Summary
NADPH oksidase er den viktigste kilden til reaktive oksygen arter (ROS) i fagocytter. På grunn av det flyktige natur ROS, er det vanskelig å måle og overvåke ROS nivåer i levende dyr. En minimal invasiv metode for seriell kvantifisering av ROS i levende mus er beskrevet.
Abstract
NADPH oksidase er en kritisk enzym som formidler antibakteriell og soppdrepende vert forsvar. I tillegg til sin rolle i antimikrobiell vert forsvar, har NADPH oksidase kritiske signaliserer funksjoner som modulerer betennelsesreaksjon en. Således er utviklingen av en fremgangsmåte for å måle i "real-time" kinetikk NADPH oksidase-avledet ROS generasjon forventet å være et verdifullt forskningsverktøy å forstå mekanismene relevante vert forsvar, inflammasjon og skade.
Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) er en arvelig lidelse av NADPH oksidase preget av alvorlige infeksjoner og overdreven betennelse. Aktivering av phagocyte NADPH oksidase krever translokasjon av sine cytosoliske subenheter (P47 phox, P67 phox, og p40 phox) og Rac til en membran-bundet flavocytochrome (sammensatt av en gp91 phox og p22 phox heterodimer). Tapav funksjon mutasjoner i noen av disse NADPH oksidase komponenter resultat i CGD. I likhet med pasienter med CGD, gp91 phox-mangelfull mus og P47 phox-mangelfull mus har defekt phagocyte NADPH oksidase aktivitet og nedsatt vert 13 forsvar, 14. I tillegg til fagocytter, som inneholder de NADPH oksidase komponenter beskrevet ovenfor, en rekke andre celletyper uttrykker forskjellige isoformer av NADPH oksidase.
Her beskriver vi en metode for å kvantifisere ROS produksjon i levende mus samt avgrense bidrag NADPH oksidase til ROS generasjon i modeller av betennelse og skade. Denne metoden er basert på ROS omsetning med L-012 (en analog av luminol) som sender ut luminescens som er registrert av en charge-coupled device (CCD). I den opprinnelige beskrivelsen av L-012-proben, ble L-012-avhengig kjemiluminescens helt avskaffet ved superoxide dismutase, som indikerer at de viktigste ROS påvist i denne reaksjonen var superoksid anion 15. Senere studier har vist at L-012 kan detektere andre frie radikaler inkludert reaktive nitrogenforbindelser 16, 17. Kielland mfl.. 17 viste at topisk påføring av forbol myristat acetat, en potent aktivator av NADPH oksydase, førte til NADPH oksidase-avhengig ROS generasjon som kunne påvises i mus ved hjelp av den luminescerende sonde L-012. I denne modellen, viste de at L-012-avhengige luminescence ble avskaffet i P47 phox-mangelfull mus.
Vi sammenlignet ROS generasjon i wildtype mus og NADPH oksidase-mangelfull P47 phox-/ - mus 2 i følgende tre modeller: 1) intratrakeal administrasjon av zymosan, en pro-inflammatorisk soppens cellevegg-avledet produkt som kan aktivere NADPH oksidase, 2) cecal ligation og punktering (CLP), en modell av intra-abdominale sepsis med sekundær akutt lunge betennelse og skade, og 3) muntlig karbontetraklorid(CCl 4), en modell av ROS-avhengige leverskade. Disse modellene ble spesielt utvalgt for å evaluere NADPH oksidase-avhengige ROS generasjon i sammenheng med ikke-infeksiøs inflammasjon, polymikrobielle sepsis og toksin-indusert orgel skade, henholdsvis. Sammenligning Bioluminescens i wildtype mus til P47 phox-/ - mus gjør at vi kan avgrense den spesifikke bidrag ROS generert av P47 phox-holdig NADPH oksidase til bioluminescent signalet i disse modellene.
Bioluminesens imaging resultater som viste økt ROS nivåer i wildtype mus sammenlignet med P47 phox-/ - mus indikerte at NADPH oksidase er den viktigste kilden til ROS generasjon som svar på inflammatoriske stimuli. Denne metoden gir en minimal invasiv tilnærming for "real-time" overvåking av ROS generasjon ved betennelse in vivo.
Protocol
1. Dyremodeller
- Mus: Bruk P47 phox-/ - mus og alder-og sex-matchet C57BL6/DBA mus. Innhente godkjenning for eksperimenter fra Institutional Animal Care og bruk komité.
- Anestesi: Bruk en kontinuerlig isofluran administrasjon system for å indusere anestesi. Fordamperen systemet (VetEquip) er fylt med isofluran (2-3%). Bekrefter at mus er fullt bedøvet ved å observere respirasjon, bevegelse, og hornhinnen refleks som svar på ytre stimuli.
- Kirurgiske prosedyrer: Skrubb den kirurgiske området (stasjonær) med 70% etanol. Slitasje sterile hansker og et rent kirurgisk kappe og maske. Forbered musene ved klipping håret og påføring Betadine alternerende med 70% etanol til området der snittet vil bli gjort. Utføre kirurgi på et sterilt underlag og bruke sterile instrumenter. Monitor mus postoperativt til våken og beveger seg fritt.
- Intratrakeal zymosan administrasjon
- Administrere anestesisom beskrevet i 1.2.
- Desinfisere kirurgisk område (halsen) med Betadine og 70% etanol og utsett luftrøret ved kirurgisk disseksjon.
- Pierce luftrøret med en 27-gauge nål og injisere zymosan (St. Louis, MO) i en dose på 1 ug / g ved hjelp av en 0,5 ug / ul oppløsning (totalt volum 50 ul for en 25 g mus) oppløst i sterilt PBS.
- Lukk mus halsen sår med 5-0 sterile silke suturer under aseptiske forhold.
- Bilde etter 4 timer og 24 timer.
- Cecal ligation og punktering
- Administrere anestesi som beskrevet i 1.2.
- Klipp håret i kirurgiske området (abdomen) og desinfisere med Betadine og 70% etanol.
- Utfør en midtlinjen laparotomi og identifisere cecum.
- Ligere den distale 50% av eksponert cecum med 4-0 silke sutur og punktering cecum distalt for ligation med ett pass av en 21-gauge nål.
- Lukk snittet med 4-0 sterile silke suturer.
- Bilde etter 4 timer og24 hr.
- Oral karbontetraklorid (CCl 4) administrasjon
- Administrere anestesi som beskrevet i 1.2.
- Administrer CCl 4 (2 ug / g, St. Louis, MO) oppløst i maisolje ved oral gavage. Prosedyren for CCl4 administrasjon bør utføres i et angitt område i samsvar med IBC / EHS politikk.
- Bilde etter 4 timer og 24 timer.
2. Anskaffelse av en Bioluminescent Bilde
- Initialiser IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, satt til luminescence modus, og vente på charge-coupled device (CCD) temperatur for å låse.
- Velg eksponeringstid, binning (middels) og F / stopp (8) innstillinger.
- Place mus i ryggleie i bildebehandling kammer på et oppvarmet scene å opprettholde normal kroppstemperatur. Administrere anestesi som beskrevet i 1.2 via nesen kjegle mens mus er i IVIS bildebehandling kammeret.
- Administrer L-012 (20 ug / g) oppløst i sterilt PBS (10 ug / ul) intravenøst via retro-orbital injeksjon ved hvert tidspunkt valgt for avbildning.
- Ta bilder som begynner på 2 min etter L-012 injeksjon. Vi bruker vanligvis en 40 sek eksponering.
3. Dataanalyse ved hjelp Region of Interest
- Analysere data ved hjelp levende bilde-programvare V.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
- Åpne et bilde og velg måling av region av interesse verktøy.
- Velg Region av interesse form og størrelse på brystet og / eller magen etter overliggende en pseudo-farget digitalt bilde (som representerer foton deteksjon) over et fotografisk bilde av musen.
- Kvantifisere signal intensitet (foton flux) fra regionen av interesse.
4. Statistikk
- Bruk statistisk analyse programvarepakke for å utføre toveis ANOVA med Bonferroni post-testing på individuelle tidspunkter.
Zymosan er et pro-inflammatorisk gjærcelle vegg produkt og en potent aktivator av NADPH oksidase 3. Vi har tidligere vist at intratrakeal zymosan induserer en mer robust nøytrofil lunge betennelse og pro-inflammatorisk cytokin produksjon i P47 phox-/ - i forhold til wildtype mus 1. Her var målet vårt å sammenligne ROS generasjon i lungene wildtype og P47 phox-/ - mus etter zymosan utfordring. På fire timer etter intratrakeal zymosan administrasjon, observerte vi en betydelig økning i foton emisjon på brystet i wildtype mus sammenlignet med baseline samt en økning i foton emisjon i wildtype sammenlignet med P47 phox-/ - mus på 4 timer og 24 timer. I kontrast, bioluminesens signaler i P47 phox-/ - forble mus ved baseline nivå på 4 timer etter zymosan behandling (Fig.1 AB). Således synes NADPH oksidase til be den viktigste kilden til ROS generasjon i lungene etter zymosan administrasjon.
Deretter vurderte vi ROS produksjon i CLP-indusert sepsis modell. Sepsis er en livstruende syndrom forbundet med end-organ skade, herunder akutt lungeskade (ALI) og akutt respiratorisk distress syndrom (ARDS) 4, 5. ROS-mediert skade har vært ansett å være en viktig faktor driver sepsis-indusert multi-organ dysfunksjon. Vi fant ut at ROS var signifikant økt i brystet (4 t) og over magen (24 timer) etter CLP i wildtype mus sammenlignet med utgangspunktet. Men ROS nivåer i P47 phox-/ - var mus lik baseline nivåer på begge tidspunkter (Fig.2 AC). Disse resultatene viser at ROS generasjon i CLP-indusert sepsis musemodellen er NADPH oksidase-avhengig.
Til slutt har vi brukt bioluminescent å påvise ROS produksjon i et CCl 4-indusert leverskade modusl.. CCl 4 forårsaker hepatocellulær nekrose, og har blitt brukt til å modellere både akutt leverskade og hepatisk fibrose 6. I motsetning til de tidligere beskrevne modeller av betennelse og skade, har vi funnet at ROS-produksjon i magen var beskjedent (ca 35%) økt over baseline i P47 phox-/ - mus ved 4 t etter CCl 4 administrasjon. Var imidlertid omfanget av CCl 4-indusert ROS generasjon signifikant større i wildtype mus enn i P47 phox-/ - mus (Fig.3 AB). Disse dataene antyder at både P47 phox-holdig NADPH oksidase-avhengig og uavhengig ROS generasjon oppstå i akutt CCl 4-indusert leverskade.
Figur 1. ROS produksjon i lungene etter zymosan behandling. A) Representant bioluminescence avbildning av ROS produksjon. Merk at i tillegg til brystet, er luminescens påvises over magen i både wildtype og P47 phox-/ - mus og abdominal luminescens er uforandret av zymosan behandling. B) fotontellinger fra brystet av wildtype og P47 phox-/ - mus etter en enkelt intratrakeal (IT) injeksjon av zymosan. Bioluminescens bildebehandling ble utført ved baseline, 4 t, og 24 timer. Lysemisjon fra regionen av interesse på brystet ble identifisert ved hjelp av den angitte pseudo-fargeskala. Resultater er presentert som gjennomsnitt ± SE, n = 6-9 per gruppe, * = p <0,05. Klikk her for større figur .
Figur 2. ROS deteksjon etter CLP. A) Representant Bioluminescens avbildning av ROS produksjon, B) Fotontellinger fra brystet, og C) fotontellinger fra magen til wildtype og P47 phox-/ - mus ved baseline, 4 timer og 24 timer etter CLP. Resultater er presentert som gjennomsnitt ± SE, n = 4-5 per gruppe, * = p <0,05. Klikk her for større figur .
Figur 3. ROS produksjon i magen etter CCl 4-indusert leverskade. A) Representant Bioluminescens avbildning av ROS produksjon og B) fotontellinger fra magen til wildtype og P47 phox-/ - mus ved baseline, 4 timer, og 24 timer etter oral CCl 4 behandling. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SE,. N = 4-5 per gruppe, * = p <0,05 Klikk her for større figur
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
"Real-time" måling av reaktive oksygenarter (ROS) i levende dyr kan oppnås ved å bruke fluorescerende og kjemiluminescerende prober. Mens fluorescerende prober lider ha svake signal-til-støy-forhold 12 er avbildningsteknikk beskrives mer følsom for påvisning av lysemisjon etter en kjemisk reaksjon av ROS med luminol-baserte substratet L-012. Som alle bioluminescent avbildningsteknikker, er denne metoden begrenset av bølgelengde-avhengig lysabsorpsjon og scatter av organer og vev. Disse eksperimentene ble fokusert på å etablere riktige eksperimentelle forhold for måling av ROS i wildtype og P47 phox-/ - mus. Bruken av disse genmodifiserte mus gjør at vi kan skille ROS generert av P47 phox-holdig NADPH oksidase fra ROS generert av andre baner.
Selv om funksjonell NADPH oksidase inneholder P47 phox eren viktig kilde til ROS, andre NADPH oksidase isoformer finnes, og ytterligere ROS-genererende systemer, inkludert xantinoksidase og mitokondrie respirasjon, kan produsere ROS. NADPH oksidase og andre ROS-generering trasé kan ha viktige og interaktive effekter på antimikrobiell vert forsvar og nedstrøms signalveier som modulerer betennelse og skade 7-10. Bruke Bioluminescens bildebehandling, var vi i stand til å måle kinetikken til ROS produksjon in vivo samt avgrense bidrag NADPH oksidase til ROS nivåer i ulike inflammatoriske modeller.
En begrensning av denne metoden vedrører romlig oppløsning av bioluminescens. Selv om vi kan måle luminescence innenfor bestemte anatomiske avdelinger (f.eks., Thorax, abdomen), er det vanskelig å lokalisere den anatomiske området av luminescence ved orgelet nivå. I hver av våre eksperimentelle modeller valgte vi tre tidspunkter for selvlysende målinger: Baseline 4 timers og 24 timers. Vi vet ikke om bioluminescent imaging kan identifisere små forskjeller i ROS generasjon over kortere intervaller på analyse eller om forholdet mellom in vivo ROS generasjon og Bioluminescens er lineær. Disse problemene krever videre studier. I modellene som brukes for disse studiene, mistenker vi at phagocytic celler, rekruttert nøytrofile og makrofager, er primært ansvarlig for ROS produksjon via phagocyte NADPH oksidase system. Fremtidige studier hvor bestemte celletyper utarmet eller bein chimeras genereres kunne gi ytterligere kunnskap om relative nivåer av ROS generasjon fra ulike celle populasjoner. En annen potensiell begrensning av studier med L-012 er at andre radikaler (foruten ROS) kan reagere med denne selvlysende probe, redusere spesifisitet for ROS deteksjon i enkelte tilfeller.
Etter zymosan injeksjon, mangel på ROS produksjon i P47 phox-/ - mus viser at NADPH oksidase erden viktigste kilden til ROS i denne modellen av lungebetennelse. CLP er en av de vanligste dyremodeller av sepsis 11 og Bioluminescens bildebehandling avslørt økt ROS signaler i både lunge og magen som var NADPH oksidase-avhengige. I motsetning til zymosan og CLP-modellene ble ROS økt i magen av begge wildtype og P47 phox-/ - mus sammenlignet med baseline, men i større grad i wildtype mus, noe som indikerer at CCl 4 induserer ROS produksjon av P47 phox - inneholder NADPH oksidase og andre mekanismer.
I sammendraget, våre data viser at en luminol-baserte Bioluminescens bildebehandling metode for påvisning av ROS kan være verdifullt verktøy for forskning på regulering og konsekvenser av ROS produksjon in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH RO1 AI079253 og Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
