Summary
介绍到高产贴壁细胞培养使用康宁HYPERStack船只及配件的技术，协议和处理。该协议将展示如何使用目前的叠板产品的封闭系统中增加细胞收集船只。
Abstract
大容量的贴壁细胞培养目前叠板细胞生长产品的标准化，微载体珠时，是不是最佳的选择。 HYPERStack船只允许关闭系统的规模从目前的叠板产品，并提供在相同体积的足迹> 2.5X更多的细胞。 HYPERStack船只通过透气性材料，使气体交换发生的功能，从而消除了需要在容器内部的顶空。顶空消除允许发生在细胞的生长，以尽量减少车厢，以减少空间，允许在相同的体积占用更多层细胞生长表面积。
对于许多应用中，如细胞疗法或疫苗生产，需要一个封闭的系统是细胞生长和收获。 HYPERStack船只允许细胞和试剂除了通过媒体袋或其他方法从油管和清除。
该协议将解释背后的透氧性材料，用于在HYPERStack船只，气体扩散的结果细胞，封闭的系统细胞生长的协议，以及各种采伐方式，以满足代谢的需要的技术。
Protocol
1。 HYPERStack容器 - 透氧材料技术背景
- HYPERStack容器是一个封闭的系统依赖通过76.2micron透气性聚合物薄膜对气体交换细胞代谢，细胞培养多层次的船只。
- HYPERStack船只不同于更传统的细胞培养容器中，它并没有上述容器内的细胞有一个“顶空”。而不是包含这个“顶空”内船只的气体交换，透氧产品空气空间（简称为“气管”空间），这是开放的气氛下每个文化室。
- 这气管的空间，使细胞中每个细胞培养室的船只越来越多，具有同等的气体交换。
- 透氧膜，使气体交换发生，同时保持无菌的环境。发生多层次的所有的流体操作通过一个单一的入口端口。
2。 HYPERStack容器组件摘要
- Stackette是个别的细胞培养室，是顶板和透氧膜。这些细胞是培养在这个车厢。
- 液体流形连接12 stackette层内HYPERStack模块。模块与油管连接，形成12层的倍数的船只。多方面的，允许用户在一个流体操纵整个船只。
- stackette层空气歧管连接在一起，但它用来替代容器内的空气流体增加发生时。它包含了在填充过程中使用的填充线。
- 气管空间是每个stackette层之间的开放领空，允许通过各层的透氧膜的气体交换发生。
- 液体处理管连接到液体流形，是用来做全封闭系统的流体操作。此组件可定制。
- 排气管连接到空气歧管，包含一个空气过滤器，是用来释放多余的空气，同时保持无菌。
- 追逐管有一个过滤器，夹具和连接到液体处理管和用于疏散的流体从液体处理管充填后的船只。
- 康宁堆栈机械手或CSM是一个处理设备，以协助配售的船只在使用过程中的正确位置。
- 灌装楔形是一个不锈钢协助使用时手动灌装HYPERStack船只。
3。使用的HYPERStack船只通过透氧膜的气体扩散结果
- 在传统的细胞增长系统，通风顶空，在媒体中的氧气耗尽平均50％的，超过3天的文化。 （图1）
- 在同一细胞的生长系统，在一个3mm的媒体高度氧气梯度是在媒体几乎50％的顶空交界处，比它在细胞层。 （图2）
- 通过76.2micron透氧性聚苯乙烯薄膜的氧气的扩散是平等通过媒体2.6毫米的传播。透氧膜在HYPERStack船只的使用，使气体交换发生在细胞层。
- HYPERStack船只的气管空间中的氧气％保持不变，细胞生长至汇合。 （图3）
4。媒体编制袋
- HYPERStack - 12层容器媒体1.3L，HYPERStack - 36层容器媒体3.9L。
- 您的袋装媒体接种之前，如果血清是用于，管焊接血清袋媒体包调匀。
- 在使用袋大袋夹，钳断约300毫升媒体。这将确保所有接种细胞在填充过程中，并没有在媒体包的剩余使用。当地媒体袋袋上的立场。
5。接种媒体
- 与连接管细胞悬液填充注射器。管焊接3 / 16“管含有细胞悬液媒体包注射器。
- 媒体袋注入细胞悬液，拌匀。
6。填写程序
- 管焊接接种的媒体袋HYPERStack船只的3 / 8“液体处理管（使用无菌连接或多用途连接器（MPC），你也可以附加媒体包船只）。
- 关闭液体处理和上HYPERStack追逐管夹具。
- HYPERStack 36层容器放入负载位置的CSM;钩到夹具上的CSM发泄过滤管。拧紧盖子，填充的位置和移动的CSM。把正确的填写位置的船只;空气过滤器是在最高的位置，以防止在填充操作的润湿。 10 °角的许可证equilibr在灌装液体层ATION。 HYPERStack - 12层的船只在其一侧放置在灌装楔形是在正确的位置填补。
- 清除空气填充线，定位在同一水平HYPERStack船（不高于）袋。保持追逐管钳封闭;打开液体处理管钳和媒体包钳，让液体进入船只。
- 使用袋立场，提高媒体包，以帮助入血管的细胞悬液流。
- 填写船只，直到所有的接种媒体进入血管; 300毫升的媒体仍然在媒体包的顶端部分。从媒体包中取出钳继续填写船只。由于液体接近上层的空气歧管，减慢填充率降低媒体包，以防止过度充盈。慢慢提起液位填充线和液体处理管钳。
7。分离过程中，锁定到图层的液体
- 两套歧管带来的隔离位置的CSM HYPERStack船只，所以在最高的位置，和媒体包以下的船只的高度降低。 HYPERStack - 12层容器，可以解除隔离位置放在一侧的船只上的一只手和使用其他解除填充楔形。
- 在直立位置举行的追逐过滤器，打开追逐管钳。这将空或追在液体处理管媒体到媒体包。一旦管子是空的，密切的媒体袋管钳。
- 追逐管过滤器在直立位置，打开HYPERStack钳允许任何剩余的液体进入并在平衡的船只上的液体处理管。等待1-2分钟，出现这种情况。
- 在CSM使歧管在左边打开HYPERStack船只。降低负载位置上的CSM船只。稍微向左摇动HYPEStack - 12层容器将允许拆除填充楔形。关闭追逐和液体处理管夹具。
- 媒体包现在可以从容器中删除，或它可能会保持在收获过程中使用附后。要存储媒体的附加袋，空袋囊中任何剩余的媒体，并放置卷下HYPERStack船只的存储托盘固定乐队。
- 移动HYPERStack船只的孵化器。运载船只护理时，应采取保持进风口过滤器的液体。这是通过引爆的HYPERStack多方面的结束稍向上。
8。收获协议
- 要开始收获的过程，焊缝管的细胞分解的解决方案和淬火袋共同形式的采伐袋大会。确保关闭所有管夹。 （卡通证明）
- HYPERStack船只从孵化器中取出，释放的保留频段下的媒体包，挂在袋的立场。放置在负载位置的CSM的船只，并拧紧盖子，以确保船只。钩到夹具的通风管和填充位置移动的CSM。
- 确保包装袋上的立场的媒体包挂低于该HYPERStack;开放媒体包油管钳和船只的液体处理油管允许媒体的附袋流入。
- 一旦船只约¾空，改变CSM设置到最后的空位置。当HYPERStack船只和液体处理管是空的，解除管追过去媒体上所花的媒体袋管钳，然后关闭液体处理管钳和上花的媒体袋管钳。
- 管焊接的收获袋大会更换花的媒体袋，并提高细胞分解袋以上的HYPERStack使用袋立场的高度装配的高度。
- 将在平衡位置的CSM。打开细胞解离液管钳，并转入HYPERStack解决方案。当传输完成后，关闭液体处理管和细胞分解解决方案油管上的夹子。
- 将CSM的负载位置。控股横向定位杆打开，轻轻摇动的船侧方使用的轮，分布在细胞层的解决方案。船只可能偶尔会返回到平衡位置，在摇晃的解决方案保持平等分配。它可能不是直观明显，完全包覆层，但同样的解离解决方案将整个细胞表面分布。一旦解决方案已被充分分布，对CSM发布的杠杆锁定在负载位置HYPERStack。留在这个位置上的HYPERStack在解离所需的时间为您的细胞。
- 一旦细胞分离;使用浊度为指导，CSM的平衡位置移动。应注意不要过度消化细胞。打开淬火袋钳和HYPERStack液体处理管钳，允许淬火介质进入船只。一旦传输完成关闭HYPERStack液体处理管钳。
- 在CSM返回到负载的位置，并保持横向定位杆，岩石的船只一边到另一边。
- 使用袋立场，降低收获袋大会HYPERStack水平以下的位置。调整CSM的空位置，打开船只的液体处理管钳和淬火袋转移到细胞溶液。 CSM的负载位置和管封口机使用的船只，从断开的收获袋大会。电池解决方案是准备进行处理。
9。代表性的成果
- 收获时间，需要优化时，从一个标准的聚苯乙烯表面转换的透氧性聚苯乙烯表面。细胞倾向于对HYPERStack产品释放得更快。
- 要查看在显微镜下观察细胞的宣泄和液体处理管需要被夹住了。倒挂，与歧管朝下显微镜舞台上，将HYPERStack船只。
- 预防可以采取措施，以避免在使用过程中的润湿过滤器，这将导致他们停止运转。不超过填补HYPERStack船只和高架发泄和大通管夹打开时，没有湿润应该发生。
- 管封闭夹具的压力，使其保持关闭后夹打开。捏在相反的方向管会打开它。
- 媒体流通过重力饲料HYPERStack船只进入和退出的时间是基于媒体的高度差之间的媒介在HYPERStack船的顶层和顶级的媒体容器中的介质。更大的距离，流动的速度就越快。最大流量是有限的过滤器，以1.5L/min的评级。
- 在HYPERStack船保持合适的灌装量，将防止空气泡沫细胞生长室形成。气泡可能是由于取样或孵化unhumidified环境因蒸发失水。采样数量和频率，以及孵化条件，将决定应当由最终用户增加额外的流体。
图1：媒体在一个标准的细胞培养容器的氧气耗尽。该图显示了氧的毫克/大号超过3天的细胞水平下降。
图2：在一个标准的细胞培养容器的媒体氧梯度。该图显示了氧的毫克/ L是最大的媒体不是在细胞层顶空交叉点。
图3。氧气在细胞生长的HYPERStack气管空间的百分比。的数字显示，超过96小时，各层之间的比例的氧气，提供每个透氧膜的底部，保持不变。这表明细胞的能力，在生长过程中的氧气，以汇合访问。
Discussion
HYPERStack船只已成功地成长工程，小学和干细胞。通过无菌袋连接液添加到船只已进行吊瓶，还从无菌媒体容器中抽水。容器提供了一个增长领域增加了2.5倍大于对叠板产品的相同容积的足迹。 HYPERStack - 12 6,000平方厘米的增长领域，HYPERStack - 36有18000平方厘米的增长领域，并HYPERStack - 120 60,000厘米的增长领域2。通过增加表面积，用户能够产生更多的细胞相同的细胞群或很多，并减少变异。他们还可以通过使用更少的船只来达到同样的电池的输出，或增加电池的输出，没有加入的人，洁净室套房，或孵化器，以节省空间和/或劳动。该系统是生产低颗粒的装配方法，不使用粘合剂。它是一个封闭的系统，这是预装管套和过滤器，三合一袋装和提供无菌。
Disclosures
根据美国专利号：7745209 HYPERStack容器透氧技术覆盖。作者康宁生命科学部，公司的生产在这篇文章中使用的仪器的员工。
Acknowledgments
作者想感谢龙沙Walkersville协助封闭的系统知识，包设计，袋封口机和焊工的贷款，以及创造袋HYPERStack电路图。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 1350ml media + 150ml serum (if required) |
| 4.0L Bagged Media | Lonza Inc. | TBD | 3600ml media + 400ml serum (if required) |
| HYPERStack Vessel-12 | Corning | 10012 | |
| HYPERStack Vessel-36 | Corning | 10036 | |
| Filling Wedge | Corning | 10040 | |
| Stack Manipulator | Corning | TBD | |
| HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device | Hyclone | SH3B0324.01 | |
| 600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM) | Lonza Inc. | TBD | |
| 600ml Cell Dissociation Solution | Lonza Inc. | TBD |
