Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Summary

En metod för att generera humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) via retrovirus-medierad ektopiskt uttryck av Oct4 är SOX2, KLF4 och MYC beskrivits. Ett praktiskt sätt att identifiera de mänskliga IPSC kolonier som bygger på GFP-uttryck diskuteras också.

Abstract

Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) är pluripotenta och en ovärderlig cellulära källorna för in vitro sjukdomar modellering och regenerativ medicin ^1. Det har tidigare visat att humana somatiska celler kan omprogrammeras för att pluripotens med ektopisk uttryck av fyra transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 och Myc) och bli inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) ^2-4. Liksom hESCs, humana iPSCs är pluripotenta och en potentiell källa för autologa celler. Här beskriver vi protokollet att programmera humana fibroblastceller med de fyra omprogrammeringar faktorer klonade in i GFP som innehåller retrovirala ryggraden ^4. Med hjälp av följande protokoll, genererar vi människor iPSCs i 3-4 veckor under mänsklig ESC kulturen villkor. Humana IPSC kolonier liknar nära hESCs i morfologi och visa en förlust av GFP-fluorescens som ett resultat av retroviralt transgen tystande. IPSC kolonier isolerades mekaniskt under en fluorescens microscope uppträda på ett liknande sätt som hESCs. I dessa celler detektera vi uttrycket av multipla pluripotensbestämmande gener och markörer på ytan.

Protocol

1. Omprogrammering av retrovirus som uttrycker omprogrammeringar Faktorer

1. Humana fibroblaster odlas i fibroblast-medium (10% FBS i DMEM med Pen / Strep).
2. En dag före infektion, plattor 1x10 ^'5 humana fibroblaster i en brunn av en 6-brunnsplatta.
3. Aspirera medium för att avlägsna döda celler och tillsätt 2 ml av färskt fibroblast medium. Tillsätt protaminsulfat vid en slutlig koncentration av 5 pg / ml.
4. Tillsätt försiktigt den lämpliga mängden av varje GFP-uttryckande virus som motsvarar en multiplicitet av infektion (MOI) ⁵ 5.
5. En dag efter infektion, avlägsna den virala supernatanten, tvätta tre gånger med 2 ml PBS, tillsätt sedan 2 medium ml fibroblast.
6. Tre dagar efter infektion, kontrollera GFP fluorescens och fylla brunnen med 2 ml fibroblast medium.
7. Fyra dagar efter infektion, plåt 1x10 ⁴ / cm ² av bestrålat mus embryonala fibroblast (MEF) feeder celler i fibroblast medium på ett10-cm Petriskål täckt med 0,1% gelatin. Inkubera vid 37 ° C över natten.
8. Fem dagar efter infektion, avskilj infekterade humana fibroblaster med 1 ml 0,05% typsin / EDTA under 5 minuter vid 37 ° C och centrifugera under 5 minuter vid 200 g.. Aspirera mediet och återsuspendering av cellerna med 10 ml av fibroblast-medium. Överföra cellerna till ett förbelagt 10-cm platta.
9. Efter 24 timmar ersätta mediet med hESC odlingsmedium (20% Knock-Out serumersättning, DMEM/F12, 0,1 ml icke-essentiella aminosyror, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / glutamat, beta-merceptoethanol). Ändra det medium dagligen. ESC-liknande kolonier börjar dyka upp för dag 20-27 efter infektion.

2. Isolering och expansion av iPSCs

1. Under ett fluorescensmikroskop, kontrollera frånvaron av GFP fluorescens i en koloni som visar en liknande morfologi som hESCs.
2. Med hjälp av en 10 ^ pipett välja enskilda IPSC kolonier och placera dem i en brunn i en gelatin-och MEF-CoAted 12-brunnsplatta och kompletterat med hESC medium. Ändra mediet dagligen.
3. För passage, tvätta plattan med 1 ml av DMEM/F12, tillsätt sedan 0,5 ml av kollagenas och inkubera under 10 minuter vid 37 ° C.
4. Tvätta cellerna två gånger med DMEM/F12.
5. Tillsätt 2 ml färskt hESC medium. Användning av en cell lyftaren, bryta upp kolonierna i små bitar och lösgöra återstående cellerna från plattan.
6. Överföra de återsuspenderade bitar av kolonier i en brunn av en gelatin-och MEF-belagda 6-brunnsplatta.

3. Immunofluorescens Analys av pluripotenta markörer

1. Tvätta cellerna tre gånger med PBS och fäst med 4% paraformaldehyd under 20 min vid rumstemperatur.
2. Försiktigt tvätta cellerna tre gånger med PBS och permeabilisera med 0,2% Triton X-100 i PBS under 30 minuter.
3. Blockera icke-specifika bindningen genom att inkubera cellerna med 3% BSA i PBS under två timmar.
4. Inkubera cellerna med primär antikropp under natten vid 4 ° C.
<li> Tvätta cellerna tre gånger med PBS och inkubera cellerna med specifik sekundär antikropp under en timma vid rumstemperatur, skärmning mot ljus.
5. Tvätta cellerna tre gånger med PBS och tillsätt DAPI under den sista tvättningen, följt av inkubation vid rumstemperatur under 5 minuter.
6. Detektera färgning med ett fluorescensmikroskop.

4. Kvantitativ realtids-PCR-analys för de pluripotenta Markers

1. Isolera totalt RNA från de humana iPSCs härledda från humana fibroblaster med användning Qiagens RNeasy kit.
2. Syntetisera den första strängen cDNA med användning av Superscript II omvänt transkriptas.
3. Utför qPCR att upptäcka pluripotensbestämmande gener med hjälp av primers som tidigare rapporterats. ⁶

5. Representativa resultat

1. Morfologisk förändring under omprogrammering
   Vi infekterade humana fibroblaster BJ1 och Detroit 551 med en cocktail av retrovirus som bär Oct4, SOX2, KLF4 och MYC,och kunde upptäcka morfologiska förändringar under omprogrammering (figur 1). Tjugoen dagar efter infektion, inser vi små IPSC kolonier av deras hESC-liknande morfologi. Dessutom inser vi iPSCs av GFP fluorescens. Pluripotenta stamceller, såsom ESC och iPSCs och uttrycka det molekylära maskineriet för att undertrycka den provirala genexpression ^7-9. Vår unika retrovirusvektor uttrycker GFP tillsammans med omprogrammering gener genom retroviral LTR. Således celler kontinuerligt uttrycker GFP anses uttrycka transgener utan proviral geners uttryck. Troget omprogrammerade IPSC kolonier som förvärva pluripotens molekylära nätverket visar frånvaron av GFP uttryck (figur 2) ^10.
   
2. Karakterisering av pluripotens av humana iPSCs
   Vi analyserade kolonier som härrör från Detroit-551 fibroblaster via immunohistokemi med Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4 och NANOG antikroppar ( (figur 3A). Analyserade vi också genuttryck via kvantitativ RT-PCR-analys. Vi observerade att uttrycket av Oct4 tillsattes SOX2, KLF4, MYC och NANOG signifikant ökad i jämförelse med de parentala fibroblastceller men motsvarande den som av H9 hESCs (figur 3B).

Figur 1. Morfologiska förändringar i retrovirus-infekterade humana fibroblaster. (AD) Progressiv morfologiska förändringar i kolonier från Detroit-551 fibroblaster infekterade med omprogrammering faktorer. Dag 5 (A), dag 10 (B), dag 14 (C), dag 21 (D). Celler visar hESC-liknande morfologi efter 21 dagar.

Figur 2. Representant GFP fluorescerande uttryck i celler som genomgår omprogrammering. 4, och inkuberades i hESC mediet under fyra veckor. BJ fibroblaster (A, B) och Detroit 551 (C, D) visar liknande morfologiska. Från dag 21, GFP negativa kolonier börjar form, som representerar de seriösa iPSCs ^10. (E, F) visar transformerade Detroit 551 celler som inte har genomgått korrekt omprogrammering. (A, C, E) kolonier under faskontrast vy. (B, D) ordentligt omprogrammeras celler som visar GFP tysta. (F) ljus GFP uttryck från transformerad koloni.

Figur 3. Karakterisering av de humana inducerade pluripotenta stamceller. (A) humant 551-iPS-K1-cellkolonier uttrycka markörer som är gemensamma för pluripotenta celler. DAPI-färgning visar den totala cell-innehållet per fält. (B) Kvantitativ realtids-PCR (RT-qPCR) för expression av Oct4, SOX2, KLF4, MYC i föräldra fibroblast och 551-IPS-K1 iPSCs och H9 mänskliga embryonala stamceller (hESCs). Data normaliserades mot β-aktin housekeeping-gen och plottades i förhållande till expressionsnivån i de parentala fibroblastceller ^4.

Discussion

Expression av fyra transkriptionsfaktorer omprogrammerar humana fibroblaster till iPSCs. Många försök gjordes för att generera humana iPSCs med användning av icke-integrerande eller icke-genetiska metoder för att generera kliniskt säkert iPSCs. Hittills har dessa metoder uppvisar extremt låg verkningsgrad och kräver ytterligare optimeras för att förbättra reproducerbarheten ^11-14. Retro-eller lentiviral metoder lätt används för att härleda och tillämpa iPSCs för in vitro på människa sjukdom modeller, som är mindre beroende av säkerhetsfrågor som orsakas av virus integration. Omprogrammering metod som beskrivs här är tillgänglig för effektiv utvinning av mänskliga iPSCs. Val av mänskliga iPSCs bygger huvudsakligen på kolonimorfologi som liknar mänskliga ekonomiska och sociala råd. Ännu viktigare, tar vår metod fördel med funktionen att tysta av de retrovirala långa terminala upprepningar (LTR) i pluripotenta stamceller ^7,15. Den retrovirala vektorn som används i detta protokoll innehåller GFP-genen kopplad till omprogrammeringfaktorer via ett inre ribosominträde Sequence (IRES) och ^5. GFP-expression drivs av provirala LTR. De fibroblaster infekterade med dessa virus visar initialt den ljusa GFP-uttryck. När fullt omprogrammeras kommer iPSCs att förlora GFP uttryck som är lätt visualiseras under ett fluorescensmikroskop. I detta protokoll beskrivs vi generationen iPSCs från fetala och neonatala fibroblaster (Detroit 551 och BJ1). Emellertid har detta retroviral vektor har använts för att generera iPSCs från normala vuxna fibroblaster samt en mängd olika patienter med Mendels och komplexa sjukdomar ^4,16,17.

Tidigare har vi analyserat den förändring i cellulära ytmarkörer under människans somatiska omprogrammering ^10. Det finns en progressiv förändring i cellytemarkörer. Fibroblaster uttrycker CD13, som undertrycks av uttrycket av omprogrammering. Celler som genomgår omprogrammering börjar uttrycka SSEA4 tillsammans med GFP. Sedan förlorar de expressiEn av GFP via proviral silecing och uttrycka ytterligare pluripotens tillverkare TRA1-60 ^10. Uttrycket av TRA1-60 är väl korrelerad med GFP ljuddämpning och välutvecklade teratom bildning, vilket antyder att TRA1-60 är en markör för troget omprogrammerade iPSCs. GFP ljuddämpning är alternativet markör för TRA1-60 uttryck och möjliggör identifiering av IPSC kolonier utan att mödosamt levande cell färgning. Med förlusten av GFP uttryck som en markör för iPSCs, stamceller forskare som inte har någon tidigare erfarenhet av omprogrammering kommer lätt och konsekvent isolera iPSCs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment