Summary
NADPH oxidase प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों phagocytes (ROS) के प्रमुख स्रोत है. ROS के अल्पकालिक प्रकृति की वजह से, यह मुश्किल है करने के लिए उपाय करने के लिए और रहने वाले जानवरों में ROS के स्तर की निगरानी. रहने वाले चूहों में ROS के धारावाहिक मात्रा का ठहराव के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव विधि का वर्णन है.
Protocol
1. पशु मॉडल
- चूहे: p47 phox / प्रयोग चूहों और उम्र और सेक्स मिलान C57BL6/DBA चूहों. प्रयोगों के लिए संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन प्राप्त करने के.
- संज्ञाहरण: एक निरंतर isoflurane प्रशासन प्रणाली का प्रयोग संज्ञाहरण प्रेरित. vaporizer प्रणाली (VetEquip) isoflurane (2-3%) के साथ भरा है. पुष्टि करें कि चूहों पूरी तरह से बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में श्वसन, आंदोलन, और corneal पलटा देख द्वारा anesthetized हैं.
- सर्जिकल प्रक्रियाओं: 70% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र (benchtop) रगडें. बाँझ दस्ताने और एक साफ सर्जिकल गाउन और मुखौटा पहन लो. बाल कतरन और Betadine आवेदन 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र है जहां चीरा किया जाएगा बारी से चूहों को तैयार करो. सर्जरी एक बाँझ सतह पर प्रदर्शन और बाँझ उपकरणों का उपयोग करते हैं. मॉनिटर चूहों के बाद operatively तक जाग और स्वतंत्र रूप से बढ़ रहा है.
- Intratracheal zymosan प्रशासन
- संज्ञाहरण प्रशासनके रूप में 1.2 में वर्णित है.
- Betadine और 70% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र (गर्दन) कीटाणुरहित और शल्य चिकित्सा विच्छेदन द्वारा ट्रेकिआ बेनकाब.
- एक 27 गेज सुई के साथ पियर्स ट्रेकिआ और 1 ग्राम / जी की एक खुराक एक 0.5 ग्राम / μl समाधान (एक 25 ग्राम माउस के लिए कुल मात्रा 50 μl) बाँझ पीबीएस में भंग का उपयोग zymosan (सेंट लुइस, MO) इंजेक्षन.
- बंद करे चूहों गर्दन सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत 5-0 बाँझ रेशम sutures के साथ घाव.
- 4 घंटा और 24 घंटे के बाद छवि.
- Cecal ligation और पंचर
- संज्ञाहरण प्रशासन के रूप में 1.2 में वर्णित है.
- शल्य चिकित्सा के क्षेत्र (पेट) में हेयर क्लिप और Betadine और 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित.
- एक midline laparotomy प्रदर्शन और cecum की पहचान.
- 4-0 रेशम सिवनी और एक 21 गेज सुई के एक पास के साथ ligation बाहर का पंचर cecum के साथ उजागर cecum के बाहर 50% कटी घमनी को बांधना.
- 4-0 बाँझ रेशम sutures के साथ चीरा बंद करें.
- और 4 घंटे के बाद छवि24 घंटे.
- मौखिक कार्बन टेट्राक्लोराइड प्रशासन (4 सीसीएल)
- संज्ञाहरण प्रशासन के रूप में 1.2 में वर्णित है.
- प्रशासन सीसीएल 4 (2 ग्राम / जी, सेंट लुइस, MO) मौखिक नलिका - पोषण द्वारा मकई तेल में भंग. CCl4 प्रशासन की प्रक्रिया / IBC EHS नीतियों के साथ अनुसार एक निर्धारित क्षेत्र में किया जाना चाहिए.
- 4 घंटा और 24 घंटे के बाद छवि.
2. एक bioluminescent छवि हासिल
- IVIS 200 (Xenogen निगम, Alameda, CA) इमेजिंग सिस्टम, luminescence मोड सेट इनिशियलाइज़, और आरोप युग्मित (सीसीडी) डिवाइस लॉक तापमान के लिए प्रतीक्षा करें.
- जोखिम समय, binning (मध्यम) और एफ / स्टॉप (8) सेटिंग्स का चयन करें.
- सामान्य शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक गर्म मंच पर इमेजिंग कक्ष में लापरवाह स्थिति में जगह चूहों. संज्ञाहरण प्रशासन के रूप में नाक शंकु के माध्यम से 1.2 में वर्णित जबकि चूहों IVIS इमेजिंग कक्ष में हैं.
- L-012 प्रशासन (20 ग्राम / छ) बाँझ पीबीएस (10 ग्राम / μl) हर बार इमेजिंग के लिए चयनित बिंदु पर रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन के माध्यम से नसों के में भंग कर दिया.
- एल 012 इंजेक्शन के बाद 2 मिनट पर शुरू छवियों पर कब्जा. हम आम तौर पर एक 40 सेकंड जोखिम का उपयोग करें.
3. ब्याज के क्षेत्र का उपयोग कर डेटा विश्लेषण
- जीवित प्रतिमा सॉफ्टवेयर v.4.2 (Xenogen निगम, Alameda, CA) का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण.
- एक छवि खोलें और ब्याज उपकरण के क्षेत्र की माप का चयन करें.
- ब्याज और छाती या / और माउस की एक फ़ोटो छवि पर एक छद्म रंग डिजिटल छवि (फोटान का पता लगाने का प्रतिनिधित्व) overlaying के बाद पेट पर आकार के क्षेत्र का चयन करें.
- यों ब्याज के क्षेत्र से संकेत तीव्रता (फोटॉन प्रवाह).
4. आँकड़े
- सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करने के लिए अलग - अलग समय बिंदुओं पर बाद के परीक्षण Bonferroni के साथ दो तरह से एनोवा प्रदर्शन.
Zymosan एक समर्थक भड़काऊ खमीर कोशिका दीवार उत्पाद और NADPH oxidase 3 के एक शक्तिशाली उत्प्रेरक है. हम पहले पता चला कि intratracheal zymosan एक और अधिक मजबूत neutrophilic फेफड़ों की सूजन और समर्थक भड़काऊ p47 phox / cytokine उत्पादन में लाती - चूहों 1 wildtype की तुलना में. चूहों zymosan चुनौती के बाद यहाँ, हमारे लक्ष्य के लिए wildtype और phox / p47 के फेफड़ों में ROS पीढ़ी की तुलना था. 4 घंटे और 24 घंटे में चूहों intratracheal zymosan प्रशासन के बाद 4 घंटा, हम छाती पर एक फोटान उत्सर्जन में उल्लेखनीय वृद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से wildtype में फोटान उत्सर्जन में वृद्धि p47 phox / तुलना में आधारभूत की तुलना में चूहों में wildtype मनाया. इसके विपरीत, p47 phox / bioluminescence संकेत चूहों zymosan उपचार (Fig.1 एबी) के बाद 4 घंटे में आधारभूत स्तर पर बने रहे. इस प्रकार, NADPH oxidase ख के लिए प्रकट होता हैई zymosan प्रशासन के बाद फेफड़ों में ROS पीढ़ी का प्रमुख स्रोत है.
अगला, हम CLP प्रेरित पूति मॉडल में ROS उत्पादन का आकलन किया. पूति एक जीवन के लिए खतरा अंत अंग चोट के साथ जुड़े सिंड्रोम सहित गंभीर फेफड़ों की चोट (अली) और तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (Ards) 4, 5, है. ROS-मध्यस्थता चोट एक महत्वपूर्ण पूति प्रेरित बहु अंग शिथिलता ड्राइविंग कारक माना गया है. हमने पाया है कि ROS काफी छाती (4 घंटा) से अधिक और चूहों में wildtype आधारभूत की तुलना CLP के बाद (24 घंटे) पेट पर बढ़ रहे थे. हालांकि, p47 phox / ROS स्तर चूहों दोनों समय अंक (Fig.2 एसी) में आधारभूत स्तर पर समान थे. ये परिणाम बताते हैं कि CLP प्रेरित पूति माउस मॉडल में ROS पीढ़ी NADPH oxidase - निर्भर है.
अंत में, हम bioluminescent इमेजिंग का इस्तेमाल एक सीसीएल जिगर 4 प्रेरित चोट मोड में ROS उत्पादन का पता लगानेएल. 4 सीसीएल hepatocellular परिगलन का कारण बनता है, और दोनों तीव्र जिगर चोट और यकृत तंतुमयता 6 मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है. सूजन और चोट के पहले से वर्णित मॉडल के विपरीत, हमने पाया कि पेट में ROS उत्पादन विनय (35%) p47 phox / आधारभूत से अधिक वृद्धि हुई है - 4 घंटे में चूहों के बाद सीसीएल 4 प्रशासन. चूहों के (Fig.3 एबी) - हालांकि, 4 प्रेरित ROS पीढ़ी सीसीएल की भयावहता काफी p47 phox / से चूहों में wildtype अधिक से अधिक था. ये आंकड़े बताते हैं कि दोनों p47 phox युक्त NADPH oxidase निर्भर और स्वतंत्र ROS पीढ़ी तीव्र 4 प्रेरित जिगर चोट सीसीएल में होते हैं.
चित्रा 1. फेफड़ों में zymosan उपचार के बाद ROS उत्पादन. ए) प्रतिनिधि bioluminescenROS उत्पादन के CE इमेजिंग. ध्यान दें कि छाती के अलावा, luminescence दोनों wildtype और p47 phox / में पेट पर detectable है - चूहों और पेट luminescence zymosan उपचार द्वारा अपरिवर्तित है. बी) wildtype और p47 phox / सीने से फोटान मायने रखता है - zymosan की एक intratracheal एकल (आईटी) इंजेक्शन के बाद चूहों. Bioluminescence इमेजिंग आधारभूत, 4 घंटे और 24 घंटे में किया गया था. सीने पर ब्याज के क्षेत्र से प्रकाश उत्सर्जन संकेत छद्म रंग पैमाने का उपयोग पहचान की थी. परिणाम मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं ± एसई, n = 6-9, समूह प्रति * = <0.05 पी बड़ा आंकड़ा के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. ROS पता लगाने CLP बाद. ROS उत्पादन, बी) प्रतिनिधि bioluminescence इमेजिंगसीने से) फोटॉन मायने रखता है, और सी) फोटॉन wildtype और p47 phox / के पेट से मायने रखता है - आधारभूत में चूहों, 4 घंटा, और CLP के बाद 24 घंटा. परिणाम मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं ± एसई, n = समूह प्रति 4-5, * = <0.05 पी बड़ा आंकड़ा के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3 4 प्रेरित जिगर चोट सीसीएल के बाद पेट में ROS उत्पादन. आधारभूत में चूहों, 4 घंटा, और मौखिक सीसीएल 4 उपचार के बाद 24 घंटे - ए) ROS उत्पादन और बी) wildtype और p47 phox / के पेट से मायने रखता है फोटॉन के प्रतिनिधि bioluminescence इमेजिंग. N = 4-5 समूह के प्रति, * = पी 0.05 <; परिणाम ± एसई मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं के लिए यहाँ क्लिक करें बड़ा आंकड़ा
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Discussion
"वास्तविक समय" प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के रहने वाले जानवरों में माप फ्लोरोसेंट और chemiluminescent जांच का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. जबकि फ्लोरोसेंट जांच कमजोर संकेत से शोर अनुपात 12 होने से ग्रस्त हैं, इमेजिंग वर्णित तकनीक अधिक luminol आधारित सब्सट्रेट एल 012 के साथ एक ROS की रासायनिक प्रतिक्रिया के बाद प्रकाश उत्सर्जन का पता लगाने के लिए संवेदनशील है. सभी bioluminescent इमेजिंग तकनीक की तरह, इस पद्धति तरंगदैर्ध्य निर्भर प्रकाश और अंगों और ऊतकों द्वारा अवशोषण स्कैटर द्वारा सीमित है. चूहों इन प्रयोगों wildtype और phox / p47 में ROS की माप के लिए उचित प्रयोगात्मक शर्तों की स्थापना पर ध्यान केंद्रित किया गया है. इन आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करने के लिए सक्षम बनाता है हमें अंतर ROS p47 phox युक्त ROS से NADPH oxidase अन्य रास्ते से उत्पन्न द्वारा उत्पन्न.
हालांकि कार्यात्मक p47 phox NADPH oxidase युक्त हैROS का एक प्रमुख स्रोत है, अन्य NADPH oxidase isoforms मौजूद हैं, और xanthine oxidase और mitochondrial श्वसन सहित अतिरिक्त ROS पैदा करने प्रणाली, ROS का उत्पादन कर सकते हैं. NADPH oxidase और अन्य ROS पैदा रास्ते रोगाणुरोधी मेजबान बचाव और नीचे की ओर संकेत दे रास्ते कि सूजन और चोट 7-10 मिलाना पर महत्वपूर्ण और इंटरैक्टिव प्रभाव हो सकता है. Bioluminescence इमेजिंग का प्रयोग, हम vivo में ROS उत्पादन के कैनेटीक्स को मापने और NADPH oxidase के विभिन्न भड़काऊ मॉडल में ROS स्तर के लिए योगदान चित्रित करना करने में सक्षम थे.
इस पद्धति का एक सीमा bioluminescence के स्थानिक संकल्प से संबंधित है. हालांकि हम विशिष्ट शारीरिक डिब्बों (जैसे, छाती, पेट,) के भीतर luminescence उपाय कर सकते हैं, यह मुश्किल है अंग स्तर पर luminescence के शारीरिक साइट स्थानीय बनाना. आधारभूत, 4 घंटा, 24 घंटा: हमारे प्रयोगात्मक मॉडल में से प्रत्येक में हम 3 bioluminescent मापन के लिए समय अंक को चुना. हम अगर bioluminescent इमेजिंग विश्लेषण के छोटे अंतराल पर या क्या vivo ROS पीढ़ी और bioluminescence में के बीच रैखिक संबंध है ROS पीढ़ी में छोटे मतभेदों की पहचान कर सकते हैं पता नहीं है. इन मुद्दों पर आगे के अध्ययन की आवश्यकता है. इन अध्ययनों के लिए प्रयोग किया जाता मॉडल में, हमें शक है कि phagocytic कोशिकाओं भर्ती neutrophils और मैक्रोफेज, मुख्य रूप से कर रहे हैं भक्षककोशिकीय NADPH oxidase प्रणाली के माध्यम से ROS उत्पादन के लिए जिम्मेदार है. भविष्य के अध्ययन में जो विशेष सेल प्रकार समाप्त कर रहे हैं या हड्डी काइमेरा उत्पन्न कर रहे हैं ROS पीढ़ी के अलग सेल आबादी से रिश्तेदार के स्तर के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकता है. L-012 का उपयोग करते हुए अध्ययन के एक अन्य संभावित सीमा यह है कि अन्य कण (आरओएस) के अलावा इस luminescent जांच के साथ प्रतिक्रिया, कुछ परिस्थितियों में ROS का पता लगाने के लिए विशिष्टता कम हो सकता है.
Zymosan इंजेक्शन, p47 phox / में ROS उत्पादन की कमी के बाद चूहों इंगित करता है कि NADPH oxidaseफेफड़ों की सूजन के इस मॉडल में ROS का प्रमुख स्रोत है. CLP सबसे आम 11 पूति और bioluminescence इमेजिंग के पशु मॉडल में से एक है पता चला दोनों फेफड़ों और पेट कि NADPH oxidase - निर्भर थे ROS संकेतों में वृद्धि हुई है. Zymosan और CLP मॉडल के विपरीत, ROS wildtype और phox / p47 दोनों के पेट में बढ़ रहे थे - चूहों आधारभूत की तुलना में, लेकिन चूहों में wildtype एक बड़ा डिग्री है, यह दर्शाता है कि सीसीएल 4 p47 phox ROS उत्पादन को प्रेरित करने के लिए - NADPH oxidase और अन्य तंत्र से युक्त.
सारांश में, हमारे आंकड़े बताते हैं कि ROS का पता लगाने के लिए एक luminol आधारित bioluminescence इमेजिंग विधि और vivo में ROS उत्पादन के विनियमन के परिणाम पर अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NIH RO1 AI079253 और दिग्गजों मामलों के विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
