Summary
我们已经开发出一种高密度芯片平台的3D纳米生物膜的组成
Abstract
白念珠菌仍然是主要病原念珠菌，目前第四个最常见的在美国的医院院内血流感染。这些机会性感染造成损害个人越来越多越来越大的威胁，并进行不可接受的高死亡率。这是由于抗真菌药物的有限阿森纳的一部分，但也出现抵抗最常用的抗真菌药物。进一步复杂化的治疗方法是，多数表现念珠菌生物膜的形成与相关的事实，并在这些生物膜的细胞显示临床使用抗真菌药耐药水平的提高。在这里，我们描述的C.组成的高密度芯片的发展白念珠菌生物膜纳米，我们有一个名为钙 BChip 3。简言之，一个机器人微阵列用tØ打印C.酵母细胞到固体表面的白色念珠菌 。在印刷过程中，酵母细胞被包围在一个三维矩阵使用量低至50 NL，并固定在一个合适的涂层的玻璃基板。经过最初的印刷，幻灯片培养24小时，使生物膜的发展，在37°C。在此期间的景点成长为全面发展的“纳米生物膜”，显示典型的结构和表型特征与成熟的三白念珠菌生物膜（ 即形态的复杂性，三维结构和耐药性）4。总体而言， 钙 BChip是〜750相当于和空间不同生物膜的组成与打印多个芯片可以同时处理额外的好处。估计FUN1代谢的荧光强度染色用芯片扫描仪通过测量细胞活力。这种真菌芯片非常适合为u在真正的高通量筛选抗真菌药物的发现本身。与现行标准（ 即 96酶标板模型生物膜形成5）相比，真菌生物膜芯片的主要优点是自动化，小型化，节省试剂和分析时间的量和成本，以及消除劳动密集的步骤。我们相信，这种芯片将显着加快的抗真菌的药物发现过程。
Protocol
1。制备官能幻灯片
- 载玻片放置在一个可移动的滑动机架，洗浸泡在罐子染色，含99％乙醇（病理分级）的两倍。用幻灯片使用纸巾（确保不产生纸尘），干用压缩氮气射流清洗。
注意：不要使用金的湿巾擦拭幻灯片，因为它会产生细尘纸。
- 沉浸充满在室温下与浓硫酸和孵育过夜染色罐中含有幻灯片幻灯片架。
注：为了避免与皮肤接触，使用耐化学腐蚀的手套和护目镜，同时与浓酸，有毒和腐蚀性化学品的工作。
- 超声幻灯片，用Milli-Q 30分钟，洗为30分钟（18MΩ）水与另一洗cetone为5分钟。这种治疗暴露在玻璃表面上的硅醇基。
- 大衣，用2.5％的清洁幻灯片（体积/体积水）3 - 氨丙基（APTES）解决方案，通过幻灯片，APTES机架浸泡30分钟，15分钟洗涤3次在Milli-Q水各洗，烘烤于一炉的幻灯片在110°C为15分钟。烘烤，使交联，APTES，造成表面官能氨基。
注意：请在一个塑料容器，因为优先的墙壁，玻璃容器，APTES存款，APTES的解决方案。
- 使用旋转涂布机，外套1％（WT / VOL甲苯）聚苯乙烯-马来酸酐共聚物（PS-MA的）（Sigma公司）的幻灯片，实现了疏水涂层6单层。 2.0毫升的PS-MA的加入到一个干净的玻璃安装在旋转涂布机和大衣在3000转每分钟为30秒的幻灯片。这些条件可能会有所不同的基础上旋转涂布参数，如涂层，使lution，基材，涂层厚度，由下列公式7管辖
其中 h是涂膜的厚度，e为蒸发率，η，C和ρ是涂层溶液的粘度，浓度和密度分别为，ω是角速度。
注：甲苯当通风柜的使用时间长，吸入是有害的建议。
- 幻灯片可以存储在长达一个月的幻灯片机架在干燥，无粉尘条件在2 - 8°C。
2。酵母菌剂的制备和胶原封装
- 准备C.过夜培养白念珠菌菌株SC5314，在酵母蛋白胨葡萄糖[的YPD; 10克/ L酵母提取物，20克/ L蛋白胨20 g / L的葡萄糖液体培养基，接种单菌落的C.人bicans为10 - 20毫升的YPD 8。在30°C过夜孵育轨道摇床（约150 - 200转）文化。收获1毫升白念珠菌从隔夜（在5-10分钟5000转离心）的YPD培养酵母细胞，并用两次10分钟1毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS; 10 mM磷酸盐缓冲液，氯化钾2.7毫米， 137毫米氯化钠，pH值7.4）（Sigma公司），每洗。收获离心洗细胞在10分钟1900转。洗过的细胞悬浮于1毫升重建缓冲液（0.2 N氢氧化钠溶液与2.2％（WT /卷）碳酸氢钠和4.8％（重量/体积）肝素钠，pH值7.2）。
注：C.白色念珠菌是一种风险集团1/BSL1的微生物。永远记住使用工作良好的无菌/灭菌技术，这种微生物的生物危险材料的妥善处置，并按照制度程序。
- 计数细胞使用hemocyt烁效应在明场显微镜和调整细胞密度5×10 7细胞/ ml。
- 进一步稀释十倍暂停另外10×的RPMI-1640 L-谷氨酰胺，并辅以与morpholinepropanesulfonic（MOPS）酸（pH值7.2）缓冲。
- 封装混合细胞悬液与胶原蛋白（1.8毫克/毫升）的RPMI-1640（从鼠尾1型胶原蛋白的酵母细胞，BD公司，贝德福德，马），取得了最终浓度4×10 6细胞/毫升。在冰上保持胶原细胞悬液，以防止在打印前胶原凝胶。
3。制备的钙 BChip
- 清理和消毒，微阵列的所有表面，包括源盘站，洗涤和真空站，真空幻灯片盘片和印刷室，70％的异丙醇擦拭。
- 放置和真空麦克风幻灯片所需的PS-MA的镀膜玻璃幻灯片roarrayer。
- 涡的细胞悬浮在胶原大力吸成一个以及一个96孔板100μL混合悬浮印刷之前，。把这个源板在装载站。
- 加湿器，切换到保持100％的相对湿度在整个印刷过程中的微阵列室。
- 打印一个相隔间距1.2毫米的使用芯片检举（Omnigrid微Digilab公司，Holliston，马）由非接触式沉积采用锥形锥形190微米的小孔陶瓷提示点48行和16列数组NL 50细胞悬液（Digilab）。
- 总理，冲洗和真空干燥的提示两次后，每一轮的印刷。
- 后立即印刷，放置在一个气密，加湿室（杂交录像带，加利福尼亚州桑尼维尔，ArrayIt公司）的幻灯片和孵化在37°C为24小时，使生物膜的形成。
4。药敏试验的Pr在的钙 BChip eformed生物膜对抗真菌药物
- 从股票的解决方案或抗真菌药物粉末，准备工作液中的RPMI-1640培养基。典型的工作方案的最高浓度为1,024微克/毫升的氟康唑和两性霉素B 5 16微克/毫升。其他浓度可用于不同的代理。
- 准备稀释2倍稀释的原液，涵盖范围估计在中间化合物的IC 50的 8个不同的化合物的浓度。
- 经过24小时的生物膜增长，使用微阵列打印50 NL八个不同浓度的药物，随着阳性（不只是媒体的药物，即细胞）和阴性（钠次氯酸钠处理20分钟）控制，至少在六个复生物膜上。
注意：保持100％的相对湿度，以防止斑点干燥而附加ING的药物。
- 加入药物后不久，在37℃孵育24小时，在加湿室药物的芯片。
- 扣篮的CaBChip 3-5次，每次2分钟的时间在PBS洗药和染色孵化在37 CA BChip 0.5微米FUN1°C为30分9。
- 洗净的，扣篮钙 BChip 1-3分钟3-5次，每一个扣篮，在PBS染色，干燥氮气流的的钙 BChip使用。阅读的荧光强度在532 nm波长的光电倍增管的增益380微阵列扫描仪（GenePix 4100A，Axon仪器，CA）的使用。
- 设置阳性对照（无药物）和死亡（漂白处理）在100％和0％的生物膜点的荧光强度分别。
- 使用下列公式确定在控制点的平均荧光强度（F）的相对减少的百分比抑制
其中，F，升F 最大的 F o原始荧光强度药物治疗，没有药物管制和漂白处理点，分别。扫描仪设置进行了调整，以获得F 最大和 F O，分别为30000和4000俄罗斯足协。
- 使用GraphPad棱镜软件（拉霍亚加州）变坡山方程拟合计算50％抑制浓度或IC 50。
5。代表结果
钙 BChip一个代表，包括一个48×16阵列C 的纳米生物膜白念珠菌， 如图2所示。明亮的视野显微镜显示的纳米生物膜整体建筑特色。扫描电子显微图像生物膜节目，真菌的菌丝内嵌入矩阵胶原纤维，这是约2微米，直径100纳米，分别。染的FUN1芯片扫描图像显示酵母和菌丝形式，这是真菌生物膜的特点。的的FUN1染生物膜的二维和三维共焦荧光图像可以看出，有空间异质性，穿插代谢活跃的细胞内细胞外基质（胶原组成的封装材料，也是最有可能的exopolymeric生产地区生物膜细胞），这是不代谢染料染色。据估计，生物膜的厚度约为50微米。 钙 BChip被用来估计的两种药物，氟康唑和两性霉素B药敏，结果如图3所示。按照行业标准96孔板检测上发表的报告，生物膜是抗氟康唑10和计算IC 50两性霉素B是0.3微克/毫升11。
图1。 钙 BChip的制作流程图。
图2。使用机器人的微阵列高能开出钙 BChip印刷，图片和PS-MA的涂层幻灯片上载有768点。每个半球点是50 nL的体积，直径大约700微米，与之间的斑点1.2毫米的分离。也显示（顺时针），光学显微镜，生物芯片扫描仪，二维和三维荧光显微镜和扫描电子显微镜对钙 BChip的个人生物膜图像。在25000 x高倍率的SEM图显示了一个宽2微米的菌丝长丝。
图3“SRC =”/ files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg“/>
图3。药敏试验和IC 50（一）氟康唑和（B）两性霉素B使用钙 BChip值的测定结果。两性霉素B治疗生物膜的荧光显微镜图像显示在（C）。结果是平均值±标准误差平均为两个独立的芯片，含有10复制每个条件。
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Discussion
我们已经开发了一个基于细胞的高密度芯片，CA BChip， 白念珠菌生物膜的纳升量组成。芯片上印改性玻璃基板，允许强大的胶原蛋白凝胶点附件，同时提供必要非蔓延，半球形的三维凝胶疏水。一个单一的钙 BChip可以取代约八96孔板，和几个芯片可以打印，并在同一时间处理。该芯片采用纳米级的文化，可以方便，快捷的处理，适合自动化，最大限度地减少手工劳动和成本，是完全符合标准的芯片技术和设备的兼容。此外，该技术是灵活的，可以很容易地适应其他微生物。尽管小型化，纳米生物膜形成对的钙 BChip显示属性特征的C.白念珠菌生物膜的生活方式，包括3D architecture和耐药性。因此， 钙 BChip允许真正的高通量筛选，并有可能在抗菌药物发现的模式的转变。
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Disclosures
L.洛佩斯·何塞·里博·阿南德K. Ramasubramanian在MicrobeHTS技术公司，这是发展抗真菌药物的自身权益。 MicrobeHTS技术，这些研究没有提供财政支持。
Acknowledgments
这项工作的部分资金由来自南得克萨斯科技管理（POCrr 2009.041），整合从国家研究资源中心（UL 1RR025767）医学和科学学院的赠款和牙科及颅面研究国家研究所（ 5R21DE017294）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
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