Summary
NADPH oksidaz fagositler reaktif oksijen türlerinin ana kaynağı (ROS) 'dir. Çünkü ROS geçici doğası nedeniyle, canlı hayvanlarda ROS seviyelerini ölçmek ve izlemek zordur. Yaşayan farelerde ROS seri ölçümü için bir minimal invaziv bir yöntem tarif edilmiştir.
Abstract
NADPH oksidaz antibakteriyel ve antifungal konak savunma aracılık kritik bir enzimdir. Antimikrobiyal konak savunma rolüne ek olarak, NADPH oksidaz inflamatuvar yanıt 1 modüle kritik sinyalizasyon fonksiyonları vardır. Böylece, NADPH oksidaz kökenli ROS nesil "gerçek zamanlı" kinetik ölçmek için bir yöntem geliştirilmesi savunma, inflamasyon ve yaralanma barındırması ilgili mekanizmalar anlamak için değerli bir araştırma aracı olması bekleniyor.
Kronik granülomatöz hastalık (CGD) ciddi enfeksiyonlar ve aşırı inflamasyon ile karakterize NADPH oksidaz kalıtsal bir hastalıktır. Fagosit NADPH oksidaz aktivasyonu, kendi sitosolik alt birimden (S47 phox, phox P67, P40 ve phox) ve bir membran-sınırlayıcı flavocytochrome (bir gp91 phox ve p22 heterodimeri phox oluşur) Rac translokasyon gerektirir. KayıpCGD bu NADPH oksidaz bileşenlerin sonucu herhangi birinde işlev mutasyonlar. ÇGD olan hastalarda benzer, gp91 phox-eksik farelerde ve S47 phox-eksik farelerde arızalı fagosit NADPH oksidaz aktivitesi ve bozulmuş konak savunması 13, 14 var. Yukarıda tarif edilen NADPH oksidaz bileşenler içeren fagositler, ek olarak, diğer hücre tipleri arasında, çeşitli NADPH oksidaz izoformları değişik ifade eder.
Burada yaşayan farelerde ROS üretimini ölçmek ve inflamasyon ve yaralanma modellerinde ROS nesil NADPH oksidaz katkısını belirginleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir şarj bağlı cihaz (CCD) tarafından kaydedilir ışıldama yayma L-012 (luminol bir analog) ile reaksiyona ROS dayanmaktadır. L-012 prob orijinal tanımı olarak, L-012-bağlı kemiluminesans tamamen bu reaksiyon tespit ana ROS süper olduğunu gösteren, süperoksit dismutaz kaldırılmış;oksit anyon 15. Daha sonraki çalışmalar, L-012 reaktif nitrojen türleri 16, 17 gibi diğer serbest radikaller, tespit edebildiğini göstermiştir. Kielland ve ark. 17 forbol miristat asetat, NADPH oksidaz güçlü bir aktivatörü, bu topikal uygulama ışıldayan sonda L-012 fare kullanılarak tespit edilebilir oksidaz bağımlı ROS NADPH üretim yol göstermiştir. Bu modelde, L-012-bağımlı lüminesans S47 phox-eksik farelerde kaldırılmış olduğunu gösterdi.
Biz yabani-tip farelerden ve NADPH oksidaz eksikliği S47 phox-/ ROS üretimi karşılaştınl - aşağıdaki üç model fareler 2: zymosan, NADPH oksidaz aktive edebilirsiniz duvara türetilmiş ürün pro-inflamatuar fungal hücre 1) zerk; 2) çekal ligasyon ve delme (CLP), sekonder akut akciğer inflamasyonu ve hasarı ile intra-abdominal sepsis modeli ve 3) sözlü karbon tetraklorür(CCl4), ROS-bağımlı karaciğer hasarının bir model. Bu modeller özellikle sırasıyla, non-enfeksiyöz inflamasyon, polimikrobiyal sepsis ve toksin kaynaklı organ hasarının bağlamında NADPH oksidaz bağımlı ROS üretimi değerlendirmek için seçilmiştir. S47 için yabani-tip farelerde biyolüminesans karşılaştırma phox-/ - farelerde bize bu modellerde bioluminescent sinyal S47 phox içeren NADPH oksidaz tarafından üretilen ROS özgül katkıda tasvir sağlar.
S47 ile karşılaştırıldığında yabani-tip farelerden artmış ROS seviyeleri gösterdi Biyoparlaklık görüntüleme sonuçları phox-/ - farelerde NADPH oksidaz enflamatuvar uyaranlara yanıt olarak ROS üretiminin ana kaynağı olduğunu belirtti. Bu yöntem, in vivo enflamasyon sırasında ROS nesil "gerçek zamanlı" izlenmesi için minimal invaziv bir yaklaşım sağlar.
Protocol
1. Hayvan Modelleri
- Fare: S47 phox-Kullanım / - farelerde, yaş ve cinsiyete göre eşleştirilmiş C57BL6/DBA fareler. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi deneyler için onay alın.
- Anestezi: Anestezi ikna etmek için sürekli bir izofluran yönetim sistemi kullanın. Buharlaştırıcı sistemi (VetEquip) (% 2-3) izofluran ile doldurulur. Fareler dış uyaranlara yanıt olarak solunum, hareket ve korneal refleks gözlemleyerek tamamen uyuşturulduktan olduğunu onaylayın.
- Cerrahi yöntemler:% 70 etanol ile cerrahi alan (benchtop) fırçalayın. Steril eldiven ve temiz bir cerrahi önlük ve maske takın. Saç kırpma ve kesik olan alanı için% 70 etanol ile dönüşümlü olarak betadin uygulayarak fareler hazırlayın. Steril bir yüzey üzerinde ameliyat gerçekleştirin ve steril aletler kullanın. Monitör fareler postoperatif kadar uyanık ve serbestçe hareket.
- Intratrakeal zymosan yönetimi
- Anesteziklereolarak 1.2 nitelendirdi.
- Betadin ve% 70 etanol ile cerrahi alan (boyun) Dezenfekte ve cerrahi diseksiyon ile trakea maruz.
- Pierce, 27-gauge iğne ile soluk borusu ve steril PBS içinde eritildi, 0.5 ug / ml 'den çözeltisi (25 g fare için toplam hacim 50 ul) ile 1 ug / gr' lik bir dozda zymosan (St. Louis, MO) enjekte edilir.
- Kapat fareler boyun aseptik koşullarda 5-0 steril ipek dikişlerle yara.
- 4 saat ve 24 saat sonra resmi.
- Çekal ligasyon ve delme
- 1.2 'de tanımlanan anesteziklere.
- Ameliyat bölgesinin (karın) saç Klip ve betadin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.
- Bir orta hat laparotomi gerçekleştirin ve çekum tanımlamak.
- 4-0 ipek sütür ve 21-gauge iğne tek geçişe sahip ligasyonu distal ponksiyon çekum ile maruz çekum distal 50% Arter.
- 4-0 steril ipek dikişlerle kesi kapatın.
- 4 saat sonra görüntü ve24 saat.
- Sözlü karbon tetraklorür (CCl4) idaresi
- 1.2 'de tanımlanan anesteziklere.
- Ağızdan sonda yoluyla mısır yağı içinde çözülmüş CCl4 (2 ug / g, St Louis, MO) uygulayın. CCl4 uygulama prosedür IBC / EHS ilkelerine uygun olarak belirlenmiş bir bölge içinde yapılmalıdır.
- 4 saat ve 24 saat sonra resmi.
2. Bir Bioluminescent Görüntü Kazanılması
- Lüminesans moduna ayarlı IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Görüntüleme Sistemi, Initialize ve şarj bağlı cihaz (CCD) kilitlemek için sıcaklık için bekleyin.
- Maruziyet süresi, binning (orta) ve F / Stop (8) ayarlarını seçin.
- Normal vücut ısısını korumak için ateşli bir sahne görüntüleme odasında yatar pozisyonda yer fareler. Fareler IVIS görüntüleme odasında ise burun konisi ile 1.2 'de tanımlanan anesteziklere.
- L-012 yönetme (20 mg / g) görüntüleme için seçilen her bir zaman noktasında retroorbital enjeksiyon yoluyla damardan steril PBS (10 mikrogram / ul) içinde eritildi.
- L-012 enjeksiyonundan sonra 2 dk başlayarak görüntüler yakalayın. Biz genellikle 40 sn pozlama kullanın.
3. Region of Interest kullanarak Veri Analizi
- Yaşayan Image yazılımı V.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) kullanılarak veriler analiz.
- Bir görüntüyü açın ve İlgi araçları Bölgesi ölçümü seçin.
- Göğüs ve / veya fare fotoğrafik görüntünün üzerinde pseudo-renkli dijital görüntü (foton algılama temsilen) overlaying sonra karın üzerine Faiz şekil ve boyut Bölge seçin.
- İlgi Bölgesi'nden gelen sinyal yoğunluğu (foton akısı) sayısal.
4. Istatistik
- Bireysel zaman noktalarında Bonferroni post-test ile iki yönlü ANOVA gerçekleştirmek için istatistiksel analiz yazılım paketi kullanın.
Zymosan bir pro-inflamatuar maya hücre duvarı ürünleri ve NADPH oksidaz 3 güçlü bir aktivatörü olan. Biz daha önce bu intratrakeal zymosan daha sağlam nötrofilik akciğer inflamasyonu ve S47 phox-/ pro-enflamatuar sitokin üretimini indükler gösterdi - farelerde 1 yabani-tip ile karşılaştırıldığında. Zymosan karşılaştırmadan sonra fareler - Burada amacımız yabani-tip ve S47 phox-/ akciğerleri ROS üretimi karşılaştırmaktır. 4 saat ve 24 saatte fareler - 4 saatte zymosan intratrakeal uygulamadan sonra, bu temel hem de S47 phox-/ göre yabani-tip olarak foton emisyon bir artış ile karşılaştırıldığında, yabani-tip farelerde göğüs boyunca foton emisyon önemli bir artış gözlenmiştir. Buna karşılık, S47 phox-/ in biyolüminesans sinyalleri - farelerde zymosan tedavisi (Şekil.1 AB) sonra 4 saatte bazal seviyelerde kalmıştır. Böylece, NADPH oksidaz b görünüyorE zymosan verilmesini takiben akciğerlerde ROS üretiminin ana kaynağı.
Sonra, CLP-indüklenen sepsis modelinde ROS üretimi değerlendirilmiştir. Sepsis akut akciğer hasarı (ALI) ve akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) 4, 5 gibi uç organ hasarı ile ilişkili hayatı tehdit eden bir sendromdur. ROS aracılı yaralanma sepsis kaynaklı çoklu organ disfonksiyonu sürüş önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir. Biz ROS belirgin göğüs (4 saat) üzerinde ve başlangıca göre yabani-tip farelerden CLP takiben karın (24 saat) fazla arttığı bulunmuştur. Ancak, S47 phox-/ ROS seviyeleri - fareler zaman noktalarında (Şekil.2 AC) hem de bazal düzeyleri benzer bulunmuştur. Bu sonuçlar, CLP-indüklenmiş fare sepsis modelinde, ROS kuşak oksidaz bağımlı NADPH olduğunu göstermektedir.
Son olarak, biz bir CCl 4-bağlı karaciğer hasarında modunda ROS üretimini tespit etmek bioluminescent görüntüleme kullanılırl. CCl 4 hepatosellüler nekroz neden olur ve akut karaciğer hasarı ve karaciğer fibrozisi 6 hem modellemek için kullanılır olmuştur. CCl 4 uygulamadan sonra 4 saatte fareler - iltihabı ve hasarı daha önce anlatılan modellerin aksine, biz karın ROS üretimi (yaklaşık% 35) S47 phox-/ başlangıca göre artış ılımlı olduğunu ortaya koymuştur. Fareler (Şekil 3 AB) - Ancak, 4-indüklenen ROS üretimi CCl büyüklüğünü S47 phox-/ daha yabani-tip farelerden anlamlı olarak daha fazla idi. Bu veriler hem S47 phox içeren NADPH oksidaz-bağımlı ve bağımsız ROS üretimi akut CCl 4-bağlı karaciğer hasarında meydana öneririz.
Zymosan tedaviden sonra akciğer Şekil 1. ROS üretimini. A) Temsilcisi bioluminescenROS üretimi ce görüntüleme. Fareler ve karın ışıldama zymosan muamele ile değişmez - göğüs ek olarak, lüminesans yabani-tip ve S47 phox-/ her ikisi de karın üzerine tespit edilebilir olduğuna dikkat edin. Yabani-tip ve S47 phox-/ ve göğüs B) foton sayım - zymosan bir (BT) intratrakeal tek enjeksiyondan sonra fareler. Biyoparlaklık görüntüleme taban, 4 saat ve 24 saat sonra yapıldı. Göğüs üzerinde ilgi bölgeden Işık emisyonu belirtilen sahte renk skalası kullanılarak tespit edilmiştir. Sonuçlar ortalama olarak sunulmaktadır ± SE, n = 6-9, grup başına * = p <0.05. büyük bir rakam için tıklayınız .
Şekil 2. ROS tespiti sonrasında CLP. ROS üretimi, B A) Temsilcisi biyolüminesans görüntüleme) Foton göğüs sayıları ve yabani-tip ve S47 phox-/ ve karın C) foton sayımı - başlangıçta fare, 4 saat ve CLP sonra 24 saat. Sonuçlar ortalama olarak sunulmaktadır ± SE, n = grup başına 4-5, * = p <0.05. büyük bir rakam için tıklayınız .
CCl sonrası karın 4-bağlı karaciğer hasarında Şekil 3. ROS üretimi. Oral CCl 4 tedaviden sonra başlangıçta fare, 4 saat ve 24 saat - ROS üretimi ve yabani-tip ve S47 phox-/ ve karından B) foton sayımı A) Temsilcisi biyolüminesans görüntüleme. . N = 4-5 grup başına, * = p <0.05; Sonuçlar ortalama ± SE olarak sunulmuştur için tıklayınız büyük bir rakam
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Canlı hayvanlar reaktif oksijen türlerinin "Gerçek zamanlı" ölçümü (ROS) floresan ve kemilüminesans problar kullanılarak elde edilebilir. Floresan problar zayıf sinyal-gürültü oranı 12 olan muzdarip iken, açıklanan görüntüleme tekniği luminol tabanlı substrat L-012 ile ROS bir kimyasal reaksiyon sonrasında ışık emisyon tespiti için daha duyarlıdır. Tüm bioluminescent görüntüleme teknikleri gibi, bu metodoloji organ ve dokular tarafından dalgaboyu bağımlı ışık emilimi ve yayılımı ile sınırlıdır. Fareler - Bu deneyler yabani-tip ve S47 phox-/ ROS ölçümü için uygun deneysel koşullar oluşturulması üzerinde duruldu. Bu genetiği değiştirilmiş farelerin kullanılması ROS diğer yollar tarafından oluşturulan ROS gelen S47 phox içeren NADPH oksidaz tarafından üretilen ayırt etmemizi sağlamaktadır.
S47 phox içeren fonksiyonel NADPH oksidaz olmasına rağmenROS önemli bir kaynağı, diğer NADPH oksidaz izoformlar mevcut ve ksantin oksidaz ve mitokondriyal solunum dahil olmak üzere ek ROS üreten sistemler, ROS üretebilir. NADPH oksidaz ve diğer ROS üreten yollar antimikrobiyal konak savunması ve iltihabı ve hasarı 7-10 modüle aşağı sinyal yolları üzerinde önemli ve etkileşimli etkileri olabilir. Biyolüminesans görüntüleme kullanarak, in vivo ROS üretiminin kinetiği ölçmek ve farklı inflamatuvar modelleri ROS seviyeleri NADPH oksidaz katkısı tasvir başardık.
Bu yöntemin bir sınırlaması biyolüminesensin uzaysal çözünürlüğü ile ilgilidir. Biz spesifik anatomik bölümlerinde (örneğin., Toraks, abdomen) içinde lüminesans ölçebilirsiniz rağmen, organ düzeyinde lüminesans anatomik lokalize etmek zordur. Taban, 4 saat ve 24 saat: Bizim deneysel modellerin her birinde biz bioluminescent ölçümleri için 3 kez puan seçti. Bioluminescent görüntüleme analizi daha kısa aralıklarla üzerine veya in vivo ROS üretimi ve biyolüminesans yılında arasındaki ilişkinin doğrusal olup olmadığını ROS üretimi küçük farklılıkları belirlemek eğer biz bilmiyoruz. Bu sorunlar, daha fazla çalışma gerektirir. Bu çalışmalar için kullanılan modeller, biz fagositik hücreler, işe nötrofil ve makrofajlar, öncelikle fagosit NADPH oksidaz sistemi aracılığıyla ROS üretimi için sorumlu olduğunu sanıyorum. Özel hücre tiplerinin tükenmiş veya kemik kimeralar oluşturulan edildiği Gelecekteki çalışmalarda farklı hücre popülasyonu gelen ROS üretiminin göreli seviyeleri hakkında ek bilgi sağlayabilir. L-012 kullanılarak çalışmalar diğer bir olası sınırlama diğer radikaller (ROS) yanında, bazı durumlarda ROS tespiti için özgüllüğü azaltarak, bu parlak sonda ile reaksiyona olmasıdır.
Zymosan enjeksiyon, S47 phox-/ ROS üretiminin eksikliği ardından - fareler NADPH oksidaz olduğunu gösterirakciğer iltihabı bu modelde ROS ana kaynağı. CLP oksidaz bağımlı NADPH vardı akciğer ve karın hem ROS sinyaller arttığı saptandı sepsis 11 ve biyolüminesans görüntüleme en yaygın hayvan modellerinde biridir. Zymosan ve CLP modellerinin tersine, ROS yabani-tip ve S47 phox-/ ikisinin karın arttı - fareler başlangıca göre, ancak yabani-tip farelerden daha büyük bir derecesi, CCl 4 S47 phox ROT üretimini uyardığını belirten etmek - NADPH oksidaz ve diğer mekanizmalar içeren.
Özetle, bizim veri ROS tespiti için luminol tabanlı biyolüminesans görüntüleme yöntemi in vivo ROS üretiminin düzenlenmesi ve sonuçlarına ilişkin araştırmaları için değerli bir araç olabileceğini göstermek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH RO1 AI079253 ve Gazi İşleri Bakanlığı tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
