不同动物模型中NADPH氧化酶活性的生物发光成像

摘要

NADPH 氧化酶是吞噬细胞中活性氧（ROS）的主要来源。由于 ROS 具有短暂存在的特性，因此在活体动物中测量和监测 ROS 水平十分困难。本文描述了一种在活体小鼠中连续定量检测 ROS 的微创方法。

摘要

NADPH 氧化酶是一种介导抗细菌和抗真菌宿主防御的关键酶。除了在抗微生物宿主防御中的作用外，NADPH 氧化酶还具有重要的信号传导功能，可调节炎症反应¹。因此，开发一种能够“实时”测定 NADPH 氧化酶来源的活性氧（ROS）生成动力学的方法，有望成为研究与宿主防御、炎症及损伤相关机制的宝贵研究工具。

慢性肉芽肿病（CGD）是一种由NADPH氧化酶缺陷引起的遗传性疾病，其特征为严重感染和过度炎症反应。吞噬细胞NADPH氧化酶的活化需要其胞质亚基（p47^phox、p67^phox和p40^phox）以及Rac蛋白转位至膜结合的黄素细胞色素（由gp91^phox和p22^phox组成的异源二聚体）。这些NADPH氧化酶组分中任何一个发生功能缺失性突变，均可导致CGD。与CGD患者类似，gp91^phox缺陷小鼠和p47^phox缺陷小鼠也表现出吞噬细胞NADPH氧化酶活性缺陷以及宿主防御功能受损^{2, 13}。除了含有上述NADPH氧化酶组分的吞噬细胞外，多种其他细胞类型也表达不同亚型的NADPH氧化酶。

本文介绍了一种在活体小鼠中定量活性氧（ROS）生成，并明确NADPH氧化酶在炎症与损伤模型中对ROS产生的贡献的方法。该方法基于ROS与L-012（一种鲁米诺类似物）发生反应，产生可被电荷耦合器件（CCD）记录的发光信号。在对L-012探针的最初描述中，L-012依赖的化学发光可被超氧化物歧化酶完全抑制，表明该反应中检测到的主要ROS为超氧阴离子¹⁴。后续研究表明，L-012还可检测其他自由基，包括活性氮物种^{15, 16}。Kielland 等¹⁶发现，局部应用强效NADPH氧化酶激活剂佛波酯（phorbol）肉豆蔻酸酯乙酸盐后，可在小鼠中通过发光探针L-012检测到NADPH氧化酶依赖的ROS生成。在该模型中，他们证实p47^phox缺陷小鼠的L-012依赖性发光信号完全消失。

我们在以下三种模型中比较了野生型小鼠与NADPH氧化酶缺陷型p47^phox-/-小鼠的活性氧（ROS）生成情况²：1）气管内给予酵母多糖（zymosan），这是一种来源于真菌细胞壁的促炎性物质，可激活NADPH氧化酶；2）盲肠结扎穿刺（CLP），一种模拟腹腔内脓毒症并继发急性肺部炎症与损伤的模型；3）经口给予四氯化碳（CCl₄），一种依赖ROS的肝损伤模型。选择这些模型旨在分别评估在非感染性炎症、多微生物脓毒症以及毒素诱导的器官损伤背景下，NADPH氧化酶依赖性的ROS生成情况。通过比较野生型小鼠与p47^phox-/-小鼠的生物发光信号，我们能够明确由含p47^phox亚基的NADPH氧化酶所产生的ROS在这些模型中对生物发光信号的特异性贡献。

生物发光成像结果显示，与p47缺陷小鼠相比，野生型小鼠体内的活性氧水平升高^phox-/- 小鼠实验表明，NADPH 氧化酶是炎症刺激下活性氧（ROS）生成的主要来源。该方法为炎症过程中活性氧生成的“实时”监测提供了一种微创的途径。 体内

方案

1. 动物模型

1. 小鼠：使用 p47^phox-/- 小鼠及年龄和性别匹配的C57BL6/DBA小鼠。实验需获得机构动物护理和使用委员会的批准。
2. 麻醉：使用持续异氟烷给药系统诱导麻醉。将异氟烷（2-3%）加入麻醉蒸发系统（VetEquip）。通过观察小鼠的呼吸、运动及对体外刺激的角膜反射，确认其是否完全麻醉。
3. 外科手术操作：用70%乙醇擦拭手术区域（工作台面）。佩戴无菌手套、清洁的手术服和口罩。通过剪除小鼠手术部位的毛发，并交替使用聚维酮碘和70%乙醇对切口区域进行消毒，以完成术前准备。在无菌台面上进行手术，并使用无菌器械。术后密切监测小鼠，直至其清醒并能自由活动。
4. 气管内给予酵母聚糖
   1. 按照1.2节所述给予麻醉。
   2. 用聚维酮碘和70%乙醇对手术区域（颈部）进行消毒，并通过外科解剖暴露气管。
   3. 用27号针头穿刺气管，并以指定剂量注射酵母聚糖（zymosan，St. Louis, MO） 1 μg/g 使用一个 0.5 μg/μl 溶液（总体积 50 μl （以25 g小鼠为例）溶于无菌PBS中。
   4. 在无菌条件下，使用5-0无菌丝线缝合小鼠颈部伤口。
   5. 4 小时和 24 小时后的图像。
5. 盲肠结扎穿刺
   1. 按照1.2节所述实施麻醉。
   <....

讨论

通过使用荧光和化学发光探针，可实现对活体动物中活性氧（ROS）的“实时”检测。尽管荧光探针存在信噪比较低的问题¹²，但本文所述成像技术在检测ROS与基于鲁米诺的底物L-012发生化学反应后产生的光发射方面更为灵敏。与所有生物发光成像技术一样，该方法受限于器官和组织对光的波长依赖性吸收和散射。本研究旨在建立在野生型和p47^phox-/-小鼠中检测ROS的合适实验条件。利用这些基因修饰小鼠，可使我们区分由含p47^phox的NADPH氧化酶产生的ROS与其他途径产生的ROS。

尽管含有p47的功能性NADPH氧化酶^phox 是活性氧（ROS）的主要来源，但还存在其他NADPH氧化酶亚型，以及包括黄嘌呤氧化酶和线粒体呼吸在内的额外ROS生成系统也可产生ROS。NADPH氧化酶及其他ROS生成通路在抗菌宿主防御以及调控炎症与损伤的下游信号通路中具有重要且相互关联的作用 ^7-10利用生物发光成像，我们能够测量活性氧（ROS）生成的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
酵母聚糖	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
四氯化碳	Sigma, St. Louis, MO	289116