Summary
NADPH氧化酶在巨噬细胞的活性氧（ROS）的主要来源。由于ROS的短暂性的，它是难以衡量和监测中生活的动物的细胞内ROS水平。 ROS在活小鼠的串行量化的一种微创的方法。
Abstract
NADPH氧化酶是一种关键的酶介导的抗菌和抗真菌的宿主防御。 NADPH氧化酶除了其抗菌宿主防御中的作用，具有关键的信令功能，调节炎症反应1。因此，发展的方法来衡量“实时”的动力学NADPH氧化酶衍生的活性氧的产生是一个有价值的研究工具，了解相关的宿主防御，炎症和损伤的机制。
慢性肉芽肿病（CGD）是一种遗传性疾病的特点是严重感染和过度炎症反应的NADPH氧化酶。吞噬细胞的NADPH氧化酶的激活需要易位其胞浆亚基（PHOX，P67 PHOX的p47和p40的PHOX）和Rac的膜- ，绑定flavocytochrome（由一个gp91 phox和22页PHOX异二聚体）。损失在任何这些NADPH氧化酶成分结果在CGD的功能的突变。相似患者CGD，gp91 PHOX-缺陷小鼠和的p47 PHOX-缺陷小鼠有缺陷的吞噬细胞的NADPH氧化酶的活性和受损的宿主防御13，14。除了的吞噬细胞，其中含有上述成分的NADPH氧化酶，各种其他类型的细胞表达的NADPH氧化酶的不同的亚型。
在这里，我们描述了一种方法来量化ROS生产的活老鼠，并划定的贡献，NADPH氧化酶的活性氧的产生的炎症和损伤模型中的。这种方法是基于对ROS与L-012（鲁米诺类似物）反应，以发射由一个电荷耦合器件（CCD），被记录的发光。在原始描述的L-012探针，L-012-依赖化学发光完全废除了超氧化物歧化酶，表明在该反应中检测到的主要活性氧是超级超氧阴离子15。随后的研究表明，L-012，可以检测到的其他自由基，包括活性氮物种16，17。 kielland等17表明，局部应用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯，一种强力的NADPH氧化酶的活化剂，导致NADPH氧化酶-依赖性ROS生成使用发光探头L-012的小鼠中可检测到的。在这个模型中，他们表明：，P47 PHOX缺失的小鼠L-012-依赖的发光被取消。
我们比较了野生型小鼠和NADPH氧化酶缺乏P47 PHOX-/ -小鼠在以下三种模式：1）气管内给药的酵母，真菌细胞的促炎症墙衍生产品，可以激活NADPH氧化酶的活性氧的产生; 2）盲肠结扎穿刺（CLP），继发性急性肺部炎症和损伤腹内脓毒症模型; 3）口服四氯化碳（CCL），ROS依赖的肝损伤模型。这些模型是专门选定在非感染性炎症，多菌性败血症，毒素诱导的脏器损伤的情况下，分别评估NADPH氧化酶 - 依赖性ROS生成。在野生型小鼠比较，生物发光P47 PHOX-/ -小鼠，使我们能够描出P47 PHOX含NADPH氧化酶的生物发光信号在这些模型中所产生的ROS的具体贡献。
生物发光成像的结果表明增加细胞内ROS水平在野生型小鼠相比，P47 PHOX-/ -小鼠NADPH氧化酶产生的ROS的主要来源是炎症刺激。这种方法提供了一种微创的方法为“实时”监控产生的ROS在体内的炎症。
Protocol
1。动物模型
- 鼠标：使用P47 PHOX-/ -小鼠与年龄和性别匹配的C57BL6/DBA小鼠。获得的实验，从实验动物护理和使用委员会的批准。
- 麻醉：使用连续的异氟醚麻醉诱导系统。汽化器的系统（VetEquip）填充用异氟醚（2-3％）。确认，老鼠是完全麻醉，观察呼吸，运动及角膜反射，在对外部刺激的反应。
- 外科手术：磨砂手术区（台式），用70％的乙醇。戴无菌手套和干净的手术衣和面具。准备小鼠经削波的头发和应用聚乙烯吡咯酮碘，用70％乙醇，将切口的地方交替。无菌的表面上，并使用无菌器械进行手术。监视器小鼠手术后，直到清醒和自由移动。
- 气管酵母管理
- 管理麻醉如在1.2中描述。
- 聚维酮碘和70％乙醇消毒手术区（颈部），暴露气管的手术剥离。
- 皮尔斯气管用27号针头注射酵母多糖（圣路易斯，MO）的剂量为1微克/克，采用0.5微克/微升的溶液（总体积为50微升的25克鼠标）溶解于无菌PBS中。
- 在无菌条件下，用5-0无菌丝线缝合关闭小鼠颈部伤口。
- 4小时和24小时后的图像。
- 盲肠结扎穿刺
- 管理麻醉，如在1.2中描述。
- 剪辑的头发在手术区（腹部），并与聚乙烯吡咯酮碘和70％乙醇消毒。
- 执行中线剖腹探查术，并确定盲肠。
- 用4-0丝线缝合穿刺盲肠末端的21号针，结扎一次暴露盲肠结扎远端的50％。
- 用4-0无菌丝线缝合关闭切口。
- 图片4小时后，24小时。
- 口腔四氯化碳（CCL 4）管理
- 管理麻醉，如在1.2中描述。
- 管理CCl 4中 （2微克/克，圣路易斯，MO）溶解在玉米油中，通过口腔管饲法。 IBC / EHS政策，四氯化碳管理的程序应在指定的区域内进行。
- 4小时和24小时后的图像。
2。获取生物发光图像
- 初始化IVIS 200（精诺真公司，加利福尼亚州Alameda）成像系统，设置发光模式，电荷耦合器件（CCD）的温度来锁定和等待。
- 选择曝光时间，分箱（中）和F / STOP（8）设置。
- 将小鼠仰卧位成像室在加热阶段，以维持正常的体温。管理麻醉在经鼻锥1.2，而老鼠是在IVIS成像室。
- 管理L-012 （20微克/克）溶解于无菌PBS（10微克/微升）静脉内通过在每个时间点选择为成像眶注射。
- L-012注射开始后2分钟拍摄图像。我们通常使用40秒曝光。
3。数据分析使用的感兴趣区域
- 利用活体成像软件4.2版（精诺真公司，加利福尼亚州Alameda）进行数据分析。
- 打开图像，选择测量的地区利益的工具。
- 选择地区利益的形状和大小的胸部和/或腹部的鼠标在一个摄影图像重叠后的伪彩色数字图像（即光子探测）。
- 量化信号强度（光子通量）从本地区的利益。
4。统计
- 使用统计分析软件包进行双向方差分析与Bonferroni测试后在各个时间点。
酵母多糖是一种促炎症酵母细胞壁产品和强有力的激活NADPH氧化酶3。我们以前发现，气管酵母多糖诱导肺部炎症和更强大的嗜中性粒细胞的促炎性细胞因子产生的P47 PHOX / -比野生型小鼠1。在这里，我们的目标是比较ROS生成的野生型P47 PHOX-/ -小鼠的肺部后，酵母多糖的挑战。 4小时后气管内的酵母管理，我们观察到了显着的增加光子发射的胸部在野生型小鼠相比，基线以及增加光子发射在野生型相比，P47 PHOX-/ -小鼠在4小时和24小时。相比之下，生物发光信号的p47 PHOX-/ -小鼠在4小时后，酵母多糖处理（ 图1 AB）保持在基准水平。因此会出现，NADPH氧化酶为bË产生的ROS在肺部酵母管理的主要来源。
接下来，我们评估ROS生产的CLP诱导的脓毒症模型。败血症是一种危及生命的症状与终末器官损伤，包括急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）4，5。 ROS介导的损伤一直被认为是一个重要的驱动因素败血症引起的多器官功能障碍。我们发现，ROS显着增加了胸部（4小时），并在腹部（24小时）后，中电在野生型小鼠相比，基线。然而，活性氧（ROS）的p47 PHOX-/ -小鼠的水平基线水平相似，在两个时间点（ 图2交流 ）。这些结果表明，对CLP-诱导的败血症小鼠模型中的ROS的产生NADPH氧化酶依赖性。
最后，我们利用生物发光成像检测ROS的产生，在四氯化碳诱导的肝损伤模式升。 CCl 4中引起肝细胞坏死，并已被用于建模急性肝损伤和肝纤维化6。在先前描述的模型的炎症和损伤相反，我们发现，在腹部的ROS产生温和（约35％）增加基线相比的p47 PHOX-/ -小鼠在CCl 4中给药后4小时。然而，比在野生型小鼠中的p47 PHOX-/ -小鼠（ 图A，B）的CCl 4诱导的ROS的产生显着的幅度更大。这些数据表明，P47 PHOX含NADPH氧化酶依赖和独立的ROS生成，发生在4诱导的急性四氯化碳肝损伤。
图1。ROS生产在肺部后酵母的治疗。 A）代表bioluminescenCE成像ROS的产生。需要注意的是，除了胸部，荧光检测在野生型和P47 PHOX-/ -小鼠腹部发光是不变的酵母多糖治 疗腹部。 B）光子计数从胸部的野生型P47 PHOX / -小鼠气管内一次性注射酵母多糖（IT）。生物发光成像在基线，4小时，24小时。胸部以上从感兴趣的区域中的光发射被确定使用所指示的伪彩色规模。结果以平均值±SE，n = 6-9每个组，* P <0.05。 点击查看大图 。
图2。ROS检测CLP。 A）ROS的产生，B代表生物发光成像）光子计数的胸部，C）光子计数野生型和P47 PHOX-/ -小鼠的腹部在基线，4小时，24小时后电。结果以平均值±SE N = 4％至5组，* P <0.05。 点击查看大图 。
图3。ROS生产在CCL腹部后4诱导的肝损伤。 A）代表的生物发光成像ROS的产生与B）光子计数野生型和P47 PHOX-/ -小鼠的腹部在基线，4小时和24小时后口服CCl4处理。结果以平均值±SE，n = 4％至5组，P <0.05。 点击查看大图
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Discussion
“实时”测量的活性氧（ROS）可以通过使用荧光和化学发光探针在生活的动物。虽然荧光探针患有具有弱的信号-噪声比12，成像技术描述的是更敏感的检测发光基于鲁米诺-底物L-012的化学反应的活性氧。像所有的生物发光的成像技术，这种方法是有限的器官和组织的依赖于波长的光的吸收和散射。这些实验都集中在建立适当的测量ROS在野生型P47 PHOX-/ -小鼠的实验条件。这些转基因小鼠的使用，使我们能区分所产生的活性氧的p47的PHOX含NADPH氧化酶的活性氧生成的其他途径。
虽然功能NADPH氧化酶P47 PHOX的活性氧的主要来源，以及其他的NADPH氧化酶的异构体存在，和额外的ROS产生系统，包括黄嘌呤氧化酶和线粒体呼吸，可以产生活性氧。 NADPH氧化酶和活性氧产生的途径有重要的影响和互动抗菌宿主防御和下游信号通路的调节炎症和损伤7-10。利用生物发光成像，我们能够测量的动力学体内 ROS的产生，并划定NADPH氧化酶的活性氧水平不同炎症模型的贡献。
这种方法的一个限制涉及到生物发光的空间分辨率。虽然我们可以测量发光在特定的解剖车厢（ 例如 ，胸部，腹部），它是很难定位的解剖部位的发光器官水平。在我们的实验模型中，我们选择了生物发光测量的3个时间点：基线，4小时和24小时。我们不知道，如果生物发光成像在ROS的产生可以识别的微小差异，在较短的时间间隔的分析，还是在体内活性氧的产生和生物发光之间的关系是线性的。这些问题需要进一步研究。在这些研究中使用的模型中，我们认为，吞噬细胞，主要负责招募中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬细胞NADPH氧化酶系统的活性氧的产生通过。未来的研究中，被耗尽，或者骨嵌合体生成特定的细胞类型可以提供更多的知识，从不同的细胞群相对水平的ROS的产生。使用L-012的研究是另一个潜在的限制，其他的自由基（除了ROS）的反应可能与此荧光探针，减少在某些情况下，ROS检测的特异性。
继酵母多糖注射，缺乏中ROS产生的p47 PHOX-/ -小鼠表明，NADPH氧化酶是在这个模型肺部炎症的ROS的主要来源。 CLP是败血症11和生物发光成像的最常见的动物模型之一显露在肺部和腹部，NADPH氧化酶依赖增加ROS信号。对比度的酵母多糖和CLP模型，活性氧（ROS），增加了两个野生型和P47 PHOX-/ -小鼠，与基线相比，在腹部，但是在野生型小鼠在更大程度上，表明CCl 4中诱导ROS产生的p47 PHOX -含有NADPH氧化酶和其他机制。
总之，我们的数据表明，鲁米诺为基础的生物发光成像法检测ROS 在体内的活性氧生产的监管和后果的研究是很有价值的工具。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由NIH RO1 AI079253和退伍军人事务部。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
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