Summary
हम एक उच्च घनत्व माइक्रोएरे मंच 3 डी नैनो biofilms से मिलकर विकसित किया है
Protocol
1. Functionalized स्लाइड्स की तैयारी
- एक हटाने योग्य स्लाइड रैक में खुर्दबीन स्लाइड प्लेस, और धो दो बार एक धुंधला 99% इथेनॉल (histological ग्रेड) युक्त जार में डुबो कर. पोछो स्लाइड कागज कागज धूल उत्पन्न नहीं यह सुनिश्चित करने के तौलिये, और शुष्क संकुचित नाइट्रोजन गैस के एक जेट का उपयोग कर का उपयोग कर साफ.
नोट: का उपयोग करने के लिए स्लाइड नहीं पोंछ किम पोंछे के रूप में यह ठीक कागज धूल उत्पन्न होता है.
- स्लाइड एक धुंधला केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड और सेते हैं के साथ कमरे के तापमान पर रातोंरात भर जार में स्लाइड युक्त रैक विसर्जित कर दिया.
नोट: त्वचा के साथ संपर्क से बचने के लिए, रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने और सुरक्षा चश्मे का उपयोग करते हुए ध्यान केंद्रित एसिड और विषाक्त और संक्षारक रसायनों के साथ काम कर रहे हैं.
- 30 मिनट और मिल्ली - क्यू के साथ धोने (18 MΩ) 30 मिनट के लिए पानी के लिए स्लाइड Sonicate, एक में एक और धोने के साथ पालन करें5 मिनट के लिए cetone. इस इलाज के गिलास सतह पर silanol समूहों को उजागर करता है.
- कोट 2.5% के साथ स्वच्छ स्लाइड्स (पानी में / वॉल वॉल) 30 मिनट के लिए डुबो स्लाइड रैक APTES में है, मिल्ली क्यू पानी में 3 बार 15 मिनट के लिए प्रत्येक धोने धोने, और पका रही द्वारा (APTES) 3 aminopropyltriethoxysilane समाधान, 110 पर एक भट्ठी में स्लाइड ° सी 15 मिनट के लिए. पकाना APTES के पार से जोड़ने की, सतह के NH2 - functionalization में जिसके परिणामस्वरूप की अनुमति देता है.
नोट: एक प्लास्टिक कंटेनर में ग्लास कंटेनर की दीवारों पर रियायत के तौर पर जमा APTES के बाद APTES समाधान करें.
- एक स्पिन coater, कोट, 1 (wt / टोल्यूनि में वॉल)% Polystyrene सह - Maleic Anhydride (PS एमए) (सिग्मा) के साथ स्लाइड्स का उपयोग करने के लिए एक hydrophobic कोटिंग 6 मोनो परत को प्राप्त करने. एक साफ़ गिलास स्लाइड पर एक स्पिन और 30 है के लिए 3000 rpm पर coater कोट पर घुड़सवार पुनश्च - एमए की 2.0 एमएल जोड़ें. इन शर्तों स्पिन कोटिंग के रूप में कोटिंग मापदंडों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं तोlution, कोटिंग सब्सट्रेट मोटाई, और निम्न समीकरण 7 द्वारा संचालित
घंटे जहां फिल्म कोटिंग की मोटाई है, ई वाष्पीकरण की दर है, η, सी और ρ दलदलापन, और कोटिंग समाधान की एकाग्रता घनत्व हैं, क्रमशः, और ω कोणीय वेग है.
नोट: टोल्यूनि हानिकारक है जब एक लंबी और एक धूआं हुड के समय उपयोग के लिए साँस की सिफारिश की है.
- 8 डिग्री सेल्सियस स्लाइड के लिए एक स्लाइड सूखी, धूल से मुक्त परिस्थितियों में 2 में एक महीने के लिए रैक में संग्रहीत किया जा सकता है
2. खमीर Inocula और कोलेजन इनकैप्सुलेशन की तैयारी
- सी. की एक रात संस्कृति तैयार albicans के SC5314 तनाव, खमीर peptone Dextrose [YPD, 10 जी / एल खमीर निकालने, 20 छ / एल peptone और 20 छ / एल द्रक्षौज] सी के एक ही कॉलोनी inoculating द्वारा तरल माध्यम अल10 में bicans - 8 YPD की 20 एमएल. 30 डिग्री सेल्सियस रात भर में एक कक्षीय हिलनेवाला (200 rpm के बारे में 150) में संस्कृति सेते हैं. हार्वेस्ट 1 एमएल रातोंरात YPD संस्कृतियों (5-10 मिनट के लिए 5000 rpm पर centrifugation द्वारा) से Candida albicans के खमीर कोशिकाओं और 1 बाँझ फॉस्फेट की एमएल में 10 मिनट के लिए दो बार धोना खारा बफर (पीबीएस, 10 मिमी फॉस्फेट बफर, 2.7 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 137 मिमी सोडियम क्लोराइड, 7.4 धोने प्रति) पीएच (सिग्मा). हार्वेस्ट कोशिकाओं को भी 10 मिनट के लिए 1900 rpm पर centrifugation द्वारा धोया. 1 एमएल पुनर्निर्माण बफर (2.2% (wt / वॉल) सोडियम बिकारबोनिट और 4.8% (wt / वॉल) HEPES, 7.2 पीएच 0.2 एन NaOH समाधान) में के धोया कोशिकाओं Resuspend.
नोट: सी. albicans के एक जोखिम समूह 1/BSL1 के सूक्ष्मजीव है. हमेशा याद इस सूक्ष्मजीव साथ काम के लिए अच्छा सड़न रोकनेवाला / बाँझ तकनीक और उपयोग biohazardous सामग्री के उचित निपटान के लिए संस्थागत प्रक्रिया का पालन.
- एक hemocyt का उपयोग कोशिकाओं गिनतीएक चमकदार क्षेत्र खुर्दबीन के पर ometer और 5 के एक सेल घनत्व × 10 7 कोशिकाओं / एमएल समायोजित.
- इसके अलावा निलंबन के अलावा 10 से दस गुना पतला × RPMI 1640 एल glutamine के साथ पूरक और morpholinepropanesulfonic एसिड (MOPS) (7.2 पीएच) के साथ बफर.
- कोलेजन (1.8 मिलीग्राम / एमएल) के साथ 1640 में RPMI - सेल निलंबन के मिश्रण से कोलेजन में खमीर कोशिकाओं encapsulate करने चूहे की पूंछ से (प्रकार 1, बी.डी. बायोसाइंसेज, बेडफ़ोर्ड, एमए), 4 की एक अंतिम एकाग्रता × 10 6 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए / एमएल. मुद्रण से पहले कोलेजन का जमाना को रोकने के बर्फ पर निलंबन कोलेजन सेल रखें.
3. Ca BChip की तैयारी
- स्वच्छ और 70% isopropanol साथ पोंछते द्वारा microarrayer की सभी सतहों, स्रोत थाली स्टेशन धोने, और निर्वात स्टेशन, निर्वात स्लाइड थाली और मुद्रण कक्ष सहित, कीटाणुरहित.
- प्लेस और निर्वात द्वारा पकड़ mic के स्लाइड डेक पर पुनश्च एमए लेपित गिलास स्लाइड की वांछित संख्याroarrayer.
- भंवर कोलेजन में सेल सख्ती निलंबन और एक 96 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से में मुद्रण से पहले अच्छी तरह से मिश्रित निलंबन की 100 μL, महाप्राण (व्यंजन). लोड हो रहा है स्टेशन में इस स्रोत प्लेट रखें.
- Humidifier पर स्विच करने के लिए मुद्रण प्रक्रिया के दौरान माइक्रोएरे कक्ष में एक 100% सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखने के लिए.
- प्रिंट शंकु के रूप पतला 190 माइक्रोन छिद्र चीनी मिट्टी के सुझावों का उपयोग गैर संपर्क बयान से 1.2 मिमी के अलावा एक माइक्रोएरे टोहिया (Omnigrid माइक्रो, Digilab इंक, Holliston, एमए) का उपयोग दूरी पर धब्बों के साथ 48 पंक्तियों और 16 स्तंभों की एक सरणी में 50 सेल निलंबन की nl (Digilab).
- प्रधानमंत्री कुल्ला, और वैक्यूम सूखा सुझावों दो बार मुद्रण के प्रत्येक दौर के बाद.
- मुद्रण के तुरंत बाद, एक हवाई तंग, humidified कक्ष (संकरण कैसेट, ArrayIt की निगम, Sunnyvale, CA) में स्लाइड को जगह और 37 ° 24 घंटे के लिए सी biofilm गठन के लिए अनुमति देने के लिए सेते हैं.
4. पीआर की संवेदनशीलता परीक्षणCa BChip में ऐंटिफंगल एजेंटों के खिलाफ eformed Biofilms
- शेयर रोधी दवाओं के समाधान या पाउडर से, RPMI 1640 माध्यम में काम कर रहे एक समाधान तैयार करते हैं. ठेठ काम कर समाधान की अधिकतम सांद्रता +१,०२४ μg / एमएल fluconazole के लिए और 16 / amphotericin B के लिए 5 μg एमएल हैं. अन्य सांद्रता विभिन्न एजेंटों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- दो गुना dilutions में स्टॉक समाधान गिराए, अनुमानित 50 आईसी बीच में परिसर के साथ एक सीमा फैले परिसर के आठ विभिन्न सांद्रता तैयार करते हैं.
- Biofilm विकास के 24 घंटे के बाद, 50 दवाओं के आठ विभिन्न सांद्रता के nl मुद्रित microarrayer उपयोग, 20 मिनट के लिए सोडियम hypochlorite के साथ इलाज के साथ (केवल मीडिया में कोई दवा यानी कोशिकाओं) सकारात्मक और नकारात्मक कम से कम में नियंत्रण, biofilms के शीर्ष पर छह replicates.
नोट: 100% सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखने के लिए ऐड जबकि स्पॉट की सुखाने को रोकने केदवाओं रहे हैं.
- दवाओं जोड़ने के तुरंत बाद 24 घंटे के लिए, 37 ° C पर एक humidified कक्ष में दवाओं के साथ चिप सेते हैं.
- दवाओं धो और 2 मिनट के लिए 3-5 बार पीबीएस में हर समय dunking CaBChip 0.5 FUN1 माइक्रोन के साथ Ca BChip 37 ° के लिए 30 सी 9 मिनट incubating के दाग.
- धो Ca BChip पीबीएस में हर डुबोना dunking 3-5 बार 1-3 मिनट के लिए बंद दाग, और Ca BChip का उपयोग कर एक नाइट्रोजन धारा सूखी. प्रतिदीप्ति तीव्रता 532 एनएम के तरंग दैर्ध्य में 380 PMT लाभ के साथ एक माइक्रोएरे स्कैनर (GenePix 4100A, Axon उपकरण, सीए) का उपयोग कर पढ़ें.
- सकारात्मक नियंत्रण (दवा) और मृत (ब्लीच का इलाज) 100% और 0% पर biofilm स्पॉट की प्रतिदीप्ति तीव्रता, क्रमशः सेट करें.
- प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ) में कमी के द्वारा नियंत्रण स्पॉट के औसत के सापेक्ष प्रतिशत निषेध निम्न समीकरण का उपयोग कर का निर्धारण
जहां एफ, एफ अधिकतम और एफ ओ दवा इलाज के कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता, कोई दवा नियंत्रण और ब्लीच का इलाज स्पॉट, क्रमशः रहे हैं. स्कैनर सेटिंग्स एफ अधिकतम और 30,000 और 4000 RFU एफ ओ, क्रमशः प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया.
- फिटिंग चर ढलान हिल समीकरण GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर (ला Jolla, CA) का उपयोग कर 50% निरोधात्मक एकाग्रता या 50 आईसी की गणना.
5. प्रतिनिधि परिणाम
एक प्रतिनिधि सीए BChip, 48 से मिलकर × सी. नैनो biofilms के 16 सरणी albicans, चित्रा 2 में दिखाया गया है. उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी नैनो biofilm के एक समग्र वास्तुशिल्प सुविधा से पता चलता है. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवियों biofilm शो की है कि कवक hyphae की मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड रहे हैंकोलेजन फाइबर,, क्रमशः है जो लगभग 2 व्यास में माइक्रोन और 100 एनएम हैं. FUN1 दाग माइक्रोएरे स्कैनर छवियों खमीर और hyphal रूपों, जो कवक biofilms के लक्षण हैं दिखा. 2 डी और 3 डी confocal FUN1 से सना हुआ biofilms के प्रतिदीप्ति छवियों स्थानिक विजातिता है metabolically सक्रिय कोशिकाओं के क्षेत्रों के बाह्य मैट्रिक्स (encapsulating के और भी exopolymeric उत्पादित सामग्री की सामग्री सबसे अधिक संभावना के रूप में कोलेजन के द्वारा रचित के भीतर interspersed के साथ देखा जा सकता है, biofilm) कोशिकाओं, जो चयापचय डाई से दाग नहीं है. biofilm की मोटाई लगभग 50 माइक्रोन होने का अनुमान लगाया गया था. Ca BChip दो दवाओं, fluconazole और amphotericin के बी रोधी संवेदनशीलता का अनुमान किया गया था, और परिणाम 3 चित्र में दिखाया जाता है. उद्योग मानक 96 अच्छी तरह से थाली assays पर प्रकाशित रिपोर्ट के साथ संगत है, biofilms 10 fluconazole और गणना 50 आईसी के लिए के खिलाफ प्रतिरोधी रहे हैं amphotericin बी 0.3 μg / 11 एमएल.
चित्रा 1. Ca BChip के निर्माण के लिए फ्लो चार्ट.
चित्रा 2. उच्च thoughput Ca BChip, मुद्रित की एक तस्वीर एक रोबोट microarrayer के का उपयोग कर और पुनश्च एमए में लिपटे स्लाइड पर 768 धब्बे से युक्त. प्रत्येक अर्धगोल स्थान की मात्रा में 50 NL है, व्यास में लगभग 700 माइक्रोन, और स्पॉट के बीच एक 1.2 मिमी की जुदाई के साथ. (दक्षिणावर्त) से पता चला प्रकाश माइक्रोस्कोपी, माइक्रोएरे स्कैनर, 2 डी और 3 डी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और Ca BChip पर व्यक्तिगत biofilms के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों स्कैनिंग कर रहे हैं. उच्च बढ़ाई +२५,००० एक्स SEM आंकड़ा चौड़ाई 2 माइक्रोन की hyphal रेशा से पता चलता है.
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(चित्रा 3) रोधी संवेदनशीलता परीक्षण और आईसी (ए) fluconazole और (बी) amphotericin बी के लिए 50 मान Ca BChip का उपयोग करने के दृढ़ संकल्प का परिणाम है. amphotericin बी का इलाज biofilms के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप छवियों (सी) में दिखाया जाता है. परिणाम मतलब ± मानक त्रुटि के लिए मतलब दो अलग - अलग 10 चिप्स युक्त हैं हर हालत के लिए replicates.
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Discussion
हम एक सेल आधारित उच्च घनत्व माइक्रोएरे, CA BChip, Candida albicans के biofilms के nanoliter संस्करणों से मिलकर विकसित किया है. माइक्रोएरे संशोधित ग्लास substrates, जो कोलेजन जेल स्थलों में से एक मजबूत लगाव के लिए अनुमति दी, जबकि एक गैर - प्रसार, अर्धगोल 3D जेल के लिए आवश्यक hydrophobicity प्रदान पर मुद्रित किया गया था. एक एकल Ca BChip लगभग आठ प्लेटें 96 अच्छी तरह से बदल सकते हैं, और कई चिप्स और एक ही समय में मुद्रित किया जा सकता है संसाधित. चिप नैनो पैमाने पर संस्कृतियों का इस्तेमाल, आसान और तेजी से निपटने के लिए अनुमति देता है, स्वचालन के लिए उत्तरदायी है, शारीरिक श्रम और लागत कम से कम और पूरी तरह से मानक माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी और उपकरणों के साथ संगत है. इसके अलावा, प्रौद्योगिकी लचीला है और आसानी से अन्य सूक्ष्मजीवों के लिए अनुकूलित कर सकते हैं. Miniaturization के बावजूद, नैनो biofilms Ca BChip प्रदर्शन गुण है कि सी के लक्षण हैं पर गठित श्वेत biofilm सहित जीवन शैली 3 डी architectur,ई और दवा प्रतिरोध. इस प्रकार, CA BChip सच स्क्रीनिंग उच्च throughput के लिए अनुमति देता है, और रोगाणुरोधी दवाओं की खोज में एक बदलाव के लिए संभावित है.
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Disclosures
जोस लोपेज-Ribot और आनंद MicrobeHTS टेक्नोलॉजीज, Inc, जो रोधी एजेंटों के विकास में लालकृष्ण रामसुब्रमण्यन खुद इक्विटी एल. MicrobeHTS टेक्नोलॉजीज इंक, इन अध्ययनों के लिए कोई वित्तीय सहायता प्रदान की है.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में दक्षिण टेक्सास प्रौद्योगिकी प्रबंधन (2009.041 POCrr), और अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केंद्र (1RR025767 उल) से चिकित्सा विज्ञान के एकीकरण के लिए संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था और दंत चिकित्सा और craniofacial रिसर्च के राष्ट्रीय संस्थान (से 5R21DE017294).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
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