نحن هنا وصف الاسلوب الذي يستخدم الآن بشكل روتيني لعزل متجهة ستابلي الريبوسوم المجمعات سلسلة الوليدة (RNCs). هذه التقنية يستفيد من اكتشاف ان 17 حمض أميني طويل "تسلسل اعتقال" SecM يمكن وقف استطالة ترجمة في بروكاريوتيك (<em> E. كولاي</em>) النظام، وعندما أدرجت في (أو تنصهر في النهاية-C) من بروتين أي عمليا.
وقد وفرت بحوث مستفيضة أدلة وافرة تشير إلى أن بروتين قابلة للطي في الخلية هو عملية مشتركة متعدية 1-5. ومع ذلك، فإن المسار الدقيق الذي يلي سلسلة ببتيد خلال التعاون متعدية للطي لتحقيق شكلها وظيفي لا يزال لغزا. من أجل فهم هذه العملية وتحديد التشكل الدقيق للوسيطة مشتركة متعدية للطي، وأنه من الضروري لتطوير التقنيات التي تسمح للعزلة RNCs تحمل السلاسل الوليدة من أحجام محددة سلفا للسماح للمزيد من تحليل الهيكلية.
SecM (راصد إفراز) هو 170 E. حامض اميني بروتين كولاي التي تنظم التعبير عن أتباز المصب (القيادة إفراز) سيكا في الاوبرون secM سيكا-6. Nakatogawa وايتو وجدت في الأصل أن 17 تسلسل الأحماض الأمينية طويلة (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) في منطقة C-محطة من البروتين SecM غير كاف وضروري لتسبب توقف استطالة SecM في Gly165، وبذلك تنتج ببتيديل-غليسيل-الحمض الريبي النووي النقال ملزمة ثابت إلى الريباسي ف موقع 7-9. الأهم من ذلك، فقد وجد أن هذا يمكن أن تنصهر فيها 17 تسلسل الأحماض الأمينية طويلة للوصول إلى محطة-C من بروتين أي تقريبا كامل طول و / أو مبتورة وبالتالي السماح لإنتاج RNCs تحمل السلاسل الوليدة من أحجام محددة سلفا 7. وبالتالي، عندما تنصهر أو إدراجها في بروتين الهدف، SecM تسلسل مماطلة تنتج القبض على استطالة سلسلة ببتيد ويولد RNCs مستقرة على حد سواء في الجسم الحي في E. خلايا القولونية و. في المختبر في نظام خالية من الخلايا ويستخدم مزيد من السكروز الطرد المركزي المتدرج لعزل RNCs.
يمكن استخدام RNCs معزولة لتحليل الخصائص الهيكلية والوظيفية في وسيطة مشتركة متعدية للطي. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت بنجاح هذه التقنية للحصول على نظرة ثاقبة لبناء سلاسل عدة متجهة الريبوسوم الوليدة 10،11. نحن هنا وصف عزلة غلوبولين العدسة غاما-B البقري RNCs تنصهر إلى SecM ولدت في الترجمة في نظام المختبر.
من أجل تحقيق النتائج استنساخه، ونوعية وتركيز المكونات المستخدمة في النسخ والترجمة المختبر حاسمة. وقد استخدمنا المتاحة تجاريا في المختبر، ونسخ مقتطفات الترجمة وأنها تعطي نتائج فعالة وقابلة للتكرار، إذا ما تم تناوله بعناية. نوعية مرنا يمكن أن تؤثر على …
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الإنسان الحدود برنامج منح العلوم RGP0024.
Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |