הדמית פליטת אור של פעילות מונואמין NADPH במודלים של בעלי חיים שונים

Summary

מונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של מיני חמצן תגובתי (ROS) בphagocytes. בשל האופי הארעי של ROS, קשה למדוד ולעקוב אחר רמות ROS חי חיות. שיטה פולשנית לכימות סידורית של ROS בעכברים חיים מתוארת.

Abstract

מונואמין NADPH הוא אנזים שמתווך הגנה מארחת ואנטיבקטריאלי נגד פטריות. בנוסף לתפקידה בהגנה מארחת מיקרוביאלית, מונואמין NADPH יש פונקציות קריטיות איתות המווסתות את התגובה הדלקתית ^1. לכן, הפיתוח של שיטה למדידה ב" בזמן אמת "קינטיקה של דור ROS אוקסידאז המופק NADPH צפוי להיות כלי מחקר חשוב להבנת מנגנונים רלוונטיים לארח הגנה, דלקת, ופציעה.

מחלה כרונית granulomatous (CGD) היא הפרעה תורשתית של מונואמין NADPH מתאפיין זיהומים קשים ודלקות מוגזמות. הפעלה של מונואמין NADPH תא בלען דורשת טרנסלוקציה של יחידות המשנה שלה cytosolic (p47 ^phox, P67 ^phox, וp40 ^phox) וRAC לflavocytochrome קרום נכנס (מורכב מgp91 ^phox וp22 ^phox heterodimer). פסדפונקציה של מוטציות בכל אחד מאלה תוצאת רכיבי מונואמין NADPH בCGD. בדומה לחולים עם CGD, gp91 עכברים ^phox-p47 לקויים ועכברים ^{phox-חסרים} לי פגום פעילות תא בלען NADPH אוקסידאז ומארח לקוי הגנה ^{13, 14.} בנוסף לphagocytes, המכיל את רכיבי מונואמין NADPH שתוארו לעיל, מגוון של סוגי תאים אחרים להביע isoforms השונה של מונואמין NADPH.

כאן, אנו מתארים שיטה לכמת ייצור ROS בעכברים חיים ולהתוות את התרומה של מונואמין NADPH לדור ROS במודלים של דלקת ופגיעה. שיטה זו מבוססת על ROS מגיב עם L-012 (אנלוגי של לומינול) לפלוט הארה שנרשמה על ידי מכשיר תשלום מצמיד (CCD). בתיאור המקורי של חללית L-012, L-012 chemiluminescence תלוי בוטל לחלוטין על ידי dismutase superoxide, המציין כי ROS העיקרי זוהה בתגובה זה היה סופראניון תחמוצת ^15. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי L-012 יכולים לזהות רדיקלים חופשיים אחרים, כולל מינים תגובתי חנקן ^{16, 17.} Kielland et al. ¹⁷ הראה כי יישום המקומי של יצטט phorbol myristate, activator החזק של מונואמין NADPH, הוביל לדור מונואמין NADPH התלוי ROS שניתן היה לזהות בעכברים באמצעות חללית זורח L-012. במודל זה, הם הראו כי הארת L-012-תלויה בוטלה בעכברי p47 ^{phox-לקויים.}

אנחנו לעומת דור ROS בעכברי wildtype וNADPH אוקסידאז-p47 לקוי ^{phox-/ -} עכברים ² בשלושת הדגמים הבאים: 1) ממשל intratracheal של zymosan, תא פרו דלקתי פטרייתי המופק מקיר מוצר שיכול להפעיל מונואמין NADPH: 2) קשירת cecal ולנקב (CLP), מודל של אלח דם תוך בטנים עם דלקת ריאות חריפות משניות ופציעה; ו3) פחמן טטראכלורי האוראלי(CCl _4), מודל של פגיעה כבדית ROS תלויה. מודלים אלה נבחרו במיוחד כדי לבדוק את דור ROS מונואמין NADPH תלוי בהקשר של דלקת שאינה זיהומית, אלח דם polymicrobial, ופציעת איבר רעל מושרה, בהתאמה. השוואת פליטת אור בעכברי wildtype לp47 ^{phox-/ -} עכברים מאפשר לנו להתוות את התרומה הספציפית של ROS שנוצרה על ידי p47 מונואמין NADPH ^phox המכיל לאות bioluminescent בדגמים אלה.

תוצאות הדמית פליטת אור שהפגינו רמות גבוהות ROS בעכברי wildtype לעומת p47 ^{phox-/ -} עכברים הצביעו על כך שמונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של דור ROS בתגובה לגירויים דלקתיים. שיטה זו מספקת גישה זעירה פולשנית לניטור "בזמן אמת" של דור ROS במהלך הדלקת בגוף חי.

Protocol

1. מודלים של בעלי חיים

1. עכברים: השתמשו p47 ^{phox-/ -} עכברים ועכברי גיל ומין בהתאמת C57BL6/DBA. לקבל אישור לניסויים מטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדה ושימוש.
2. הרדמה: השתמש במערכת ממשל isoflurane מתמשכת כדי לגרום הרדמה. מערכת האידוי (VetEquip) מלאה בisoflurane (2-3%). אשר שהעכברים מורדמים באופן מלא על ידי התבוננות בנשימה, תנועה, ורפלקס הקרני בתגובה לגירויים חיצוניים.
3. ניתוחים: לשפשף את אזור הניתוח (benchtop) עם אתנול 70%. ללבוש כפפות סטריליות וחלוק ניתוחים נקיים ומסכה. הכן את העכברים על ידי גזירת שיער ויישום פולידין לסירוגין עם אתנול 70% לאזור שבו יבוצע החתך. ביצוע ניתוח על משטח סטרילי ולהשתמש בכלים סטריליים. עכברי Monitor לאחר operatively עד ער ולנוע בחופשיות.
4. ממשל zymosan Intratracheal
   1. לנהל הרדמהכפי שמתואר ב1.2.
   2. לחטא את אזור ניתוח (בצוואר) עם פולידין ו70% אתנול ולחשוף את קנה הנשימה על ידי נתיחה כירורגית.
   3. פירס קנה נשימה עם מחט 27-מד ולהזריק zymosan (סנט לואיס, מיזורי) במינון של 1 מיקרוגרם / g באמצעות 0.5 מיקרוגרם / μl פתרון (סך הכל 50 μl נפח לעכבר 25 גרם) מומס בPBS סטרילית.
   4. צוואר עכברים סגור פצע עם 5-0 תפרי משי בתנאים סטריליים אספטיים.
   5. תמונה לאחר 4 שעות ו 24 שעות.
5. הקשירה ולנקב Cecal
   1. לנהל הרדמה כמתואר ב1.2.
   2. קליפ שיער באזור הניתוח (בטן) ולחטא עם פולידין ו70% אתנול.
   3. בצע laparotomy קו אמצע ולזהות cecum.
   4. לקשור 50% הדיסטלי של cecum נחשף עם תפר משי 4-0 וcecum לנקב דיסטלי לקשירה עם מעבר אחד של מחט 21-מד.
   5. תתפור את החתך בתפרי משי סטריליים 4-0.
   6. תמונה לאחר 4 שעות ו24 שעות.
6. אוראלי פחמן טטרא (CCl ₄₎ ממשל
   1. לנהל הרדמה כמתואר ב1.2.
   2. לנהל CCl ₄ (2 מיקרוגרם / גרם, סנט לואיס, מיזורי) מומס בשמן תירס ידי gavage האוראלי. ההליך של CCl4 ממשל צריך להתבצע באזור מיועד בהתאם למדיניות IBC / EHS.
   3. תמונה לאחר 4 שעות ו 24 שעות.

2. רכישת תמונת bioluminescent

1. לאתחל את מערכת IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) הדמיה, מוגדרת למצב הארה, ולחכות למכשיר תשלום המצמיד (CCD) הטמפרטורה לנעול.
2. בחר זמן חשיפה, binning (בינוני) וF / עצירה (8) הגדרות.
3. עכברי מקום במצב שכיבה בחדר ההדמיה בשלב מחומם כדי לשמור על טמפרטורת גוף תקינה. לנהל הרדמה כמתואר ב1.2 באמצעות חרטום בעוד עכברים נמצאים בחדר הדמית IVIS.
4. לנהל L-012 (20 מיקרוגרם / גרם) מומס סטרילי PBS (10 מיקרוגרם / μl) לוריד באמצעות הזרקת רטרו מסלולית בכל נקודת זמן שנבחרה להדמיה.
5. צלם תמונות המתחילות ב 2 דקות לאחר-012 ליטר הזרקה. אנו משתמשים בדרך כלל חשיפת 40 שניות.

3. ניתוח נתונים באמצעות אזור של עניין

1. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת תמונת חי v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
2. פתח תמונה ובחר מדידה של האזור של כלי ריבית.
3. בחר האזור בצורת ריבית וגודל מעל חזה או / ובטן לאחר שכיסה תמונה דיגיטלית פסאודו צבעונית (המייצג זיהוי פוטון) על דימוי מצולם של העכבר.
4. לכמת עוצמת אות (פוטון שטף) מהאזור של עניין.

4. סטטיסטיקה

1. השתמש בחבילת תוכנת ניתוח סטטיסטית כדי לבצע ANOVA דו כיוונית עם פוסט בדיקות Bonferroni בנקודתי זמן בודדות.

TLE "> 5. נציג תוצאות

Zymosan הוא מוצר פרו דלקתי תא שמרים קיר וactivator חזק של מונואמין NADPH ^3. אנחנו הראינו בעבר כי zymosan intratracheal גורם דלקת חזקה יותר neutrophilic ריאות וייצור ציטוקינים פרו דלקתי בp47 ^{phox-/ -} בהשוואה לעכברי wildtype ^1. כאן, המטרה שלנו הייתה להשוות דור ROS ריאות של wildtype וp47 ^{phox-/ -} העכברים בעקבות אתגר zymosan. ב 4 שעות לאחר מתן zymosan intratracheal, אנו נצפינו עלייה משמעותית בפליטת פוטון על החזה בעכברים בהשוואה לתחילת המחקר wildtype כמו גם עלייה בפליטת הפוטון בwildtype לעומת p47 ^{phox-/ -} עכברים ב4 שעות ו 24 שעות. לעומת זאת, אותות פליטת אור בp47 ^{phox-/ -} עכברים נשארו ברמת הבסיס ב 4 שעות לאחר טיפול zymosan (תמונת 1 א.ב.). לפיכך, מונואמין NADPH נראה בדואר המקור העיקרי של דור ROS את הריאות בעקבות ממשל zymosan.

בשלב הבא, הערכנו ייצור ROS במודל אלח דם CLP-Induced. אלח דם הוא תסמונת מסכנת חיים קשורים בפגיעת קצה איבר, כולל פציעה אקוטית ריאות (עליי) ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) ^{4, 5.} פציעת ROS בתיווך כבר נחשב לגורם חשוב בתפקוד נהיגת אלח דם מושרה מרובי איברים. מצאנו כי ROS הוגדלו באופן משמעותי על החזה (4 שעות) ועל הבטן (24 שעות) לאחר CLP בעכברי wildtype לעומת תחילת מחקר. עם זאת, רמות ROS בp47 ^{phox-/ -} עכברים היו דומות לרמת הבסיס בשתי נקודתי זמן (Fig.2 AC). תוצאות אלו מראות כי דור ROS במודל עכבר אלח דם CLP-Induced הוא NADPH אוקסידאז תלוי.

לבסוף, השתמש הדמית bioluminescent לזהות ייצור ROS במצב פגיעה בכבד _4-מושרה CClאני. CCl ₄ גורם נימק hepatocellular, ומאז משמש למודל גם פגיעה בכבד חריף וסיסטיק הכבד ^6. בניגוד למודלים שתוארו לעיל של דלקת ופגיעה, מצא כי ייצור ROS בבטן היה בצניעות (כ 35%) עלה מעל קו הבסיס בp47 ^{phox-/ -} עכברים ב4 שעות לאחר ₄ ממשל CCl. עם זאת, סדר הגודל של _4-CCl המושרה ROS הדור היה גדול באופן משמעותי בעכברי wildtype מאשר בp47 ^{phox-/ -} עכברים (איור .3 א.ב.). נתונים אלה מצביעים על כך שגם דור ROS p47 ^phox המכיל NADPH תלוי-אוקסידאז ועצמאי מתרחשים בCCl האקוטי פגיעה בכבד _{4-מושרה.}

איור 1. ייצור ROS בריאות לאחר טיפול zymosan. א) הנציג bioluminescence הדמיה של ייצור ROS. שים לב שבנוסף לחזה, הארה ניתן לזהות על הבטן ובהן wildtype p47 ^{phox-/ -} עכברים והארת בטן היא ללא שינוי על ידי טיפול zymosan. B) ספירת פוטון מהחזה של wildtype וp47 ^{phox-/ -} עכברים לאחר זריקה אחת intratracheal (IT) של zymosan. הדמית פליטת אור בוצעה בתחילת מחקר, 4 שעות, 24 שעות ו. פליטת אור מהאזור של עניין על החזה זוהתה באמצעות סולם המצוין פסאודו צבע. תוצאות מוצגות כממוצע ± SE, n = 6-9 לקבוצה, * = p <0.05. לחץ כאן לקבלת דמות גדולה.

איור 2. איתור ROS בעקבות CLP. ) הדמית פליטת אור נציג של ROS ייצור, Bספירה) פוטון מהחזה, ו-C) ספירת פוטון מהבטן של wildtype וp47 ^{phox-/ -} העכברים בתחילת מחקר, 4 השעות, 24 שעות ולאחר CLP. תוצאות מוצגות כממוצע ± SE, n = 4-5 לקבוצה, * = p <0.05. לחץ כאן לקבלת דמות גדולה.

איור 3. ייצור ROS בבטן לאחר CCl פגיעה בכבד _{4-מושרה.} ) הדמית פליטת אור נציג ייצור ROS וB) ספירת פוטון מהבטן של wildtype וp47 ^{phox-/ -} עכברים בתחילת מחקר, 4 שעות, 24 שעות ולאחר ₄ טיפול CCl אוראלי. תוצאות מוצגות כממוצע ± SE;. N = 4-5 לקבוצה, * = p <0.05 לחץ כאן לקבלת דמות גדולה

Discussion

מדידה "בזמן אמת" של מיני חמצן תגובתי (ROS) בבעלי חי חיים יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בבדיקות ניאון וchemiluminescent. בעוד בדיקות ניאון סובלות מצורך יחסי אות לרעש חלשים ^12, טכניקת ההדמיה תארה היא רגישה יותר לזיהוי של פליטת אור בעקבות תגובה כימית של ROS עם מצע לומינול מבוסס L-012. כמו כל שיטות הדמית bioluminescent, מתודולוגיה זו היא מוגבלת על ידי קליטת אור גל תלוי ופיזור על ידי איברים ורקמות. ניסויים אלה מתמקדים בהקמת תנאי ניסוי מתאימים למדידה של ROS בwildtype וp47 ^{phox-/ -} עכברים. השימוש בעכברים המהונדסים גנטי אלה מאפשר לנו להבדיל ROS שנוצר על ידי מונואמין p47 ^phox המכיל NADPH מROS שנוצר על ידי מסלולים אחרים.

למרות מונואמין NADPH פונקציונלי המכיל p47 ^phox הואמקור עיקרי של ROS, isoforms מונואמין NADPH האחר קיימות, ומערכות נוספות להפקת ROS, כולל מונואמין xanthine והנשימה של המיטוכונדריה, יכולות לייצר ROS. מונואמין NADPH ואחר ROS מניב נתיבים יכול להיות השפעה חשובה ואינטראקטיבית על הגנה מארחת מיקרוביאלית ומסלולי איתות במורד זרם המווסתים את הדלקת ופגיעת ^7-10. באמצעות הדמית פליטת אור, הצליח למדוד קינטיקה של ייצור ROS in vivo ולהתוות את התרומה של מונואמין NADPH לרמות ROS במודלים דלקתיים שונים.

מגבלה של שיטה זו מתייחסת לרזולוציה מרחבית של פליטת אור. למרות שאנו יכולים למדוד הארה בתוך תאים אנטומיים ספציפיים (למשל., בית חזה, בטן), קשה למקם את האתר האנטומי של הארה ברמת האיברים. בכל אחד ממודלי הניסויים שלנו בחרנו 3 נקודות זמן למדידות bioluminescent: בסיסית, 4 שעות, 24 שעות ו. אנחנו לא יודעים אם bioluminescent הדמיה יכולה לזהות הבדלים קטנים בדור ROS מעל מרווחים קצרים יותר של ניתוח או אם הקשר בין הדור ובפליטת אור vivo ROS הוא ליניארי. בעיות אלה דורשות מחקר נוסף. במודלים המשמשים למחקרים אלה, אנו חושדים כי תאי phagocytic, נויטרופילים גויסו ומקרופגים, הם אחראים עיקריים לייצור ROS באמצעות מערכת מונואמין NADPH תא בלען. מחקרים עתידיים שבו סוגי תאים ספציפיים מדולדלים או כימרות עצם נוצרים יכולים לספק ידע נוסף על רמות יחסיות של דור ROS מאוכלוסיות תאים שונות. מגבלה אפשרית נוספת של מחקרים באמצעות L-012 היא כי רדיקלים אחרים (מלבד ROS) עלולים להגיב בחללית זורח זה, הפחתה ספציפית לגילוי ROS בנסיבות מסוימות.

בעקבות הזרקת zymosan, חוסר ייצור ROS בp47 ^{phox-/ -} עכברים עולים כי מונואמין NADPH הואהמקור העיקרי של ROS במודל זה של דלקת ריאות. CLP הוא אחד מהמודלים של בעלי החיים הנפוצים ביותר של אלח דם ¹¹ והדמית פליטת אור הגילה עלה אותות ROS בשתי הריאות ובטן שהיו NADPH אוקסידאז תלוי. בניגוד למודלי CLP zymosan ו, ROS הוגדלו בבטן של שניהם wildtype וp47 ^{phox-/ -} עכברים בהשוואה לתחילת מחקר, אך במידה רבה יותר בעכברי wildtype, המציין כי CCl ₄ גורם ייצור ROS ידי p47 ^phox - המכיל מונואמין NADPH ומנגנונים אחרים.

לסיכום, הנתונים שלנו מראים כי שיטת הדמית פליטת אור לומינול מבוססת על זיהוי של ROS יכולה להיות כלי רב ערך למחקר על הרגולציה והשלכות של ייצור ROS in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
Zymosan	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
carbon tetrachloride	Sigma, St. Louis, MO	289116