Summary
Vi har utviklet en høy tetthet microarray plattform bestående av 3D nano-biofilm av
Abstract
Candida albicans fortsatt den viktigste agens av candidiasis, som for tiden representerer den fjerde vanligste nosokomiale blodbanen infeksjon i amerikanske sykehus 1. Disse opportunistiske infeksjoner utgjør en økende trussel for et økende antall av kompromitterte individer, og bære uakseptabelt høy dødelighet. Dette er delvis på grunn av den begrensede arsenal av soppdrepende medisiner, men også til utvikling av resistens mot de mest brukte soppdrepende midler. Videre kompliserer behandlingen er det faktum at et flertall av manifestasjoner av candidiasis er forbundet med dannelse av biofilm, og celler innenfor disse biofilmer viser økte nivåer av motstand til mest klinisk brukte antimykotika 2. Her beskriver vi utviklingen av en høy tetthet microarray som består av C. albicans nano-biofilm, som vi har kalt Ca BChip tre. Kort fortalt er en robot microarrayer brukt to print gjærceller av C. albicans inn på et fast underlag. Under utskrift er de gjærceller innelukket i en tredimensjonal matrise med et volum så lavt som 50 NL og immobilisert på et glass substrat med en passende belegg. Etter innledende utskriften er de lysbildene inkuberes ved 37 ° C i 24 timer for å tillate biofilm utvikling. I denne perioden flekkene vokse til fullt utviklede "nano-biofilmer" viser at typiske strukturelle og fenotypiske egenskaper knyttet moden C. albicans biofilm (dvs. morfologisk kompleksitet, tredimensjonale arkitektur og legemiddelresistens) 4. Totalt sett er Ca BChip sammensatt på ~ 750 likeverdige og romlig tydelig biofilm, med den ekstra fordelen at flere sjetonger kan skrives ut og behandles samtidig. Celleviabilitet anslås ved å måle fluorescerende intensiteten FUN1 metabolsk flekken med en microarray scanner. Dette sopp chip er ideelt for use i ekte high-throughput screening for soppdrepende medisiner. Sammenlignet med gjeldende standarder (dvs. 96-brønnen microtiter plate modell av biofilmdannelse 5), de viktigste fordelene av sopp biofilm chip er automatisering, miniatyrisering, besparelser i mengde og kostnad av reagenser og analyser tid, samt eliminering av arbeidskraft intensive trinn. Vi mener at en slik chip vil gi en betydelig raskere soppdrepende medisiner prosess.
Protocol
1. Utarbeidelse av functionalized Slides
- Plasser objektglass i en flyttbar lysbilde rack, og vaske to ganger ved å dyppe i en farging krukke inneholder 99% etanol (histologisk grade). Tørk lysbildene rent med papirhåndklær (sikrer ikke å generere papir støv), og tørt med en stråle av komprimert nitrogen gass.
MERK: Ikke bruk Kim-kluter for å tørke de lysbildene som det ville generere fint papir støv.
- Fordyp lysbildet stativet inneholder lysbildene i en farging krukke fylt med konsentrert svovelsyre og Inkuber ved romtemperatur over natten.
MERK: For å unngå kontakt med hud, bruk kjemikalieresistente hansker og beskyttelsesbriller når du arbeider med konsentrerte syrer og giftige og etsende kjemikalier.
- Sonicate lysbildene i 30 min og vask med Milli-Q (18 MΩ) vann i 30 min, følg med annen vask i encetone i 5 min. Denne behandlingen avslører silanol grupper på glassflaten.
- Coat de rene lysbilder med 2,5% (vol / vol i vann) av 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) løsning, ved å dyppe raset rack i APTES i 30 min, vask 3 ganger i Milli-Q vann i 15 min hver vask, og baking lysbildene i en ovn ved 110 ° C i 15 min. Baking kan kryss-linking av APTES, noe som resulterer i-NH2-funksjonalisering av overflaten.
MERK: Gjør APTES løsningen i en plastboks siden APTES innskudd fortrinnsvis på veggene av glass container.
- Ved hjelp av en spin coater, pels lysbildene med 1% (vekt / vol i toluen) Isopor-Co-maleinsyreanhydrid (PS-MA) (Sigma) for å oppnå en mono-lag av hydrofob belegg 6. Legg 2,0 mL PS-MA på en ren glass-slide montert på en snurr coater og frakk ved 3000 rpm i 30 s. Disse forholdene kan variere basert på spin coating parametere som belegg såforurensning, substrat, tykkelse av belegg og styrt av følgende ligning 7
hvor h er tykkelsen på film belegg, er e graden av fordampning, η, C og ρ er viskositet, konsentrasjon og tetthet av belegg løsning, henholdsvis, og ω er vinkelfarten.
MERK: Toluen er skadelig ved innånding i lang tid og bruk av en avtrekkshette anbefales.
- Lysbildene kan lagres i et lysbilde rack for inntil én måned i tørre og støvfrie forhold ved 2 - 8 ° C.
2. Utarbeidelse av gjær Inocula og Collagen Encapsulation
- Forbered en overnatting kultur C. albicans SC5314 belastning, i Gjær Peptone Dextrose [YPD; 10 g / l gjærekstrakt, 20 g / L pepton og 20 g / L druesukker] flytende medium ved å inokulere en eneste koloni av C. albicans i 10 - 20 ml av YPD 8. Inkuber kultur i en orbital shaker (ca 150-200 rpm) ved 30 ° C over natten. Harvests 1 ml Candida albicans gjærceller fra overnattingsturer YPD kulturer (ved sentrifugering ved 5000 rpm i 5-10 minutter) og vaske to ganger for 10 min i 1 mL sterilt fosfat saltløsning (PBS, 10 mM fosfatbuffer, 2,7 mM kaliumklorid, 137 mm natriumklorid, pH 7,4) (Sigma) per vask. Innhøstingen vasket celler også ved sentrifugering ved 1900 rpm i 10 minutter. Resuspender de vaskede celler i 1 mL rekonstruksjon buffer (0,2 N NaOH løsning med 2,2% (vekt / vol) natriumbikarbonat og 4,8% (vekt / vol) HEPES, pH 7,2).
MERK: C. albicans er en Risk Group 1/BSL1 mikroorganismen. Husk alltid å bruke gode aseptiske / sterile teknikker for arbeid med denne mikroorganismen og følge institusjonelle prosedyrer for avhending av biologisk materiale.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer på en lys felt mikroskop og justere til en celle tetthet av 5 × 10 7 celler / ml.
- Videre fortynne suspensjon ti ganger ved tilsetting av 10 × RPMI-1640 supplert med L-glutamin og buffered med morpholinepropanesulfonic (MOPS) syre (pH 7,2).
- Kapsle gjærceller i kollagen ved å blande cellesuspensjonen i RPMI-1640 med kollagen (1,8 mg / ml) (Type 1 fra rotte hale, BD Biosciences, Bedford, MA) til, få en endelig konsentrasjon på 4 × 10 6 celler / ml. Hold kollagen-cellesuspensjon på is for å hindre gelation av kollagen før utskrift.
3. Utarbeidelse av Ca BChip
- Rengjør og desinfiser alle flater av microarrayer, inkludert kilden plate stasjonen, vask og vakuum stasjon, vakuum lysbilde tallerken og utskrift kammer, ved å tørke av med 70% isopropanol.
- Plasser og hold av vakuum ønsket antall PS-MA-belagte glass lysbilder på lysbildet dekket av microarrayer.
- Vortex cellesuspensjonen i kollagen kraftig og aspirer 100 mL av godt blandet suspensjon i en brønn av en 96-brønns plate, like før utskrift. Plasser denne kilden plate i lasteslangen stasjonen.
- Slå på luftfukter for å opprettholde en relativ luftfuktighet på 100% i microarray kammeret hele trykkeprosessen.
- Skriv ut 50 nL av cellesuspensjon i en rekke av 48 rader og 16 kolonner med flekker fordelt 1,2 mm fra hverandre med en microarray spotter (Omnigrid Micro, Digilab Inc., Holliston, MA) av ikke-kontakt deponering hjelp Konisk koniske 190 mikrometer åpningssetet keramiske tips (Digilab).
- Prime, skyll og vakuum-tørk tips to ganger etter hver runde av utskrift.
- Umiddelbart etter utskrift, setter raset i en lufttett, fuktet kammeret (Hybridisering kassett, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) og inkuber ved 37 ° C i 24 timer for å tillate biofilmdannelse.
4. Resistenstesting av Preformed Biofilm i Ca BChip Against antimykotika
- Fra stamløsninger eller pulver av antifungal narkotika, utarbeide en fungerende løsning i RPMI-1640 medium. Typiske maksimale konsentrasjoner av arbeiderklassen løsningen er 1024 mikrogram / ml for flukonazol og 16 mikrogram / ml for amfotericin B 5. Andre konsentrasjoner kan brukes til ulike agenter.
- Forbered åtte ulike konsentrasjoner av det sammensatte ved å fortynne stamløsning i to-fold fortynninger, som spenner over et område med den anslåtte IC 50 av det sammensatte i midten.
- Etter 24 timers av biofilm vekst, bruke microarrayer å skrive ut 50 nL av åtte ulike konsentrasjoner av narkotika, sammen med positive (ingen medisin dvs. cellene i bare media) og negativ (behandlet med natriumhypokloritt i 20 min) kontroller, i minst seks replikater på toppen av biofilm.
MERK: Opprettholde en relativ luftfuktighet på 100% for å hindre uttørking av stedene mens addIng narkotika.
- Snart etter at de narkotika, inkuber chip med narkotika i en fuktet kammer ved 37 ° C i 24 timer.
- Vask narkotika ut av dunking i CaBChip 3-5 ganger i 2 min hver gang i PBS og flekker ved å inkubere Ca BChip med 0,5 mM FUN1 ved 37 ° C i 30 min 9.
- Vask flekken av ved dunking Ca BChip 3-5 ganger i PBS for 1-3 min hver dunk, og tørk Ca BChip med en nitrogen strøm. Les fluorescensintensiteten med en microarray scanner (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) ved en bølgelengde på 532 nm med en PMT gevinst på 380.
- Sett fluorescensintensiteten av den positive kontrollen (ingen medisin) og død (bleach-behandlet) biofilm flekker på 100% og 0%, henholdsvis.
- Bestem den prosentvise hemming av reduksjon i fluorescens intensitet (F) i forhold til gjennomsnittet av kontroll flekker ved hjelp av følgende ligning
hvor F, F max og F o er rå fluorescens intensiteter av narkotika-behandlet, ingen narkotika kontroll og bleach-behandlede flekker, henholdsvis. Skannerinnstillingene ble justert for å oppnå F max og F o på 30000 og 4000 RFU, henholdsvis.
- Beregn 50% hemmende konsentrasjon eller IC 50 ved å montere den variable skråningen Hill ligning hjelp GraphPad Prism Software (La Jolla, CA).
5. Representative Resultater
En representant Ca BChip, som består av en 48 × 16 matrise av nano-biofilm av C. albicans, er vist i figur 2. Den lyse felt mikroskopi viser en samlet arkitektonisk funksjon av nano-biofilm. De scanning elektronmikroskop mikroskopiske bilder av biofilm viser at sopp hyfer er integrert i matrise avkollagenfibre, som er ca 2 mikrometer og 100 nm i diameter, henholdsvis. De FUN1 Fargede microarray scanner bilder viser gjær og hyphal former, som er karakteristisk for sopp biofilm. 2D-og 3D-confocal fluorescens bilder av FUN1 Fargede biofilm kan sees å ha romlig heterogenitet, med regioner i metabolsk aktive celler ispedd innen det ekstracellulære matriks (sammensatt av kollagen som innkapsle materialet og mest sannsynlig også av exopolymeric materiale produsert av biofilm celler), som ikke farget av det metabolske fargestoff. Tykkelsen på biofilm ble anslått å være ca 50 mikrometer. Ca BChip ble brukt til å estimere soppdrepende mottakelighet av to narkotika, flukonazol og amfotericin B, og resultatene er vist i figur 3. I samsvar med publiserte rapporter om bransjestandard 96-brønns plate analyser, de biofilmer er resistente mot flukonazol 10 og beregnet IC 50 for amfotericin B er 0,3 mikrogram / ml 11.
Figur 1. Flytskjema for fabrikasjon av Ca BChip.
Figur 2. Et bilde av high-thoughput Ca BChip, skrives ved hjelp av en robot microarrayer og inneholder 768 flekker på PS-MA-belagte lysbilder. Hver halvkuleformet spot er 50 nL i volum, ca 700 mikrometer i diameter, og med en 1,2 mm skille mellom flekker. Også vist (med klokken) er lysmikroskopi, microarray scanner, 2D-og 3D-fluorescens mikroskopi, og scanning elektronmikroskopi bilder av de enkelte biofilm på Ca BChip. SEM figuren ved høy forstørrelse på 25.000 x viser en hyphal glødetråd av bredde 2 mikrometer.
Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg "/>
Figur 3. Resultater fra antifungal resistenstesting og fastsettelse av IC 50-verdier for (A) flukonazol og (B) amfotericin B ved hjelp Ca BChip. Fluorescens mikroskop bilder av amfotericin B-behandlede biofilmer er vist i (C). Resultatene er gjennomsnitt ± standard feil bety for to separate brikker inneholder 10 replikater for hver tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utviklet en cellebasert høy tetthet microarray, Ca BChip, bestående av nanoliter volumer av Candida albicans biofilm. Den microarray ble trykt på endret glass underlag, som tillot robust feste kollagen gel flekker samtidig som det gir hydrofobisitet nødvendig for en ikke-spredning, halvkuleformet 3D gel. En enkelt Ca BChip kan erstatte ca åtte 96-brønns plater, og flere chips kan skrives ut og behandles på samme tid. Brikken benytter nano-skala kulturer, sørger for enkel og rask håndtering, er mottagelig for automatisering, reduserer manuelt arbeid og kostnader, og er fullt kompatibel med standard microarray teknologi og utstyr. Dessuten er teknologien fleksibel og kan lett tilpasses andre mikroorganismer. Til tross for miniatyrisering, nano-biofilmer dannet på Ca BChip visningsegenskaper som er karakteristiske for C. albicans biofilm livsstil, inkludert 3D Arkitekture og narkotika motstand. Dermed lar Ca BChip for ekte high-throughput screening, og har potensial for et paradigmeskifte i antimikrobiell legemiddelforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jose L. Lopez-Ribot og Anand K. Ramasubramanian egen egenkapital i MicrobeHTS Technologies, Inc., som utvikler soppdrepende midler. MicrobeHTS Technologies, Inc. ga ingen økonomisk støtte til disse studiene.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert delvis med tilskudd fra South Texas Technology Management (POCrr 2009.041), Institutt for integrering av medisin og vitenskap fra National Center for Research Resources (UL 1RR025767), og fra National Institute of Dental og kraniofaciale Research ( 5R21DE017294).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
