בתוך השטח תפוסת נפח זהה.
עבור יישומים רבים, כגון טיפול בתאי או ייצור החיסון, במערכת סגורה נדרש צמיחת תאים והקציר. כלי HYPERStack מאפשר התא מגיב בנוסף והסרה באמצעות צינורות משקיות התקשורת או בשיטות אחרות.
פרוטוקול זה יסביר את הטכנולוגיה מאחורי החומר גז חדיר המשמש כלי HYPERStack, דיפוזיה תוצאות הגז כדי לענות על הצרכים המטבולית של תאים, תא סגור מערכת פרוטוקולי גידול, שיטות המסיק השונות.
Protocol
1. כלי HYPERStack - חומר חדיר גז רקע טכנולוגיה
- כלי HYPERStack היא כלי רב שכבתי עבור culturing מערכת סגורה של תאים מסתמך על חילוף הגזים דרך סרט גז 76.2micron הפולימר חדיר עבור המטבוליזם התאי.
- כלי HYPERStack נבדל יותר מסורתי תרבות כלי תא כי אין "אמיץ" מעל התאים בתוך הכלי. במקום המכילים "אמיץ" לחילופי גז בתוך כלי, מוצרי גז חדיר יש רווחים אוויר (המכונה רווחים "קנה הנשימה") מתחת לתא כל תרבות אשר פתוח לאווירה.
- זה במרחב קנה הנשימה מאפשרת לתאים לגדול בתא כל תא התרבות של כלי השיט יש חילוף הגזים המקבילה.
- הסרט גז חדיר מאפשרת חילוף הגזים להתרחש תוך שמירה על סביבה סטרילית. כל המניפולציות נוזל עבור כל שכבות מרובות להתרחש דרך נמל ערך בודד.
2. רכיב HYPERStack כלי השיט סיכום
- Stackette הוא תא יחיד התרבות תא זה מורכב צלחת העליון הסרט גז חדיר. התאים בתרבית בתוך תא זה.
- סעפת נוזלי מתחבר כל אחד מ -12 שכבות stackette יחד בתוך מודול HYPERStack. מודולים מחוברים עם צינורות כדי ליצור כלי בכפולות של 12 שכבות. סעפת מאפשר למשתמש לעשות אחד מניפולציה נוזל לכלי השיט כולו.
- סעפת האוויר גם מתחבר שכבות stackette ביחד, אבל זה היה אמור לתפוס אוויר מספינת כאשר שנוספו נוזל להתרחש. הוא כולל שורת למלא לשימוש במהלך המילוי.
- שטח קנה הנשימה הוא המרחב האווירי פתוח בין כל שכבה stackette, המאפשר חילופי גזים להתרחש באמצעות הסרט גז חדיר כל "שכבות.
- צינורות הטיפול נוזלי מחוברת סעפת נוזלי משמש כדי להפוך את הנוזל כל המניפולציות מערכת סגורה. רכיב זה יכול להיות מותאם אישית.
- צינורות האוורור מחוברת סעפת האוויר, מכיל מסנן האוויר, והוא משמש כדי לשחרר עודפי אוויר תוך שמירה על סטריליות.
- צינורות מרדף יש לסנן מהדק ו מחוברים צינורות הטיפול נוזלי משמשים לפנות את נוזל מתוך צינורות הטיפול נוזל לאחר מילוי כלי השיט.
- Manipulator סטאק קורנינג או CSM הוא מכשיר לטיפול לסייע הצבת כלי בעמדות הנכונות בזמן השימוש.
- וודג מילוי הוא נירוסטה לסייע בשימוש בעת מילוי ידני של כלי HYPERStack.
3. דיפוזיה גז תוצאות באמצעות הסרט גז חדיר משמש כלי HYPERStack
- בשנת המסורתית צמיחה מערכות תא עם אמיץ פרקו, החמצן בתקשורת תיגמר ממוצע של 50% מעל 3 ימים בתרבות. (איור 1)
- בשנת מערכת תא זהה צמיחה, שיפוע חמצן בגובה 3mm של התקשורת הוא כמעט 50% יותר על התקשורת לצומת אמיץ יותר מאשר בכל שכבת התאים. (איור 2)
- דיפוזיה של חמצן דרך הסרט חדיר גז 76.2micron פוליסטירן שווה דיפוזיה דרך 2.6mm של התקשורת. הסרט גז חדיר המשמש כלי HYPERStack מאפשרת את חילוף הגזים להתרחש בכל שכבת התאים.
- % חמצן בחלל קנה הנשימה של כלי HYPERStack נשאר קבוע כמו תאים גדלים על מפגש. (איור 3)
4. מדיה הכנת תיק
- כלי-12 HYPERStack שכבת לוקח 1.3L של התקשורת HYPERStack-36 כלי שכבת לוקח 3.9L של התקשורת.
- לפני inoculating התקשורת ארזו שלך, אם בסרום היא לשמש, צינור לרתך את התיק בסרום על תיק התקשורת ומערבבים היטב.
- הצמד מעל כ 300 מ"ל של המדיה בתיק באמצעות מהדק תיק גדול. פעולה זו תבטיח את כל התאים מחוסן משמשים במהלך מילוי אף הם שנותרו בתיק התקשורת. התקשורת המקום לעמוד על תיק שק.
5. Inoculating מדיה
- ממלאים מזרק עם צינורות מחוברים עם ההשעיה התא. Tube לרתך 3 / 16 "צינורות מ מזרק המכיל ההשעיה התא תיק התקשורת.
- להזריק את השעיה תא לשקית מדיה מערבבים היטב.
6. מילוי נוהל
- Tube לרתך את תיק התקשורת מחוסן עד 3 / 8 "צינורות טיפול נוזלי. כלי השיט HYPERStack (שימוש סטרילי מחבר או מחברת רב (MPCs), ניתן גם לצרף את תיק התקשורת לכלי השיט).
- סגור את מהדק על הטיפול נוזל וצינורות מרדף על HYPERStack.
- מניחים את כלי השיט 36 HYPERStack שכבת לתוך CSM בעמדה לטעון; קרס צינור האוורור לסנן לתוך מהדק המחזיק ב CSM. הדקו את המכסה להזיז את CSM לתפקיד למלא. ידי הצבת כלי למצב למלא נכונה; את מסנן האוויר הוא כעת במיקום הגבוה ביותר על מנת למנוע הרטבה במהלך המבצע למלא. 10 ° זווית היתרי equilibration הנוזל אל השכבות במהלך המילוי. כלי HYPERStack-12 השכבה מונחת על צידה על טריז מילוי נמצאת בעמדה הנכונה למילוי.
- נקה אוויר מקו למלא את השקית על ידי מיצוב באותה רמה כמו כלי HYPERStack (לא יותר). שמירה על מהדק צינור מרדף סגור; לפתוח את הטיפול נוזל צינור מהדק את מהדק תיק התקשורת, כדי לאפשר לנוזל להיכנס לכלי.
- שימוש לעמוד את התיק, להרים את התיק התקשורת לסייע ההשעיה תא לזרום לתוך הכלי.
- מלאו את כלי השיט עד שכל התקשורת מחוסן נכנס כלי, 300 מ"ל של התקשורת עדיין צריך להישאר בחלק העליון של תיק התקשורת. הסר את מהדק משקית התקשורת להמשיך למלא את כלי השיט. כמו נוזל מתקרב סעפת האוויר העליונות, להאט את קצב למלא על ידי הפחתת תיק התקשורת כדי למנוע מעל המילוי. לאט לאט מביאים את רמת הנוזל לקו המילוי מהדק צינורות טיפול נוזלי.
7. בידוד פרוצדורה כדי נעל נוזלי לתוך שכבות
- הביאו את כלי HYPERStack ב CSM כדי למקם את הבידוד כך שתי קבוצות יריעות נמצאים בעמדה הגבוהה ביותר ולהפחית את תיק התקשורת מתחת לגובה של כלי השיט. הספינה-12 HYPERStack שכבה ניתן להרים למצב את הבידוד על ידי הנחת יד על הצד של הכלי ושימוש אחרים להרים את טריז מילוי.
- עם מסנן המרדף שנערך בתנוחה זקופה, פתח את מהדק צינור מרדף. זה יהיה ריק או לרדוף התקשורת בצינור טיפול הנוזל חזרה לתוך תיק התקשורת. לאחר צינורות ריק, לסגור את מהדק על צינור את התיק בתקשורת.
- שמירה על מסנן צינור לרדוף בתנוחה זקופה, פתח את מהדק על צינור טיפול הנוזל על HYPERStack לאפשר כל נוזל הנותר להיכנס לאזן את הספינה. חכה 1-2 דקות זה להתרחש.
- הפעל את כלי HYPERStack ב CSM כך יריעות הם בצד שמאל. מנמיכים את כלי למצב העומס על CSM. נדנדה HYPEStack-12 כלי שכבת מעט שמאלה יאפשרו את הסרת טריז את המילוי. סגור את מלחציים משני המרדף צינורות טיפול נוזלי.
- תיק התקשורת ניתן עתה להסיר את כלי השיט או שהוא עשוי להישאר מחובר לשימוש מאוחר יותר בהליך הקציר. כדי לאחסן את השקית המצורפת התקשורת, לגלגל את התיק ריק וכל מדיה שנותרו בשקית, ואת המקום תחת שמירה להקות במגש האחסון של כלי HYPERStack.
- הזז את כלי HYPERStack אל האינקובטור. כאשר נושאים את כלי הטיפול יש לנקוט כדי לשמור על נוזלי מלהיכנס לסנן פתח האוורור. מטרה זו מושגת על ידי מפנה סוף סעפת של HYPERStack מעט כלפי מעלה.
8. קציר פרוטוקול
- כדי להתחיל את ההליך הקציר, צינור לרתך את הפתרון תא דיסוציאציה ושקיות להרוות יחד כדי ליצור את הרכבה שקית קציר. ודאו כי כל מהדק צינורות סגורים. (השתמש קריקטורה להפגין)
- הסר כלי HYPERStack מן האינקובטור, לשחרר את תיק התקשורת מתחת להקות שמירה, ולתלות על דוכן העדים בתיק. מניחים את כלי שיט CSM בעמדה לטעון להדק את המכסה כדי לאבטח את כלי השיט. הוק את צינור האוורור לתוך מהדק המחזיק ולהעביר את CSM לתפקיד למלא.
- וודא את התיק התקשורת על דוכן העדים בתיק תלוי נמוך יותר HYPERStack; לפתוח את מהדק על צינור את התיק מדיה צינורות טיפול הנזילים של כלי התקשורת, כדי לאפשר זרימת לשקית המצורפת.
- לאחר הספינה הוא כ ¾ ריק, לשנות את ההגדרות CSM לתפקיד ריק הסופי. כאשר כלי HYPERStack צינורות טיפול הנוזל ריקים, להרים את צינורות לרדוף התקשורת בעבר מהדק על צינורות התקשורת בילה את התיק, ואז לסגור גם את מהדק על צינור נוזל את הטיפול ואת מהדק על צינורות התקשורת בילה את התיק.
- החלף את תיק התקשורת בילה עם הרכבה את התיק על ידי קצירת ריתוך צינור ולהעלות את גובה ההרכבה תא שקית דיסוציאציה מעל גובה של HYPERStack שימוש לעמוד שקית.
- מניחים את CSM במצב איזון. פתח את צינור תא דיסוציאציה הפתרון מהדק ולהעביר את הפתרון לתוך HYPERStack. כאשר ההעברה תסתיים, סגור את מהדק על צינור הטיפול נוזל בצינור תא דיסוציאציה פתרון.
- תביאו CSM למצב עומס. על ידי החזקת הידית אופקית מיצוב לפתוח בעדינות את הסלע בצד כלי לצד באמצעות גלגל, להפיץ את הפתרון על שכבות התאים. הכלי לעיתים יוחזר לעמדת איזון במהלך נדנדה לשמור על חלוקה שווה של הפתרון. זה לא יכול להיות ברור מבחינה חזותית, כי הם מצופים בשכבות לחלוטין, אבל הפתרון דיסוציאציה יחולקו באופן שווה על פני השטח של התאים. לאחר פתרון הופץ כראוי, שחרר את הידית על CSM כדי לנעול את HYPERStack במצב עומס. השאירו את HYPERStack במצב הזהבזמן ניתוק נדרש לתאים.
- ברגע שהתאים לנו מנותקת, באמצעות עכירות כמדריך, להעביר את CSM למצב איזון. יש להקפיד לא מעל לעכל את התאים. פתח את תפס שקית להרוות והטיפול נוזלי HYPERStack מהדק בצינור כדי לאפשר את התקשורת להרוות להיכנס לכלי. סגור את מהדק על צינור נוזל טיפול HYPERStack פעם ההעברה תסתיים.
- החזר את CSM לתפקיד לטעון ולהחזיק את הידית מיצוב אופקי אל הסלע בצד כלי לצד.
- שימוש לעמוד את התיק, להנמיך את עמדת הרכבה הקציר שקית מתחת לרמה של HYPERStack. התאם את CSM למצב ריק, פתחו את צינור נוזל כלי הטיפול מהדק ולהעביר את פתרון התא בחזרה לשקית להרוות. החזר את CSM לעמדת הטעינה ולנתק את התיק הקציר הרכבה מספינת אוטם באמצעות צינור. הפתרון הסלולרי הוא מוכן לעיבוד.
9. נציג תוצאות
- מסיק הזמן צריך להיות מותאם בעת המרת מ משטח קלקר סטנדרטית משטח קלקר חדיר גז. תאים נוטים לשחרר מהר יותר על המוצר HYPERStack.
- כדי להציג תאים תחת מיקרוסקופ את צינור האוורור ואת נוזלי הטיפול צריך להיות מהודק משם. מניחים את כלי HYPERStack במהופך, עם יריעות מופנה כלפי מטה, על הבמה מיקרוסקופ.
- צעדים למניעת שניתן לנקוט כדי למנוע הרטבה מסננים במהלך השימוש אשר יגרום להם להפסיק לפעול. עד לא נגמר ממלאים את כלי HYPERStack ולשמור על צינורות האוורור לרדוף גבוהות כאשר מלחציים פתוחים, הרטבה לא אמורה להתרחש.
- הלחץ של מהדק סגור על הצינור גורם לו להישאר סגור לאחר מלחציים נפתחים. צביטת צינורות בכיוון ההפוך יהיה לפתוח אותו.
- זמן מדיה זרימת כניסה ויציאה כלי HYPERStack דרך להאכיל הכבידה על בסיס ההפרש בין גובה התקשורת ברמה העליונה של התקשורת כלי HYPERStack ורמת גבי מדיה במיכל התקשורת. המרחק גדול יותר, מהר יותר את הזרימה. הזרימה המקסימלית היא מוגבלת על ידי דירוג של מסננים 1.5L/min.
- שמירה על נפח מילוי תקין כלי HYPERStack ימנע היווצרות בועת אוויר בתאי גידול התא. בועות האוויר יכול להתרחש עקב דגימה או דוגרים בסביבה unhumidified עקב אובדן מים אויר. כמות ותדירות הדגימה וכן תנאים הדגירה תקבע אם נוזלים נוספים יש להוסיף על ידי משתמש הקצה.
באיור 1. דלדול החמצן של התקשורת כלי תאים סטנדרטיים תרבות. האיור מציג את הירידה מ"ג / ליטר של חמצן ברמה של התאים על פני 3 ימים.
איור 2. שיפוע החמצן התקשורת כלי תאים סטנדרטיים תרבות. האיור מציג את מ"ג / ליטר של חמצן הוא הגדול ביותר בכל אמצעי התקשורת לצומת אמיץ מאשר בכל שכבת התאים.
איור 3. אחוז החמצן בחלל קנה הנשימה של HYPERStack במהלך גדילת התאים. הנתון מראה כי מעל 96 שעות, אחוז חמצן בין השכבות, המספקת כל תחתית חדיר גז הסרט, נשאר קבוע. זה מדגים את היכולת של התאים כדי לגשת חמצן במהלך הצמיחה confluency.
Discussion
כלי HYPERStack בהצלחה צמח מהונדסים, בתאי גזע ראשוניים. התוספות נוזל לתוך כלי נערכו באמצעות חיבורי שקית aseptic ידי להאכיל הכבידה גם על ידי שאיבה ממיכל התקשורת סטרילית. הכלי מספק עלייה של יותר מ 2.5 באזור גידול לעומת מוצר צלחת מוערמים של תפוסת נפח זהה. HYPERStack 6000-12 יש 2 ס"מ צמיחה באזור, HYPERStack-36 יש 18,000 2 ס"מ באזור צמיחה, ואת HYPERStack-120 יש 60,000 2 ס"מ של אזור הגידול. על ידי הגדלת שטח הפנים, משתמשים יכולים לייצר תאים יותר מן האוכלוסייה תא הרבה זהה או להפחית השתנות. הם גם מסוגלים לשמור מרחב / או באמצעות כלי עבודה פחות כדי להשיג את פלט התא אותו, או להגדיל את התפוקה התא מבלי להוסיף אנשים, סוויטות חדר נקי, או חממות. המערכת מיוצרת בשיטות הרכבה נמוכה חלקיקים ללא שימוש בדבקים. זוהי מערכת סגורה אשר preassembled עם ערכות ומסננים צינורות, שקיות משולשת ובתנאי סטרילית.
Disclosures
הגז כלי HYPERStack טכנולוגיה חדיר מכוסה תחת פטנט אמריקאי #: 7745209. הכותבים הם עובדי קורנינג מדעי החיים, Inc המייצרת את המכשיר משמש במאמר זה.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות Lonza Walkersville על עזרתם עם ידע מערכת סגורה, עיצוב שקית, הלוואה של חומרי איטום תיק רתכים, כמו גם יצירת התיק שרטוטים HYPERStack.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 1350ml media + 150ml serum (if required) |
| 4.0L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 3600ml media + 400ml serum (if required) |
| HYPERStack Vessel-12 | Corning | 10012 | |
| HYPERStack Vessel-36 | Corning | 10036 | |
| Filling Wedge | Corning | 10040 | |
| Stack Manipulator | Corning | TBD | |
| HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device | Hyclone | SH3B0324.01 | |
| 600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM) | Lonza Inc. | TBD | |
| 600ml Cell Dissociation Solution | Lonza Inc. | TBD |
