가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

Summary

기술, 프로토콜 및 높은 수율 자기편 세포 배양에 사용되는 코닝 HYPERStack의 선박 및 액세서리의 취급에 소개. 프로토콜은 현재의 스택 플레이트 제품 이상 증가 세포 수확에 대한 폐쇄 시스템 선박을 사용하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

대량 자기편 세포 배양은 microcarrier 비즈가 최적의 선택이 아닐 때 현재 스택 플레이트 세포 성장 제품을 표준화합니다. HYPERStack 선박은 현재 스택 플레이트 제품 폐쇄 시스템 규모를 허용하고 동일한 용적의 면적에> 2.5X 더 많은 세포를 제공합니다. HYPERStack 선박 가스 교환이 발생할 수 있습니다 기체 투과 자료를 통해 기능은, 따라서 선박 내에서 내부 헤드 스페이스에 대한 필요가 없습니다. 헤드 스페이스의 제거는 세포 성장이 최소화 될 발생하는 구획이 동일한 체적의 풋프린트 내에서 세포 성장 표면 영역의 많은 레이어를 수 있도록 공간을 줄일 수 있습니다.

이러한 세포 치료 또는 예방 접종 생산 많은 어플 리케이션을 위해, 폐쇄 시스템은 세포 성장과 수확이 필요합니다. HYPERStack 선박 미디어 가방 또는 기타 방법으로 튜브를 통해 세포 및 시약뿐만 아니라 및 제거 가능합니다.

이 프로토콜은 세포, 폐쇄 시스템 세포의 성장 프로토콜, 다양한 수확 방법의 대사 요구를 충족하기 위해 HYPERStack의 선박, 가스 확산 결과에 사용되는 가스 투과 물질 뒤에 기술을 설명합니다.

Protocol

1. HYPERStack 용기 - 가스 투과 재료 기술 배경

1. HYPERStack 우주선은 세포의 대사에 대한 76.2micron 가스 침투성 폴리머 필름을 통해 가스 교환에 의존 세포의 폐쇄 시스템 culturing위한 multilayered 함선입니다.
2. HYPERStack 선박은 선박 내부의 세포 위에 "헤드 스페이스"를하지 않는 더 많은 전통적인 세포 배양 용기에서 다릅니다. 오히려 선박 내의 가스 교환이 "상부"를 포함하는보다, 가스 투과 제품은 대기 개방 각 문화 챔버 아래에 공기 공간 ( "tracheal"공백으로 함)합니다.
3. 이 tracheal 공간 상응하는 가스 교환을하기 위해 선박의 각 세포 배양 구획에 성장 세포 수 있습니다.
4. 가스 투과 필름은 멸균 환경을 유지하면서 가스 교환이 발생할 수 있습니다. 여러 레이어의 각각에 대해 모든 유체 조작은 단일 입력 포트를 통해 발생합니다.

2. HYPERStack 선박 구성 요소 요약

1. Stackette는 상단 플레이트 및 가스 투과 필름으로 구성되어 있습니다 각각의 세포 배양 구획이다. 세포는이 구역 내에 양식입니다.
2. 액체 매니폴드는 HYPERStack 모듈 내에서 함께 12 stackette 레이어 각각 연결합니다. 모듈 12 레이어의 배수에서 혈관 형성 튜브와 연결됩니다. 매니폴드는 사용자가 전체 선박 한 유체 조작을 할 수 있습니다.
3. 에어 매니폴드도 함께 stackette 레이어를 연결하지만 유체 추가가 발생할 때 혈관에서 공기를 치환하는 데 사용됩니다. 그것은 충전하는 동안 사용할 수있는 입력 줄이 포함되어 있습니다.
4. Tracheal 공간 가스 교환은 각 레이어 '가스 투과 필름을 통해 발생할 수 있도록, 각 stackette 레이어 사이의 야외 공간입니다.
5. 액체 처리 튜브는 액체 연료에 연결된 모든 폐쇄 시스템 유체 조작을하는 데 사용됩니다. 이 구성 요소는 사용자 정의할 수 있습니다.
6. 벤트 튜브는 공기 매니폴드에 연결된 공기 필터를 포함하고 불임을 유지하면서 과잉 공기를 공개하는 데 사용됩니다.
7. 체이스 튜브는 필터와 클램프를 가지고 있으며 액체 처리 튜브에 연결되어 있으며, 혈관을 기입 후 액체 처리 튜브에서 유체 대피하는 데 사용됩니다.
8. 코닝 스택 조작하는 사람 또는 CSM 사용시 올바른 위치에있는 혈관을 배치 지원하는 처리 장치입니다.
9. 필링 웨지는 스테인레스 스틸 수동 HYPERStack 혈관을 작성 때 사용 지원됩니다.

3. HYPERStack 선박에서 사용되는 가스 투과 필름을 통해 가스 확산 결과

1. 통풍 헤드 스페이스 전통적인 세포의 성장 시스템에서 미디어에있는 산소는 문화 3 일 50 % 이상의 평균 소진됩니다. (그림 1)
2. 같은 세포 성장 시스템에서 미디어의 3mm 높이의 산소 기울기는 셀 계층에서보다 상부 접합에 언론에 거의 50% 큽니다. (그림 2)
3. 76.2micron 가스 투과 폴리스티렌 필름을 통해 산소의 확산은 미디어의 2.6mm 통해 확산 같습니다. HYPERStack 선박에 사용되는 가스 투과 필름은 가스 교환이 셀 계층에서 발생 할 수 있습니다.
4. 세포 합류로 성장할로 HYPERStack 선박의 tracheal 공간에 산소의 %는 상수이다. (그림 3)

4. 미디어 가방 준비

1. HYPERStack - 12 계층 우주선 미디어 1.3L 소요되며 HYPERStack - 36 계층 우주선 미디어 3.9L 걸립니다.
2. 전에 체포 미디어를 inoculating하는 혈청은 사용할 수있다면, 튜브는 미디어 가방에 혈청 가방 용접 철저히 섞는다.
3. 큰 가방의 클램프를 사용하여 봉투에 미디어의 약 300 ML를 고정. 이것은 모든 주사 세포 입력하고 아무도 미디어 가방에 남아 없습니다 중에 사용되도록합니다. 가방 스탠드에 플레이스 미디어 가방.

5. Inoculating 미디어

1. 세포 현탁액와 연결된 튜브와 주사기를 입력합니다. 미디어 가방에 세포 현탁액을 포함하는 주사기에서 튜브 용접 3 / 16 "튜브.
2. 미디어 가방에 세포 현탁액을 주사 잘 섞는다.

6. 프로 시저 작성

1. 튜브는 HYPERStack 우주선의 3 / 8 "액체 취급 튜브. (연결 무균 또는 다목적 (MPCs) 연결을 사용하여, 당신이 또한 선박에 미디어 가방을 연결할 수)에 주사 미디어 가방 용접.
2. HYPERStack에 액체 처리 및 추적 튜브에 클램프를 닫습니다.
3. 후크 환기 필터 튜브 CSM에있는 지주 클램프로, 부하 위치에 CSM에 HYPERStack 36 레이어 선박 놓으십시오. 뚜껑을 조여하여 입력 위치로 CSM 이동합니다. 정확한 입력 위치로 혈관을 넣어, 공기 필터는 채우기 작업 중에 젖음 방지를 위해 최상의 위치에 지금있다. 10 ° 각도 허용 equilibr작성 중에 레이어에 액체 에이션. 작성 쐐기에 미치는 측면에 배치 HYPERStack - 12 계층 우주선이 작성을위한 올바른 위치에 있습니다.
4. HYPERStack 우주선 (높은 아님)과 같은 수준에서 가방을 위치하여 입력 라인에서 맑은 공기. 추적 튜브 클램프가 닫힌 상​​태로 유지하고, 혈관을 입력 유체 수 있도록 액체 처리 튜브 클램프 및 미디어 가방 클램프를 엽니다.
5. 가방 스탠드를 사용하여 선박에 세포 현탁액의 흐름을 돕기 위해 미디어 가방을 올립니다.
6. 주사 미디어의 모든 혈관을 입력 때까지 용기를 채우, 미디어의 300 ML은 여전히​​ 미디어 가방의 상단 부분에 유지됩니다. 혈관을 작성 계속 미디어 가방에서 클램프를 제거합니다. 액체는 상부 공기 매니폴드를 접근으로 작성을 통해 방지하기 위해 미디어 가방을 낮추는 방법으로 채우기 속도를 느리게. 천천히 채워 줄 수있는 액체 레벨을 가지고 있으며 액체 처리 튜빙을 클램프.

7. 레이어로 액체를 잠글 수 절연 절차

1. manifolds 두 세트가 가장 높은 위치에 있으므로 절연 위치로 CSM에 HYPERStack 선박을 지참하고 선박의 높이 아래 미디어 가방을 낮추십시오. HYPERStack - 12 레이어 선박은 선박의 측면에 손을 넣어하고 충전 쐐기를 리프트에 다른 사용하여 격리 위치로 해제하실 수 있습니다.
2. 직립 자세에서 열린 체이스 필터, 더 체이스 튜브 클램프를 엽니다. 이것은 미디어 가방에 다시 액체 처리 튜브 미디어를 비어 있거나 추적합니다. 튜브가 비어되면, 미디어 가방 튜빙의 클램프를 닫습니다.
3. 수직 위치에 추적 튜브 필터를 유지, 남은 액체는 용기에 입력하고 평형 수 있도록 HYPERStack에있는 액체 처리 튜브에 클램프를 엽니다. 이 발생 1-2 분 동안 기다리십시오.
4. manifolds이 왼쪽에 있도록 CSM에 HYPERStack 선박을 돌립니다. CSM의 부하 위치로 함선을 낮춥니다. 왼쪽으로 약간 HYPEStack - 12 레이어 혈관을 로킹하면 충전 쐐기의 제거를 허용합니다. 추적 및 액체 처리 튜브 모두에​​서 클램프를 닫습니다.
5. 미디어 가방 이제 선박에서 제거되었거나 그것은 나중에 수확 절차에 사용하기 위해 첨부된 남아있을 수 있습니다. 첨부된 미디어 가방을 저장하려면 HYPERStack 선박의 저장 트레이에 유지 밴드 아래 빈 가방과 가방에 남아있는 미디어 및 장소 롤.
6. 인큐베이터에 HYPERStack 용기를 이동합니다. 선박 관리를 나르는 때 공기 필터를 입력부터 액체 유지로 이동해야합니다. 이것은 약간 위쪽으로 HYPERStack의 매니폴드 끝을 팁하여 수행됩니다.

8. 수확 프로토콜

1. 수확 절차를 시작하려면 튜브는 수확 가방 어셈블리를 형성하기 위해 함께 세포 분리 솔루션과 담금질 가방을 용접. 모든 튜브 클램프이 닫힌 확인하십시오. (설명하기 만화를 사용)
2. 인큐베이터에서 H​​YPERStack 선박을 제거, 유지 밴드 아래에서 미디어 가방 출시하고, 가방 스탠드 만요. 부하 위치에 CSM에있는 혈관을 장소와 선박을 확보하기 위해 뚜껑을 조입니다. 지주 클램프에 환기 튜빙을 연결하여 입력 위치로 CSM 이동합니다.
3. 미디어 가방 관 그리고 미디어 첨부된 가방 흘러 수 있도록 선박의 액체 처리 튜브에 클램프를 열고, 가방 스탠드에있는 미디어 가방이 HYPERStack보다 낮은 걸려 있는지 확인 만들기.
4. 일단 혈관이 약 어 비어, 최종 빈 위치에 CSM 설정을 변경합니다. HYPERStack의 선박 및 액체 처리 튜브가 비어있는 경우 보낸 미디어 가방 튜브에 클램프 과거 미디어를 추적하기 위해 튜브를 들고 다음 액체 처리 튜브에 클램프 및 지출 미디어 가방 튜브에 클램프를 모두 닫습니다.
5. 튜브 용접에 의해 수확 가방 어셈블리와 함께 보낸 미디어 가방 교체하고 가방 스탠드를 사용하여 HYPERStack의 높이 위의 세포 분리 가방 조립의 높이를 올립니다.
6. 평균의 위치에 CSM를 놓습니다. 세포 분리 솔루션 관 HYPERStack에 솔루션을 클램프 및 전송 엽니다. 전송이 완료되면, 액체 처리 튜브 및 전지 분리 솔루션 튜브에 클램프를 닫습니다.
7. 부하 위치에 CSM을 가져와. 수평 위치 레버 열고으로 부드럽게 세포 레이어를 통해 솔루션을 배포, 바퀴를 사용하는쪽으로 선박 쪽 바위. 배는 가끔 솔루션의 동등한 분배를 유지하기 위해 락을 동안 평균 위치로 제공될 수 있습니다. 그것은 레이어가 완전히 코팅하는 시각 나타나지 않을 수도 있지만, 해리 솔루션은 균등 세포의 표면에 걸쳐 배포됩니다. 솔루션 적절하게 배포되면, 부하 위치에 HYPERStack을 잠글 수있는 CSM에있는 레버를 놓습니다. 이 위치에 HYPERStack를 남겨주세요당신의 세포에 필요한 분리 시간 동안.
8. 일단 세포가 분리가, 가이드로 탁도를 사용하여 평균 위치에 CSM 이동합니다. 치료는 이상 세포를 소화하지 않도록해야합니다. 담금질 미디어 선박을 입력 수 있도록 담금질 가방 클램프 및 HYPERStack 액체 처리 튜브 클램프를 엽니다. 전송이 완료되면 HYPERStack 액체 처리 튜브에 클램프를 닫습니다.
9. 부하 위치에 CSM을 반환하고 측면에 선박쪽으로 문제를 일으키고 수평 위치 레버를 잡아.
10. 가방 스탠드를 사용하여 HYPERStack의 수준 아래의 수확 가방 어셈블리의 위치를​​ 낮춥니다. 선박 액체 처리 관은 끄지 가방에 다시 셀 솔루션을 클램프 및 전송 열고, 빈 위치로 CSM을 조정합니다. 부하 위치에 CSM을 반환하고 튜브 실러를 사용하여 선박에서 수확 가방 어셈블리를 분리합니다. 세포 솔루션은 처리를위한 준비가 된 것입니다.

9. 대표 결과

• 시간을 수확하면 가스 투과 폴리스티렌 표면에 표준 폴리스티렌 표면에서 변환시 최적화해야합니다. 세포는 HYPERStack 제품에 빠르게 출시하는 경향이있다.
• 현미경으로 세포를 볼 수있는 통풍구와 액체 처리 튜브가 해제 고정되어 있어야합니다. manifolds는 현미경의 무대에서, 아래 방향으로 거꾸로 HYPERStack 용기를 놓습니다.
• 예방 단계는 그들이 작동을 중지하게됩니다 사용하는 동안 필터를 젖음 방지로 이동하실 수 있습니다. 안으로 HYPERStack 선박을 입력하고 클램프가 열려있을 때 통풍구와 체이스 튜브가 고가 유지를 통해, 더 젖음가 발생해서는 안됩니다.
• 튜브의 폐쇄 클램프의 압력은 클램프가 열린 후 그것이 닫힌 상​​태로됩니다. 반대 방향으로 튜브를 곤란하게하는 것은 그것을 열립니다.
• 입력 및 중력 피드를 통해 HYPERStack 선박을 종료 미디어 흐름 시간은 HYPERStack 선박 미디어의 최상위 수준과 미디어 컨테이너 미디어의 최상위 레벨 사이의 미디어 높이 차이에 따라 달라집니다. 큰 거리, 흐름을 빠르게. 최대 유량은 1.5L/min하는 필터의 평가에 의해 제한됩니다.
• HYPERStack 선박에 적절한 입력 볼륨을 유지하면 세포 성장 챔버의 공기 방울 형성​​을 방지할 수 있습니다. 공기 방울은 샘플링이나 증발 물의 손실로 인해 unhumidified 환경에서 잠복기로 인해 발생할 수 있습니다. 추가 유체는 최종 사용자가 추가되어야하는 경우뿐만 아니라 배양 조건으로 샘플링 금액 및 주파수 결정됩니다.

그림 1. 표준 세포 배양 용기에서 미디어의 산소 고갈. 그림 3 일 동안 세포의 수준에 MG / L 산소의 감소를 보여줍니다.

그림 2. 표준 세포 배양 용기에서 미디어에 산소 기울기. 그림은 산소의 MG / L은 셀 계층에서보다 상부 교차로에 미디어에서 가장 큰 것입니다 보여줍니다.

그림 3. 세포 성장 동안 HYPERStack의 tracheal 공간에 산소의 비율입니다. 그림 96 시간 이상, 각 기체 투과 필름 바닥을 공급 레이어 사이에 산소의 비율은, 지속적인 유지 보여줍니다. 이것은 confluency로 성장하는 동안 산소를 액세스하는 세포의 능력을 보여줍니다.

Discussion

HYPERStack의 우주선이 성공적으로 성장, 기본 및 줄기 세포를 설계했습니다. 그릇에 액체를 첨가가 중력에 의해 공급하며 또한 살균 미디어 컨테이너에서 펌핑하여 무균 가방 연결을 통해 실시되었다. 혈관 성장 지역의 이상 증가 2.5X 대 같은 체적 면적의 스택 플레이트 제품을 제공합니다. HYPERStack - 12 ^6천cm이 성장 지역, HYPERStack - 36이 ^{1만8천cm이} 성장 지역 및 HYPERStack - 120 성장 지역의 ^{6만cm이 있습니다.있다} 표면적을 증가함으로써, 사용자는 동일한 세포 인구 또는 많은에서 더 많은 세포를 생산하고 다양성을 줄일 수 있습니다. 그들은 또한 동일한 셀 출력을 달성하거나, 사람, 청정실 스위트 또는 incubators을 추가하지 않고 셀 출력을 높이기 위해 적은 혈관을 사용하여 공간 및 / 또는 노동을 저장할 수 있습니다. 시스템은 낮은 입자 조립 방법과 접착제를 사용하지 않고 생산됩니다. 그것은 삼중 체포 및 살균 제공 튜브 세트 및 필터와 preassembled되는 폐쇄 시스템입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	1350ml media + 150ml serum (if required)
4.0L Bagged Media	Lonza Inc.	TBD	3600ml media + 400ml serum (if required)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	Lonza Inc.	TBD