Summary
Wir beschreiben hier eine Technik, die inzwischen routinemäßig eingesetzt wird, um stabil gebundene Ribosomen entstehenden Kette Komplexen (RNC) zu isolieren. Diese Technik nutzt die Entdeckung, dass ein 17 Aminosäuren langes SecM "Verhaftung Sequenz" können Translationselongation in einem prokaryotischen aufzuhalten (
Abstract
Umfangreiche Forschungen haben genügend Beweise darauf hindeutet, dass Proteinfaltung in der Zelle ein Co-translationalen Prozess 5.1 ist vorgesehen. Allerdings ist der genaue Weg, dass Polypeptidkette folgt während der Co-translationale Faltung seiner funktionellen Form zu erreichen immer noch ein Rätsel. Um diesen Prozess zu verstehen und zu den genauen Konformation der cotranslationale Faltungsintermediate bestimmen, ist es wichtig, Techniken, die die Isolierung von RNCs Durchführung naszierenden Ketten von vorgegebenen Größen, um ihre weitere strukturelle Analyse zu ermöglichen erlauben zu entwickeln.
SecM (Sekretion Monitor) ist ein 170 Aminosäuren E. coli-Protein, das die Expression des stromabwärtigen SecA (Sekretion Fahren) ATPase in der secM-Operon secA 6 regelt. Nakatogawa und Ito ursprünglich gefunden, dass ein 17 Aminosäuren lange Sequenz (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) in der C-terminalen Bereich des Proteins SecM ausreichend und notwendig ist,verursachen Abwürgen des SECM Dehnung bei Gly165, wodurch Peptidyl-Glycyl-tRNA stabil an der ribosomalen P-Stelle 9.7 gebunden. Noch wichtiger ist, wurde festgestellt, dass diese 17 Aminosäure langen Sequenz zu der C-Terminus von praktisch jedem voller Länge und / oder verkürzte Protein wodurch die Produktion von RNCs Durchführung naszierenden Ketten von vorbestimmten Größen 7 verschmolzen werden können. Somit, wenn es geschmolzen oder in der Ziel-Protein insertiert, produziert SecM Abwürgen Sequenz Verhaftung der Polypeptidkette Dehnung und erzeugt eine stabile RNCs sowohl in vivo in E. coli-Zellen und in vitro in einem zellfreien System. Saccharosegradientenzentrifugation wird weiter genutzt werden, um RNCs zu isolieren.
Die isolierten RNCs kann zur strukturellen und funktionellen Merkmale der Co-translationale Faltungsintermediate zu analysieren. Kürzlich wurde diese Technik erfolgreich eingesetzt, um Einblicke in die Struktur von mehreren Ribosomen gebundenen naszierenden Ketten 10,11 gewinnen. Hier beschreiben wir die Isolierung von Rinder-Gamma-B Crystallin RNCs zu SecM verschmolzen und erzeugt in einem in vitro Translation System.
Protocol
1. DNA-Schablone Herstellung und in vitro Transkription
- Das Gen von Interesse in einem T7 und / oder zB SP6-Promotor kloniert. Um RNCs von Interesse zu erhalten, ist C-Terminus des Zielpolypeptids mit indem Verhaftung induzierende Sequenz von SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7 verlängert. Um sicherzustellen, dass das Polypeptid-Fragment von Interesse wird extrudieren aus dem ribosomalen Tunnels hat die C-terminale Teil des Proteins mit mindestens 30 Aminosäuren 12-14 verlängert werden. Eine flexible Glycin-Serin-reichen Linker zwischen dem Protein und dem SecM Verhaftung Sequenz eingeführt werden, um etwaige Konformationsrestriktionen vermeiden.
- Für die in vitro Transkription, sollte Matrizen-DNA mit dem Restriktionsenzym Schneiden stromabwärts des ORF linearisiert werden. Man braucht, um eine vollständige Linearisierung der Plasmid-DNA durch Ausführen des Restriktionsverdau Produkt auf Agarose-Gelelektrophorese überprüft.
- Die linearisierte PlasmaID weiter zur in vitro-Transkriptions-Reaktion verwendet. Verschiedene Konzentrationen der Ziel-DNA getestet, um eine optimale DNA-Konzentration für die in vitro Transkription erforderlich zu identifizieren. Generell mit MEGAscript Hohe Ambions Ertrag Transcription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), ergibt 1 pg DNA linearisiert 40-60 pg mRNA. In-vitro-Transkription wird nach Herstellerangaben (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) getan .
- Nach in vitro Transkription, mRNA wird durch Lithiumchlorid Niederschläge nach Herstellerangaben (Ambion die MEGAscript High Yield Transcription Kit, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) gereinigt.
- mRNA-Integrität wird weiterhin durch Elektrophorese mit Acrylamid oder Agarosegelen überprüft.
2. In vitro Translation
Für in vitro Translation mit dem RTS 100 E.coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD) die folgenden Schritte aus:
- Bereiten Sie 100 ul in vitro Translation Reaktion folgende Herstellerangaben. Kurz gesagt, in Nuclease freies Wasser hinzufügen, 24 ul Aminosäurenmischung minus Methionin (1 mM), 10 Einheiten Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi von radioaktivem [35 S]-Methionin (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 ul Reaktionsansatz, 24 ul Rekonstitution Puffer und 24 ul von E. coli-Lysat.
- Inkubieren Sie die Reaktion bei 30 ° C für 5 min auf die warme Übersetzung Reaktion im Voraus. Geben Sie 1-2 pg mRNA an der Übersetzung Reaktion und inkubieren bei 30 ° C für 10-15 min.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Übersetzung Reaktion auf Eis.
3. Isolierung der entstehenden Polypeptid aus in vitro-Translations-Reaktion
- Um RNCs zu isolieren, wird die Übersetzung Reaktion auf von 4,5 ml von 5-30% Saccharose-Gradienten in 20 mM HEPES-KOH pH 7 geschichtet0,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM Kaliumacetat, 1 mM DTT und zentrifugiert mit Beckman Coulter-SW55 Ti Rotor bei 41.000 rpm, 4 ° C für 2 Stunden.
- Nach der Zentrifugation wird Saccharose-Gradienten fraktioniert, um verschiedene Populationen ribosomalen und zugehörige naszierenden Ketten zu isolieren. Die Trennung erfolgt durch Anwendung der ISCO Programmierbare Density Gradient-System mit kontinuierlicher Aufnahme bei 254 nm mit Hilfe eines ISCO UA-6-Absorptions-Detektors.
- Die Fraktion (en), die 70S-Ribosomen gesammelt und weiter analysiert je nach Ziel des Experiments.
4. Beobachtung von Protein gehalten, Tris-Tricin SDS-PAGE Ribosom
Um zu überprüfen, ob die erweiterten SecM Protein gebunden an die 70S-Ribosoms bleibt, wurden Gradienten-Fraktionen gesammelt und wie folgt behandelt:
- Protein in jeder Fraktion wurde durch Zugabe von Trichloressigsäure (TCA) bis zu einer Endkonzentration von 10% ausgefällt und über Nacht bei 4 ° C overnight.
- Nach Inkubation über Nacht wurden die Proben bei 14.000 × g für 15 min auf das Protein Pellet zentrifugiert. Nach der Zentrifugation Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde zweimal mit Aceton enthaltenden Lösung: 1 mM Tris-HCl, pH 7,6 (4:1). Pellet wurde weiter Luft getrocknet und in SDS-PAGE-Beladungspuffer.
- Die behandelte Probe wurde aufgelöst und mittels Tris-Tricin SDS-PAGE.
- Nach der Elektrophorese Gele fixiert wurden, trocknet mit Vakuum-Gel Färber und einer Autoradiographie unterzogen. Die Verteilung der entstehenden Polypeptide wurden mittels Phosphoimaging.
5. Repräsentative Ergebnisse
Hier präsentieren wir ein Experiment beschreiben die Isolierung der full-length Rinder-Gamma-B Crystallin stabil an die 70S-Ribosom gebunden. Abbildung 1 zeigt die Schritte bei der Isolierung von Rinder-Gamma-B Crystallin RNCs beteiligt. Der C-Terminus der gamma-B Crystallin wurde insgesamt um 32 Aminosäuren t erweiterto sicherzustellen, dass die Protein voller Länge extrudiert aus der ribosomalen Tunnels, das auch die SecM Abwürgen Sequenz ganz am C-Terminus des Fusionspolypeptids angeordnet. Nach in vitro Translation wurden die 70S Ribosomen durch Saccharosegradientenzentrifugation (Abbildung 2.1) isoliert. Um sicherzustellen, dass das Protein stabil an das Ribosom gebunden bleibt, die 70S-enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, ausgetauscht entsalzt, Puffer und unterworfen, um eine weitere Serie von Saccharose-Gradienten-Zentrifugation (Abb. 2.2). Das Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt, lässt erahnen, dass SecM effizient induzieren translationale Verhaftung der Gamma-B Crystallin RNCs.
Abbildung 1. Schematische Erläuterung der Schritte zur Isolierung von RNCs beteiligt. C-Terminus von Rindern Gamma-B Crystallin mit 32 Aminosäuresequenz verlängert. Diese erweiterteC-terminalen Regionen auch SecM Verhaftung Sequenz. Gamma-B Crystallin mit SecM Sequenz wurde in pIVEX 2,3 (T7 basiert) Plasmid kloniert. Für in vitro-Transkription der Template-DNA wurde durch XbaI linearisiert. Linearisierte Template wurde für weitere in vitro-Transkription verwendet. Die T7 in der DNA-Matrize durch T7-RNA-Polymerase, die die Gamma-B Crystallin Gen stromabwärts des T7-Promotors transkribiert erkannt. mRNA wurde unter Verwendung von Lithiumchlorid Fällungsverfahren. Die gereinigte mRNA wurde dann für in vitro-Translation verwendet. Nach der Inkubation wurde die Übersetzung Reaktion auf von 5-30% Saccharose-Gradienten geschichtet und zentrifugiert, Beckman Coulter SW55-Ti-Rotor bei 41.000 UpM, 4 ° C für 2 Stunden.
Abbildung 2. Isolierung von Rinder-Gamma-B Crystallin RNCs stabil an die 70S-Ribosom gebunden. 1 pg mRNA wurde in 100 ul E. Reaktion gemischt coli S30 Extract System nach dem Protokoll Abschnitt mit 20 Ci [35 S]-Methionin genannten und bei 30 ° C für 15 min. Nach der Inkubation wurde die Übersetzung Reaktion auf von 5-30% Saccharose-Gradienten in 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM Kaliumacetat, 1 mM DTT geschichtet und zentrifugiert, Beckman Coulter SW55-Ti-Rotor in 41.000 rpm, 4 ° C für 2 Stunden. Nach Sedimentation Geschwindigkeit wurde der Gradient entladen und das Ribosom Pro l erhalten wurde. Die Daten wurden von der PeakTrak Programm (ISCO Gradienten Dichtegradienten Fraktionierung System) aufgezeichnet. Die Fraktionen wurden gesammelt, wurde das Protein TCA gefällt und auf 16,5% T gelöst, 6% C Tris-TRicin PAGE-Gel 15. Das Gel wurde getrocknet und mit für die Autoradiographie. Nach der Belichtung wurde das Gel gescannt mit Typhoon 9410 Imaging-Scanner. Abbildung 2.1 zeigt, dass in voller Länge Gamma-B Crystallin in 70S-Ribosoms Fraktionen ist. Somit ermöglicht SecM Abwürgen Sequenz die Isolierung der stabilen Rinder-gamma-B Crystallin RNCs. Die Daten in Abbildung 2.2 zeigen deutlich, dass die isolierten RNCs zwar stabil sind. In dem beschriebenen Experiment-70S-Fraktionen nach der ersten Runde der Saccharose-Gradienten-Zentrifugation wurden gepoolt und der Saccharose wurde unter Verwendung von Amicon Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheit (Millipore), durch Pufferaustausch in Lösung mit 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 15 mM, gefolgt MgCl 2, 100 mM Kaliumacetat, 1 mM DTT. Diese Probe wurde weiter zu einer weiteren Runde der Zentrifugation durch 5-30% Saccharose-Gradienten und fraktionierte unterzogen. Jede Fraktion wurde behandelt und analysiert wie in Abbildung 2.1.
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Discussion
Für reproduzierbare Ergebnisse, Qualität und Konzentration der Komponenten für die in vitro Transkription und Translation verwendet werden, sind kritisch. Wir haben uns verwendeten kommerziell erhältlichen in vitro Transkription und Translation-Extrakte und sie geben eine effiziente und reproduzierbare Ergebnisse, bei sorgfältiger Behandlung. Die Qualität der mRNA enthaltene Übersetzung beeinflussen, so ist es von größter Bedeutung für die Integrität der mRNA, bevor Sie es für in vitro-Translation zu testen. Inkubationszeit auf die in vitro-Translation variiert mit der Länge des Proteins. Auch kann die Zeit / Geschwindigkeit der Zentrifugation entsprechend angepasst werden, für den Fall, das 70S ribosomale Fraktion ist nicht gut aufgelöst und getrennt von den 50er Jahren. Ferner sollte Ribosom gebundene Protein-Komplexe vorsichtig gehandhabt werden, um RNase Kontamination zu vermeiden. Darüber hinaus sollten die Puffer-Bedingungen sorgfältig überwacht werden und Chelatbildner, die Mg 2 +-Chelat könnte vermieden werden sollte.
SecM FestnahmeSequenz, auf dessen Übersetzung in Wechselwirkung mit den ribosomalen Proteinen L4 und L22 sowie 23S-rRNA in der ribosomalen Tunnel 7,8. Eine Reihe von kritischen Reste, die zusammen die SecM Verhaftung Motiv, sind F XXXX XXXX GIRAGP WI 7 (in Fettdruck) von immenser Bedeutung, wodurch die Effizienz der translationalen Verhaftung. Mutationen oder Deletionen dieser kritischen Reste können zur Erleichterung der Übersetzung Dehnung 7,8 Verhaftung führen. Somit Beibehaltung der Reihenfolge der Verhaftung SecM Motiv F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 intakt ist absolut notwendig, um sicherzustellen, dass das Protein unter Studie blieben stabil an das Ribosom gebunden.
Diese Technik kann für die Analyse der Struktur des co-translationalen Zwischenprodukte und co-translationalen Faltung verschiedener Proteine verwendet werden. Es wurde vor kurzem erfolgreich eingesetzt, um die genaue Struktur ermitteln of mehreren Ribosom gebundenen naszierenden Ketten mit Hilfe von NMR 10-11. Darüber hinaus kann diese Technik auch verwendet werden, um entstehende Peptide von vorbestimmten Größen für die Analyse der Tertiärstruktur Wechselwirkungen mit akzessorischen Proteinen, Cofaktoren oder Liganden zu erzeugen.
Ein alternativer Ansatz zur RNC-Komplexe zu erzeugen würde die Verwendung von trunkierten mRNAs Stoppcodon fehlt. Dieser Ansatz wurde in großem Stil von vielen Forschern benutzt, um zu studieren Co-translationale Proteinfaltung siehe zB 12,16. Es muss jedoch eine Reihe von Nachteilen. Dieser Ansatz kann nicht in vivo eingesetzt werden und auch problematisch für die Verwendung in vitro mit E. coli aufgrund des Vorhandenseins in E. extrahieren coli SsrA System, vermittelt Zugabe des C-terminalen Peptid-Tag (AANDENYALAA) das Protein aus der mRNAs ohne in-frame Stoppcodons übersetzt, was zu deren Abbau 17. Daher wird in dem letzteren Fall muss man eine völlig Rekonstitution verwendentuierten System und / oder ein System, fehlt / Unterdrückung ssrA-Tagging-Maschinen. SecM-gerichtet Abwürgen ist effizient und einzigartig, da es erwiesenermaßen ins Stocken geraten Ribosom-Komplexen in vivo und in vitro mit fast ähnlichen Wirkungsgrad 18 zu erzeugen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Human Frontier Science Program RGP0024 Zuschuss finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
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