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Neuroscience

बहु इलेक्ट्रोड Neuronal हिमस्खलन के Organotypic संस्कृतियों में ऐरे रिकॉर्डिंग

Published: August 1, 2011 doi: 10.3791/2949
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Section on Critical Brain Dynamics, National Institute of Mental Health

Summary

Neuronal हिमस्खलन, यानी पैमाने अपरिवर्तनीय spatio-अस्थायी गतिविधि फटने, प्रांतस्था में महत्वपूर्ण राज्य की गतिशीलता का संकेत अध्ययन के लिए एक मजबूत तरीका है. हिमस्खलन सुसंस्कृत प्रांतस्था के ऊपरी परतों जो ठीक नियंत्रित शर्तों के तहत तलीय एकीकृत बहु इलेक्ट्रोड arrays (विदेश मंत्रालय) के साथ गतिविधि की लंबी अवधि के मापन के लिए अनुमति देता है विकसित करने में अनायास उभरने.

Protocol

1. बाँझ, विदेश मंत्रालय के साथ लंबी अवधि के रिकॉर्डिंग के लिए Sealable ग्लास चैंबर

  1. Teflon-प्लास्टिक (ऐस ग्लास), टोपी, सुरक्षित और तंग संस्कृति कक्ष बंद करने के लिए आवश्यक है, के साथ लड़ी पिरोया ग्लास सिलेंडर (Aceglass) काट रहे हैं धागा (छवि 1 ए, बी) के नीचे से लगभग 2 मिमी. (3x) पानी और 200 सबूत एथिल शराब में 5 मिनट के लिए उबलते के साथ rinsing द्वारा स्वच्छ कांच के छल्ले, शुष्क.
  2. विभाज्य सिलिकॉन समाधान के लिए विदेश मंत्रालय सतह कांच के छल्ले देते आवश्यकता है. एक और बी Sylgard 184 सिलिकॉन Elastomer किट की अच्छी तरह से जाने के लिए, 15 मिनट के लिए बैठने के लिए हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए, 1 मिलीलीटर aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान भागों के 15 मिलीलीटर मिक्स
  3. गोंद कांच विदेश मंत्रालय अंगूठी (8x8 ग्रिड w / आंतरिक जमीन इलेक्ट्रोड, 30 सुक्ष्ममापी इलेक्ट्रोड व्यास, चूहे / माउस के लिए 200/100 सुक्ष्ममापी दूरी अंतर इलेक्ट्रोड) (छवि 1 ए, बी). छोटे गेज सुई के साथ सिरिंज में सिलिकॉन के 1 मिलीलीटर (23 ° सी) ले लो. कांच की अंगूठी, बीच विदेश मंत्रालय पर कांच की अंगूठी, एक मजबूत मुहर के लिए अंगूठी के बाहर चारों ओर एक सिलिकॉन के एक अतिरिक्त परत लागू की unpolished कटौती की सतह के लिए सिलिकॉन लागू करने के लिए, 1 के लिए इलाज - 60 ~ ° गर्म थाली पर सी 2 बजे.
  4. विआयनीकृत जल में 3x कुल्ला 70% शराब के बाद एक लामिना का प्रवाह हुड में विदेश मंत्रालय के कक्ष और कक्ष टोपियां जीवाणुरहित (3 एक्स, के लिए पिछले शराब में 10 मिनट के लिए बैठते हैं कुल्ला) चैम्बर के 10 मिनट जोखिम और पराबैंगनी प्रकाश में टोपी इंटीरियर द्वारा पीछा किया . आटोक्लेव विदेश मंत्रालय के कक्ष (, गीला, 120 डिग्री सेल्सियस 45 मिनट) और शुष्क.
  5. संस्कृति कक्ष के अंदर कोट के साथ विदेश मंत्रालय सतह पाली - डी - lysine. नए meas, जो न lipophilic हैं दोहराया इलेक्ट्रोड की ग्रिड से समाधान की छोटी बूंद आकांक्षा द्वारा कोट. Meas के लिए प्रयोग किया जाता है, समाधान के साथ चैम्बर नीचे कवर करने के लिए, अतिरिक्त तरल aspirate, लामिना हुड के अंदर बाँझ शर्तों के तहत लुप्त हो जाना अनुमति है. टोपी संलग्न करने के लिए भंडारण और भविष्य के उपयोग के के लिए विदेश मंत्रालय के कक्ष सील.

2. तैयारी और Organotypic संस्कृतियों के विकास के लिए आवश्यक तत्व

  1. 0.9% NaCl में बाँझ अगर भंग, बाँझ पेट्री डिश (फाल्कन, 100 x15, ~ 5 मिमी स्तर) में डालना, ठंडा, और भंडारण के लिए Parafilm साथ बाँझ लपेटो. 20 x 10 x 5 उपयोग के लिए ठोस अगर मिमी ब्लॉक कट.
  2. स्टोर सुपर गोंद, जैसे Devcon सुपर गोंद द्वितीय पैकेजिंग के साथ, नीचे 70% EtOH साथ लामिना का प्रवाह हुड के अंदर खोलने, बाँझपन के संरक्षण से पहले मिटा दिया है.
  3. 50% डी ग्लूकोज (सिग्मा अल्ट्रा, G7528) de-ionized संस्कृति पानी (सिग्मा) के 40 मिलीलीटर के लिए ग्लूकोज के 40 ग्राम जोड़कर तैयार करें. 2 मिलीलीटर aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  4. Gey बैलेंस्ड नमक समाधान के 500 मिलीलीटर के लिए 50% ग्लूकोज डी 4 मिलीलीटर जोड़ें, और उपयोग करने से पहले फ्रीजर में कीचड़ (तरल / बर्फ क्रिस्टल का मिश्रण) करने के लिए ठंडा.
  5. Reconstitute 5 मिलीलीटर संस्कृति de-ionized पानी (कोमल हिला, बुलबुले के गठन से बचने के) में चिकन प्लाज्मा चलो, समाधान के लिए 5 बसा - 10 मिनट, धीरे ज़ुल्फ़, और एक बाँझ पेट्री डिश में स्पष्ट सामग्री decantate. बाँझ फिल्टर (0.22 सुक्ष्ममापी ताकना फिल्टर, प्रोटीन) -20 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मा समाधान, विभाज्य cryotubes में 350 μl (NuncTM), स्टोर
  6. तदनुसार, (0.22 सुक्ष्ममापी ताकना फिल्टर) बाँझ फिल्टर, विभाज्य cryotubes में 40 μl (NuncTM) गोजातीय प्लाज्मा से reconstitute थ्रोम्बिन, -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान समाधान के लिए काम कर, Gey संतुलित नमक समाधान w / डी - ग्लूकोज की 375 μl में थ्रोम्बिन समाधान के 40 μl पतला.
  7. घोड़े सीरम, 200 मिलीग्राम बेसल मध्यम ईगल, 100 मिलीलीटर हांक buffered खारा समाधान के लिए जो 50% ग्लूकोज और 200 मिमी एल glutamine 2 मिलीलीटर के 4 मिलीलीटर जोड़ रहे हैं के 100 मिलीलीटर का मिश्रण करके मध्यम संस्कृति के 400 मिलीलीटर की तैयारी. 4 में 8 सप्ताह 100 मिलीलीटर Pyrex बोतलों में डिग्री सेल्सियस - 4 संग्रहीत किया जा सकता
  8. 0.3 मिमी uridine, 0.3 मिमी ए आर ए सी साइटोसिन β-डी arabinofuranoside, और 0.3 मिमी 5-fluoro 2'- deoxyuridine, बाँझ फिल्टर, विभाज्य μl 200 और -20 ° सी में 6 के लिए दुकान के मिश्रण से तैयार पिंजरे का बँटवारा अवरोध करनेवाला - 12 महीने.

3. प्रांतस्था और ventral Tegmental क्षेत्र (VTA) ऊतक विच्छेदन (समय: <1hr)

  1. प्रक्रिया पैदावार प्रांतस्था और VTA ~ 12 चूहों या चूहों से सह संस्कृतियों, और बाँझ की शर्तों के तहत एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर तैयार के लिए ऊतक वर्गों. ऊतक संग्रह के लिए कुल समय 1 घंटे से अधिक होना चाहिए.
  2. 2 प्रसव के बाद दिन (PND) - 1, स्वस्थ, अच्छी तरह से मनुष्य पिल्ले (पेट दूध स्पॉट 'की उपस्थिति लिटर आकार ~ 10) ले लो. एक पिल्ला थूथन द्वारा धीरे से दबाए रखें, यह स्वतंत्र रूप से घूमने के लिए अनुमति है, और जल्दी से तेज कैंची के साथ गर्दन के आधार पर सिर काटना.
  3. मस्तिष्क हटाने के लिए, त्वचा को हटा दें (दो पार्श्व कैंची कटौती), ठीक आँख कैंची की (1 sagital midline कटौती, 1 प्रांतस्था में राज्याभिषेक कटौती / सेरिबैलम जंक्शन) के साथ खुला खोपड़ी में कटौती. सभी 4 खोपड़ी फ्लैप वापस फ्लिप. एक तेज रंग के साथ, घ्राण बल्ब के माध्यम से frontally कटौती, मस्तिष्क के नीचे caudally अग्रिम रंग. धीरे मस्तिष्क लिफ्ट खोपड़ी के बाहर और इसे बाँझ, ठंडा, तेजी से ठंडा और अस्थायी भंडारण के लिए Gey समाधान में स्लाइड. 3,3 3,2 कदम 2 अधिक दिमाग के लिए दोहराएँ (कुल समय: <20 मिनट).
  4. VTA प्राप्त करने के लिएऊतक, एक बाँझ, शुष्क पेट्री एक छोटा सा रंग का उपयोग पकवान पर दिमाग हस्तांतरण. इसके अलावा धीरे से प्रत्येक मस्तिष्क के बारे में 1 सेमी बग़ल में फिसलने से अधिक तरल पदार्थ को हटा दें. राज्याभिषेक, एक रेजर ब्लेड का उपयोग सेरिबैलम के स्तर पर खड़ी कटौती से मस्तिष्क स्टेम निकालें.
  5. गोंद प्रक्रिया टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान दिमाग के यांत्रिक स्थिरीकरण के लिए बढ़ते डिस्क पर अगर ब्लॉक. Superglue की एक पतली रेखा प्लेस डिस्क पर अगर ब्लॉक के सामने कुछ मिलीमीटर (अगर छू गोंद से बचने के लिए).
  6. हस्तांतरण एक छोटा सा रंग का उपयोग करना, और प्रत्येक मस्तिष्क माउंट करने के लिए, नीचे ललाट पोल. सुनिश्चित करें कि ललाट डंडे बढ़ते डिस्क से चिपके हैं और है कि वेंट्रल पक्षों किसी भी गोंद अवशेषों के बिना अगर स्पर्श क्रम में काटने और कटौती स्लाइस की आसान लिफ्ट बंद के दौरान उचित यांत्रिक स्थिरीकरण को प्राप्त करने
  7. ध्यान से और एक vibratome ट्रे में मस्तिष्क विधानसभा (जैसे VT1000 Leica) के साथ सुरक्षित बढ़ते डिस्क डूब बाँझ, ठंडा Gey समाधान के साथ भर दिया. एक सावधानी से साफ धार (90% EtOH) के साथ, उच्चतम कंपन आवृत्ति में midbrain के राज्याभिषेक स्लाइस में कटौती और अपेक्षाकृत कम 400 500 सुक्ष्ममापी की एक मोटाई पर आगे गति. चूषण बल्ब के साथ एक औंधा पाश्चर पिपेट का उपयोग हस्तांतरण, और 35 x 10 मिमी पेट्री बाँझ, ठंडा Gey समाधान से भरा बर्तन में VTA युक्त स्लाइस इकट्ठा (छवि 1C, भी राज्याभिषेक 18 प्लेट देखने के लिए E22 में 15 में 20).
  8. प्रांतस्था वर्गों के लिए, दोहराने कदम 3,2 - 3,6, लेकिन प्रांतस्था और सेरिबैलम के बीच खड़ी में कटौती लागू करने के लिए, और ललाट पोल के साथ forebrains ऊपर माउंट. 3 के बारे में राज्याभिषेक स्लाइस (350 सुक्ष्ममापी मोटाई) striatum के स्तर पर शुरू भविष्य प्रांतस्था विच्छेदन के लिए एकत्र होते हैं.
  9. टूट रेज़र ब्लेड से बना सूक्ष्म चाकू का प्रयोग, ~ 2 मिमी चौड़े ललाट प्रांतस्था और midbrain stereomicroscope तहत VTA (छवि 1C) युक्त क्षेत्रों के राज्याभिषेक अनुभाग काटना. छोटे बर्तन (जैसे कक्ष स्लाइड्स) ठंडा है Gey समाधान के साथ भर में ऊतक वर्गों अलग लीजिए.

4. विदेश मंत्रालय प्रांतस्था और VTA ऊतक स्लाइस बढ़ते (समय: <1 घंटा)

  1. विदेश मंत्रालय के ध्यान में इलेक्ट्रोड सरणी के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के अंतर्गत कमरे के तापमान पर स्थिति केंद्र स्वच्छ, धूल से मुक्त पर एक 25 प्लाज्मा की μl छोटी बूंद, और बाँझ इलेक्ट्रोड सरणी मैट्रिक्स. छोटे spatulae का प्रयोग, ध्यान से प्लाज्मा छोटी बूंद एक प्रांतस्था और VTA अनुभाग में स्लाइड.
  2. ठंडा प्लेस प्लेट पर विदेश मंत्रालय, refocus देखने ~ 15 एस के लिए ठंडा है, तो प्लाज्मा छोटी बूंद में थ्रोम्बिन के 25 μl जोड़ने. थ्रोम्बिन विंदुक टिप का उपयोग करना, ध्यान से विदेश मंत्रालय भर में छोटे परिपत्र आंदोलनों के साथ मिश्रण / प्लाज्मा थ्रोम्बिन फैल. भंगुर इलेक्ट्रोड सरणी सीधे मत छुओ. धीरे सरणी के दूसरे इलेक्ट्रोड पंक्ति के साथ पृष्ठीय बॉर्डर के साथ सरणी पर प्रांतस्था स्थिति. इस तरह, विकासशील सतही परतों अंततः सरणी के अनुस्मारक को कवर किया जाएगा. VTA प्रांतस्था अनुभाग के उदर सीमा (छवि 1D) करने के लिए आसन्न रखा गया है.
  3. कैप और शिथिल उच्च नमी बनाए रखने जबकि विदेश मंत्रालय / संस्कृति विधानसभा ~ हुड के अंदर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठता प्लाज्मा / थ्रोम्बिन जमावट के लिए अनुमति देने के लिए विदेश मंत्रालय के कक्ष बंद. 3 अधिक संस्कृतियों के लिए 4.3 इस बीच, 4.1 कदम दोहराएँ.
  4. ध्यान संस्कृति 25 x 5 / 8 सुई के साथ एक 1 सीसी सिरिंज का उपयोग कर कक्ष के छोटे बूंदों में मध्यम संस्कृति के 600 μl जोड़ने.
  5. कसकर बंद विदेश मंत्रालय के कक्ष और जगह विदेश मंत्रालय / इनक्यूबेटर (छवि 1B) के अंदर कमाल का भंडारण ट्रे पर संस्कृति विधानसभा. प्रक्रिया गति, 3 - 4 meas अतिव्यापी दृश्यों में इकट्ठा किया जा सकता. 12 meas के लिए विधानसभा के समय 1hr <होना चाहिए.
  6. इन विट्रो (DIV) में 2 दिनों के बाद, पिंजरे का बँटवारा अवरोध करनेवाला के 10 μl जोड़ें. 4 DIV पर 60% और उसके बाद हर चार दिनों से ताज़ा संस्कृति मीडिया.

5. Electrophysiological रिकॉर्डिंग और प्रोत्साहन पीढ़ी

  1. ~ 1 सप्ताह विदेश मंत्रालय के प्रत्येक इलेक्ट्रोड से 5,6 रिकॉर्ड ~ 10 मिनट के लिए 24 kHz पर सहज गतिविधि के बाद स्थानीय क्षेत्र (LFP) की क्षमता और न्यूरॉन्स की प्रवृत्ति कार्रवाई क्षमता आग में महत्वपूर्ण deflections के बीच संबंध स्थापित ( हार्डवेयर MEA1060 w / blanking सर्किट, लाभ x1200, 12 बिट ए डी /, रेंज mV 0-4096, multichannel सिस्टम, सॉफ्टवेयर: MC_Rack). ग्राउंड या तो आंतरिक जमीन इलेक्ट्रोड के माध्यम से प्रदान की जाती है, या बाह्य एक सेल एजी / AgCl - आधा जोड़कर.
  2. LFP कोशिकी कील गतिविधि से 200 हर्ट्ज (बैंड 300 से गुजारें - - 3000 हर्ट्ज) 1 के एक बैंड पास फिल्टर के साथ अलग. स्पाईक गतिविधि आगे की एकल और बहु ​​- इकाई बंद लाइन कील sorters (जैसे Plexon इंक) का उपयोग कर गतिविधि में वर्गीकृत किया जा सकता है. परिकलित करें स्पाइक प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिए औसत ट्रिगर. प्रांतस्था संस्कृतियों के लिए, सबसे अधिक औसत संस्कृति में neuronal spiking की पसंदीदा समय के रूप में नकारात्मक LFP deflections (nLFP) की पहचान करेगा.
  3. प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिए LFP निशान से शोर (एसडी) -3 मानक विचलन की एक सीमा की गणना (2 छवि)पीक nLFPs बार और amplitudes तय है कि पार दहलीज (छवि 2B, सी). विवरण के लिए 2,4 देखते हैं, और सभी इलेक्ट्रोड है कि लंबाई Δt के लगातार समय bines (छवि 2D ही में हैं से nLFPs concatenating द्वारा सरणी पर spatiotemporal nLFP समूहों की पहचान - एक बार बिन (8 एमएस 2 के बीच जैसे) Δt चुना ,) 5.
  4. आदेश में neuronal हिमस्खलन की पहचान करने के लिए, प्रत्येक nLFP क्लस्टर के आकार की गणना करने के लिए, सक्रिय इलेक्ट्रोड या nLFP आयाम की राशि के उदाहरण संख्या, एक आकार हिस्टोग्राम का निर्माण, और डबल लघुगणक निर्देशांक में साजिश है. Neuronal हिमस्खलन के लिए, आकार के वितरण एक शक्ति डबल लघुगणक 2 निर्देशांक (छवि 2E, एफ) में एक सीधी रेखा के द्वारा approximated कानून निम्नानुसार है . बिजली कानूनों पर सांख्यिकीय परीक्षण के लिए 16 देखें .
  5. एक इलेक्ट्रोड के माध्यम से जो आयाम एस के साथ वर्तमान नियंत्रित उत्तेजनाओं (प्रोत्साहन जनरेटर 1008 STG, Multichannel सिस्टम) लागू कर रहे हैं का चयन करके ऊतकों में पैदा की प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना. - 200 μA आयाम - एस के साथ 50 μs 10 के बीच 100 + आयाम एस / 2 और एस के साथ μs द्वारा पीछा किया: इलेक्ट्रोड नुकसान को कम करने के लिए, एक सीमित रेंज है, द्विध्रुवी वर्ग तरंग के साथ एक झटके के आरोप तटस्थ उत्तेजना का उपयोग करें. अधिक जानकारी के लिए मालिक मैनुअल देखें.
  6. 9 गतिशील रेंज, रिकॉर्ड सभी उत्तेजना के बाद 500 MS पीछा इलेक्ट्रोड पर 4 kHz नमूना दर पर LFP प्रतिक्रियाएं दर्ज उत्तेजना रिकॉर्ड करने के लिए. Circuitry (मल्टी चैनल सिस्टम) है जो उत्तेजना कलाकृतियों को कम करने और उत्तेजना के लिए पूर्व - प्रवर्धक संतृप्ति को रोकने के दौरान सिर चरण एम्पलीफायरों डिस्कनेक्ट blanking का प्रयोग करें.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

के बारे में 8 नए meas के साथ - 9 10 संस्कृतियों के कई हफ्तों के लिए बच जाएगा. हमारे दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के अधिकांश इनक्यूबेटर अंदर संस्कृति माध्यम है, जो हमें कई सप्ताह के पाठ्यक्रम 5 से अधिक अलग - अलग संस्कृतियों के विकास का पालन करने के लिए अनुमति देता में जगह ले. हमारे प्रयोगों के आधार पर, LFP रिकॉर्डिंग मज़बूती में 100 से अधिक संस्कृति दिनों के लिए इस्तेमाल किया meas के साथ प्राप्त किया जा सकता है. इसके विपरीत, बाह्य कील गतिविधि अधिक मज़बूती से अपेक्षाकृत नए meas (<40 संस्कृति दिन) के साथ मापा है. एक ठेठ प्रयोग में, हम सिर संलग्न मंच (छवि 1B, बाएं) संस्कृति कक्ष सील रखने के साथ भंडारण ट्रे (छवि 1B, दाएं) से विदेश मंत्रालय ट्रे को हस्तांतरण. 5 प्रांतस्था के लिए, प्रांतस्था-VTA 6 सह संस्कृतियों के रूप में अच्छी तरह से anesthetized चूहे 6 और 7 vivo में जाग बंदर, सतही परतों में neuronal हिमस्खलन के दौरान neuronal फायरिंग में मुख्य रूप से होता है LFP के शिखर नकारात्मक विक्षेपन के लिए करीब (nLFP ). इस प्रकार, स्थानीय रूप से सिंक्रनाइज़ neuronal समूहों के spatiotemporal संगठन सरणी 17 पर अंतरिक्ष और समय में nLFPs की घटना को मापने के द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है.

विदेश मंत्रालय पर गतिविधि लौकिक समूहों में उभरने जाता है, एक इलेक्ट्रोड पर ऐसी है कि अन्य साइटों पर गतिविधि गतिविधि के साथ है. ऐसी गतिविधि की अवधि के दौरान LFP की विशिष्ट waveforms आंकड़ा 2A में दिखाया गया है 3 कई सेकंड के अलावा घटनेवाला समूहों की साजिश रचने में. प्रत्येक क्लस्टर के लिए, नकारात्मक क्षेत्र deflections 1 के एक खिड़की के भीतर कई इलेक्ट्रोड पर देखा जा सकते हैं एस जब कि अनेक नकारात्मक एसडी की एक सीमा पार nLFP चोटियों निकालने nLFP चोटी बार के रूप में गतिविधि सुविधा जिसमें विभिन्न इलेक्ट्रोड (छवि 2B) पर संपाती nLFPs के निकट डॉट्स की 'कॉलम' का प्रतिनिधित्व करते हैं एक रेखापुंज में visualized है. इस गतिविधि के संगठन spatiotemporal बल्कि जटिल है, 'कॉलम' है, जो अधिक या कम कम अस्थायी समाधान पर समरूप दिखाई देते हैं उच्च अस्थायी समाधान और इतने पर (छवि 2C) पर अलग - अलग समूहों से बना रहे हैं. वास्तव में, spatiotemporal nLFP समूहों के उद्भव उच्च cortical नेटवर्क में आयोजित है. अधिक विशेष रूप से, संगठन neuronal हिमस्खलन के लिए पैमाने पर अपरिवर्तनीय है. यह एक दिया टेम्पोरल संकल्प Δt पर क्लस्टर आकारों की संभावना की गणना के द्वारा प्रदर्शन किया है. यहाँ, समूहों nLFPs है कि एक ही है या लगातार समय डिब्बे (छवि 2 डी) में होने की रचना कर रहे हैं. जब इस तरह के एक क्लस्टर के आकार क्लस्टर प्रति nLFPs, या क्लस्टर प्रति एकीकृत nLFP आयाम की कुल संख्या में व्यक्त किया है, क्लस्टर आकार वितरण से पता चलता है एक बिजली कानून, जिसका ढलान -1.5 2,4,5,7 दिखाया गया है ( चित्र 2E, एफ). ध्यान दें कि इस वितरण क्लस्टर आकार है कि आकार kxs, जहां कश्मीर एक निरंतर कारक है के अनुपात के पैमाने अपरिवर्तनीय आदेश देने की पहचान, -1.5 कश्मीर, जो एस के स्वतंत्र है इस शक्ति कानून 2 सरणी के आकार के स्वतंत्र संगठन है, अस्थायी समाधान Δt 2, और महत्वपूर्ण nLFP पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया दहलीज 7 deflections. क्योंकि nLFP neuronal समूह 7 आकार के साथ आयाम तराजू, nLFPs के पैमाने अपरिवर्तनीय संगठन पैमाने अपरिवर्तनीय यानी, भग्न, आदेश ओ को दर्शाता हैच स्थानीय स्तर पर neuronal समूहों है कि सभी आकारों में शामिल सिंक्रनाइज़.

चित्रा 1
चित्रा 1 (ए) लड़ी पिरोया कांच की अंगूठी के साथ विदेश मंत्रालय के साइड और शीर्ष दृश्य घुड़सवार, और इसी टोपी. (बी) इनक्यूबेटर के दृश्य के अंदर है. वामपंथी: headstage इनक्यूबेटर शर्त के तहत एक ही संस्कृति से रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है माउंट. राइट: ट्रे संस्कृति के विकास के लिए कई meas पकड़े. साइड पहियों: जलमग्न और वातावरण उजागर संस्कृति के विकास के लिए आवश्यक चरण बारी करने के लिए कदम मोटर नियंत्रित डिवाइस कमाल. (सी) राज्याभिषेक चूहा प्रांतस्था-VTA सह संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया स्लाइस के लिए योजनाबद्ध ड्राइंग. प्रांतस्था (बाएं) वर्गों और midbrain वर्गों (मध्यम, सही) VTA वेंट्रल tegmental क्षेत्र (VTA, ग्रे) युक्त टूटी लाइनों के साथ काटने के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. Ctx:; प्रांतस्था wm: सफेद पदार्थ, सीपीयू: striatum, VTA: PONS: pontine क्षेत्र. 15 से भी इसी राज्याभिषेक 8 प्लेटें, 18, ​​और 20 को देखें . (डी) नियुक्ति और एक एकल प्रांतस्था VTA विदेश मंत्रालय और संस्कृति में पहले 9 DIV से अधिक अपने विकास पर सह संस्कृतियों के विकास. संस्कृति और सरणी पर प्रगतिशील विस्तार के सपाट नोट. चिंतनशील ऊतक भागों degenerated कोशिकाओं और ऊतकों मलबे से संकेत मिलता है. स्वस्थ ऊतक अपारदर्शी और दृश्य प्रकाश के साथ transillumination तहत भूरा है.

चित्रा 2
चित्रा 2 cortical organotypic संस्कृतियों में Neuronal हिमस्खलन. (ए) Overplot सरणी पर सहज गतिविधि के तीन अवधि के, कई सेकंड के द्वारा अलग. ध्यान दें कि प्रत्येक गतिविधि की अवधि सरणी पर कई इलेक्ट्रोड पर नकारात्मक LFP deflections (प्रत्येक रंग एक गतिविधि की अवधि के लेबल) के होते हैं. (ख) प्रत्येक इलेक्ट्रोड से nLFPs के नकारात्मक पीक समय गतिविधि की एक रेखापुंज में इकट्ठा कर रहे हैं. Column' - संरचनाओं की तरह पास तुल्यकालिक गतिविधि की अवधि का संकेत है. (सी) ध्यान दें कि स्तंभों है कि एक समय के पैमाने पर अत्यधिक सिंक्रनाइज़ दिखाई देते हैं उच्च लौकिक तराजू (3 अस्थायी तराजू दिखाया गया है) में एकाधिक स्तंभों से मिलकर बनता है. (डी) neuronal हिमस्खलन एल्गोरिथ्म के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. एक 2 एक्स 2 इलेक्ट्रोड सरणी चोटी और नकारात्मक LFP (nLFP) deflections शोर के एसडी-x की एक सीमा पार के समय आयाम में पहचाने जाते हैं. NLFPs के spatiotemporal संगठन क्रमिक सक्रिय चौड़ाई Δt के समय डिब्बे में clustered है. एक क्लस्टर का आकार या तो सक्रिय साइटों की संख्या, nLFP के साथ अर्थात् इलेक्ट्रोड के द्वारा पहचाना जाता है (ओं = 4), या nLFP amplitudes के एकीकृत राशि (एस = 130 μV). जीवन समय Δt के गुणकों में मापा जाता है. (ई, एफ) क्लस्टर आकार के वितरण में पावर कानून neuronal हिमस्खलन के रूप में समूहों को पहचानती है. ध्यान दें कि एक विशेष interelectrode सरणी (200 यहाँ सुक्ष्ममापी) के लिए Δd दूरी की पसंद एक विशेष Δt जिस पर गतिशीलता मनाया जाना चाहिए परिचय. अधिक विशेष रूप से, अनुपात में जो / Δd Δt नेटवर्क में औसत प्रचार वेग approximates, जिस पर सत्ता कानून की ढलान α neuronal 2,4,5 हिमस्खलन के लिए -1.5 approximates . कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.

Discussion

1. तकनीकी मुद्दों:

  1. बाँझ तकनीक meas और संस्कृति की तैयारी की तैयारी सभी बाँझ शर्तों के तहत एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर प्रदर्शन कर रहे हैं. एंटीबायोटिक्स, जो neuronal गतिविधि को प्रभावित तैयारी और संस्कृति की प्रक्रिया के दौरान किसी भी समय पर नहीं किया जाता है.
  2. प्लाज्मा / थ्रोम्बिन जमावट और विदेश मंत्रालय को विदेश मंत्रालय. ऊतक अस्तित्व पर ऊतक पालन प्लाज्मा / थ्रोम्बिन जमावट और ऊतक वातावरण के लिए जोखिम के समय के लिए आवश्यक समय के बीच एक सावधान संतुलन की आवश्यकता है . एक छोटी जमावट समय विदेश मंत्रालय से वर्गों के समय से पहले टुकड़ी जोखिम, जबकि वातावरण को लंबे समय तक निवेश ऊतक अध: पतन से चलाता है. क्योंकि थ्रोम्बिन समाधान की ताकत जमावट प्रक्रिया की गति निर्धारित करता है, यह सफलतापूर्वक विदेश मंत्रालय की सतह के लिए, स्वस्थ संस्कृतियों संलग्न करने के लिए एक बहुत महत्वपूर्ण प्राचल है. हम सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के 1000 इकाइयों (; 1 एनआईएच इकाई = 0.324 ± 0.073 मिलीग्राम 1KU) का उपयोग है. महत्वपूर्ण बात है, अपूर्ण / प्लाज्मा थ्रोम्बिन spatially विषम जमावट में समाधान परिणाम संवर्धन के दौरान प्लाज्मा ruptures को बढ़ावा देने के मिश्रण है. इन प्लाज्मा 'छेद' गंभीर रूप से संस्कृति स्वास्थ्य को प्रभावित और microelectrodes से संस्कृति अलग है, जिससे electrophysiological रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता में समझौता. विदेश मंत्रालय / ऊतक कोडांतरण के दौरान ठंडा प्लेटों के साथ कार्य करना जमावट धीमा कर देती है और समाधान / प्लाज्मा थ्रोम्बिन और ऊतक वर्गों के उचित स्थिति के समरूप मिश्रण के लिए अनुमति देता है.
    इसी प्रकार, संस्कृति जमावट के केवल 5 मिनट के बाद संस्कृति डूब करने के चैम्बर के लिए एकल बूंदों में मध्यम जोड़ने के द्वारा बहुत ऊतक की सतह तनाव के कारण टुकड़ी के जोखिम को कम कर देता है. विदेश मंत्रालय के एक सफल संस्कृति पर समतल और थोड़ा सप्ताह के लिए स्वस्थ विकास अधूरा ऊतक विदेश मंत्रालय के संपर्क या ऊतक अध: पतन (. उदा 1D चित्र) की किसी भी प्रमुख लक्षण के बिना, दिखा रहा है का विस्तार होगा.
  3. . ऊतक विच्छेदन माइक्रो चाकू बहुत हमारी विच्छेदन की प्रक्रिया में सुधार है. , जिसमें से हम ~ 2 मिमी चौड़े 'ब्लेड' सरौता का उपयोग कर विभाजित है, और उन्हें एक स्केलपेल धारक के साथ पकड़ हम डबल बढ़त रेजर ब्लेड (- भंगुर स्केलपेल ब्लेड 100050-00 ललित विज्ञान उपकरण) का उपयोग करें. राज्याभिषेक टुकड़ा का उपयोग कर एक चिकनी, ब्लेड के ऊर्ध्वाधर फर्म गति से dissected ऊतक के नमूने जिससे बहुत ऊतक के समग्र खींच संस्कृति स्वास्थ्य में सुधार करने के लिए कारण यांत्रिक तनाव को कम करने.
  4. ऊतक ठंडा. तैयारी के दौरान स्लाइस और ऊतक वर्गों का उचित ठंडा संस्कृति सफलता के लिए आवश्यक है. हम कस्टम बनाया ठंड Peltier एक धातु डिस्क के नीचे संलग्न तत्वों के साथ बनाया गया प्लेटों का उपयोग करें. Peltier तत्व द्वारा निर्मित गर्मी ठंडे पानी छिड़काव के माध्यम से निकाल दिया जाता है. यह बहुत तैयारी के समय कम कर देता है और तैयारी के प्रत्येक चरण के दौरान ठंडा मानकीकरण (Dold लैब्स और इंजीनियरिंग है 131 बागान डा. Seguin, TX 78155, (830) 560-1471)).
  5. इनक्यूबेटर हालत. सटीक आंतरिक कमाल की शर्तों के साथ एक कस्टम निर्मित इनक्यूबेटर meas पर स्लाइस की खेती में हमारी सफलता के लिए महत्वपूर्ण हो गया है. Multichannelsystems द्वारा एक घर में डिजाइन मूल (वर्तमान में नहीं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है) के आधार पर, आंतरिक कमाल की युक्ति ट्रे है कि दो बड़े पक्ष पहियों से जुड़े होते हैं होते हैं. कदम मोटर्स और कम्प्यूटरीकृत नियंत्रण एक सटीक कमाल प्रक्षेपवक्र के लिए अनुमति देते हैं (कोण घोड़ा, घोड़ा वेग, और आंतरायिक pauses). अंत में, टुकड़ा संस्कृतियों धीमी प्रत्यावर्तन में माहौल और संस्कृति के माध्यम से उजागर किया की जरूरत है. परंपरागत दृष्टिकोण संकीर्ण ट्यूब है कि धीरे धीरे वहाँ लंबे समय तक अक्ष के साथ बारी बारी से टुकड़ा संस्कृतियों में जगह है. यहाँ, धीमी गति रोटेशन यांत्रिक रोटेशन ही वजह से तनाव का उत्पादन नहीं करता, और रोटेशन वेग एक इष्टतम / खिला श्वास 'के बारे में 5 के चक्र प्राप्त करने के लिए पर्याप्त उच्च है - 10 मिनट की अवधि. विदेश मंत्रालय के कक्ष, ~ 2 सीसी की कुल मात्रा, और छोटे मध्यम संस्कृति ऊतक के द्वारा ही मध्यम कंडीशनिंग के लिए आवश्यक मात्रा का अधिक कॉम्पैक्ट इंटीरियर, एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गया है. ± 70 ~ ° कोण (चक्र समय: ~ 200 एस) के बीच विदेश मंत्रालय कमाल करके, नीचे तरल चरण और वातावरण के बीच संस्कृति संक्रमण के रूप में कमाल वेग धीमा है, और वातावरण के लिए बढ़ाया प्रदर्शन के लिए चरम कोण पर कमाल लंगड़ा है संस्कृति के अस्तित्व के लिए आवश्यक किया गया है.

2. प्रांतस्था संस्कृतियों के विकास उम्र neuronal हिमस्खलन अध्ययन

चूहा प्रांतस्था से तीव्र स्लाइस सामान्यतः 0 PND में ले रहे हैं - 1 और विदेश मंत्रालय पर कई हफ्तों के लिए सभ्य. प्रारंभिक अध्ययन से यह स्पष्ट रूप से दिखा दिया है कि एकल प्रांतस्था टुकड़ा संस्कृतियों, इन विट्रो में कई हफ्तों के बाद, पहचाने जाने योग्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ एक स्तरित संरचना है कि आसानी से vivo में सेल 18,18-21 कक्षाओं में तुलना की जा सकती बनाए रखने. इन विट्रो प्रणाली में इस स्तरित संगठन सुविधा किया गया है thalamic अध्ययन कियाप्रांतस्था के विकास के दौरान 22-24, innervation के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जैसे 25,26 striatum subcortical संरचनाओं ड्राइविंग के लिए. वास्तव में, मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर और भर neuronal कनेक्शन के गठन में विशिष्टता इन विट्रो प्रणालियों कि कई विस्तृत प्रक्षेपण प्रणाली को हटा देना में परिसर के निर्माण के लिए जैसे कि प्रांतस्था - बेसल ganglia circuitry 27-30, की अनुमति देता है.

बाद इन विट्रो, एकल प्रांतस्था 31 स्लाइस और प्रांतस्था स्लाइस 26 striatum या thalamus 32 सहज दिखाने के साथ सह सुसंस्कृत ऊपर और नीचे आमतौर पर urethane anesthetized 33 चूहे में vivo में पाया राज्यों में 6 सप्ताह - 4 इन राज्यों के ठीक अस्थायी संगठन की पहचान भालू नेस्टेड θ और γ-दोलनों पिरामिड न्यूरॉन्स और तेजी से spiking GABAergic 31 interneurons की एक electrophysiologically परिपक्व नेटवर्क का संकेत है . महत्वपूर्ण बात, डोपामाइन D2 रिसेप्टर उत्तेजना के अभाव में, parvalbumin पॉजिटिव cortical interneurons की परिपक्वता के बारे प्रांतस्था टुकड़ा संस्कृतियों 34 में 2 सप्ताह के द्वारा देरी हो रही है. इन निष्कर्षों, विकास के समय के पाठ्यक्रम के साथ लाइन में नेस्टेड θ, β और γ-दोलनों vivo में है कि मिलान किया जाता है जब प्रांतस्था स्लाइस वेंट्रल tegmental (VTA) क्षेत्र है, जो डोपामिनर्जिक को पेश न्यूरॉन्स होते हैं के साथ सह - सुसंस्कृत 6 प्रांतस्था.

इन अध्ययनों से संकेत मिलता है कि जब neuronal हिमस्खलन, जो महत्वपूर्ण परिपक्व तेजी GABAergic निषेध पर निर्भर हैं और 2,4 प्रांतस्था का सतही परतों में स्थित अध्ययन, महान देखभाल करने के लिए cortical ऊतक के उचित परिपक्वता आश्वासन लिया जा है. जबकि neuronal हिमस्खलन 2 के समय के पाठ्यक्रम पर एकल प्रांतस्था संस्कृतियों में उठता - 5 4 सप्ताह, जब एक विकासात्मक समय जरूर है कि vivo विकास में करने के लिए मिलान है की आवश्यकता होती है, प्रांतस्था स्लाइस सह संवर्धन प्रांतस्था स्लाइस द्वारा एक उपयुक्त dopamine रिसेप्टर उत्तेजना जैसे , की जरूरत है VTA के साथ 6.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस अध्ययन के मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम (DIRP) प्रभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Integrated planar multielectrode array Multi Channel System MCS GmbH 200/30iR-ITO-w/o Titanium Nitrate (TiN) electrodes (30 mm diameter) have large surface resulting in low impedance ( ~1.5 kΩ at 1 kHz) and excellent wide-band recordings ( w/o -– without ring)
Chamber glass www.aceglass.com 7620-32 Threaded glass cylinder
Chamber cap www.aceglass.com 7622-114 Plastic cap with Teflon insert
Sylgard 184 World Precision Instruments, Inc. SYLG184 Two-part silicone elastomer
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-5mg γ-irradiated, lyophilized powder, cell cultured tested. Reconstituted with 5 ml deionised water before use.
Gey’s Balanced Salt solution Sigma-Aldrich G9779-500mL sterile filtered and cultured tested
chicken plasma Sigma-Aldrich P3266-5mL Lyophilized, reconstitute with 5 ml deionized water before use.
thrombin Sigma-Aldrich T6634-1KU from bovine plasma, lyophilized powder form.
horse serum Sigma-Aldrich H1138-100mL donor herd, heat inactivated, cell culture tested
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 1x, 500 ml - (+) Earle’s Salts, (-) L-glutamine),
Hank’s Buffered Saline Solution Invitrogen 24020-117 500 ml - (+) Magnesium, (+) calcium, w/phenol red)
Chamber slides Lab-Tek 177429
Uridine Sigma-Aldrich U3003
ARA-C cytosine-β-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C6645
5-fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503

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तंत्रिका विज्ञान 54 अंक neuronal गतिविधि neuronal हिमस्खलन organotypic संस्कृति टुकड़ा संस्कृति microelectrode सरणी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी स्थानीय क्षेत्र की क्षमता कोशिकी के spikes
बहु इलेक्ट्रोड Neuronal हिमस्खलन के Organotypic संस्कृतियों में ऐरे रिकॉर्डिंग
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Plenz, D., Stewart, C. V., Shew, W., Yang, H., Klaus, A., Bellay, T. Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures. J. Vis. Exp. (54), e2949, doi:10.3791/2949 (2011).

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