Summary
ここでは今定期的に安定的に結合したリボソーム新生鎖複合体（のRNC）を分離するために使用される手法について説明します。この手法は、17アミノ酸長いSECM "逮捕シーケンスは"原核生物の翻訳伸長を停止することができるという発見を利用しています（
Abstract
広範な研究は、細胞内のタンパク質のフォールディングの共同翻訳プロセス1から5であることを示唆している十分な証拠を提供しています。しかし、その機能的なフォームを実現するための共同翻訳折りたたみ時のポリペプチド鎖が続くことを正確な経路はまだ謎です。このプロセスを理解し、共同翻訳の折り畳み中間体の正確な立体構造を決定するために、それは彼らのさらなる構造解析を可能にするために所定のサイズの新生鎖を保有するRNCの分離を可能にする技術を開発することが不可欠です。
SECM（分泌モニター）は、170アミノ酸E.です。 SECM-セカオペロン6の下流セカ（分泌駆動）ATPaseの発現を調節する大腸菌の蛋白質。 Nakatogawaと伊藤は当初、SECMタンパク質のC末端領域17アミノ酸長いシーケンス（150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166）への十分かつ必要であることがわかったこれにより、安定したリボソームのP部位7-9結合したペプチジル-グリシル-tRNAを生成する、Gly165でSECM伸びの停滞が発生します。さらに重要なのは、それはこの17アミノ酸長いシーケンスは、このように所定の大きさ7の新生鎖を保有するRNCの生産を可能にする事実上すべてのフルレングスおよび/ または切り捨てられたタンパク質のC末端に融合させることができることがわかった。したがって、標的タンパク質に融合または挿入したときに、SECMストールシーケンスは、ポリペプチド鎖の伸長の逮捕を生成し、E.の in vivo の両方で安定したRNCを生成する大腸菌細胞と無細胞系の in vitro インチショ糖密度勾配遠心法は、さらにRNCを分離するために利用されています。
孤立したRNCは、共同翻訳の折り畳み中間体の構造的および機能的特徴を分析するために使用することができます。最近、この手法は成功した10,11、いくつかのリボソーム結合した新生鎖の構造への洞察を得るために使用されている。ここでは、ウシγ-BクリスタリンのRNCの分離SECMに融合し 、in vitro 翻訳系で生成について説明します。
Protocol
1。 DNAテンプレートの調製とin vitro転写
- 目的の遺伝子は、任意のT7および/または、例えばプラスミドに基づくSP6プロモーターに複製されます。興味のあるRNCを得るためには、標的ポリペプチドのC末端は、SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7の逮捕誘導シーケンスを追加することによって拡張されています。目的のポリペプチドフラグメントは、リボソームトンネルの外に押し出すことを保証するためには、標的タンパク質のC末端部分は、少なくとも30のアミノ酸12から14によって拡張する必要があります。柔軟性のグリシン - セリン豊富なリンカーは、すべての可能なコンフォメーションの制約を回避するために、タンパク質とSECM逮捕·シーケンスの間に導入することができます。
- in vitro転写では、テンプレートDNAは、ORFの下流を切断する制限酵素で直線化されるべきである。一つは、アガロースゲル電気泳動で制限酵素消化製品を実行することにより、プラスミドDNAの完全な線形化を確認する必要があります。
- 線形化されたプラズマidは、さらにin vitro転写反応のために使用されます。テンプレートDNAの異なる濃度は 、in vitro転写のために必要な最適なDNA濃度を識別するためにテストすることができます。一般的にAmbionのMEGAscript高利回り転写キット（Ambion社/ライフテクノロジーズ、Grand Island、NY）を、1μgの直鎖状DNAの収率40から60μgのmRNAと。in vitro転写メーカーの指示（Ambion社/ライフテクノロジーズ、ニューヨーク州グランドアイランド）に続いて行われます。
- in vitro転写に続いて 、mRNAは、製造元の指示（AmbionのMEGAscript高利回り転写キット、Ambion社/ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY）によると塩化リチウム沈殿により精製されています。
- mRNAの整合性は、さらに、アクリルアミドまたはアガロースゲルを用いて電気泳動によって確認されています。
（2）in vitro翻訳
RTS 100 E.大腸菌HYキット（5首相、ゲイザーを使用してin vitro翻訳のためにsburg、MD）は次の手順に従います。
- メーカーの指示に続くin vitro翻訳反応で 100μlの準備をします。簡単に言えば、ヌクレアーゼフリーの水で24μlのアミノ酸混合物を引いたメチオニン（1mM）を、リボヌクレアーゼインヒビターの10単位（Invitrogen社/ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY）、放射性の20μCiの[35 S]（-メチオニンのMPバイオメディカルを追加ソロン、オハイオ州）、20μlの反応ミックスは、24μlの再構成バッファとE.の24μlを大腸菌ライセート。
- 暖かい翻訳反応を事前に5分間30℃で反応をインキュベートします。 10〜15分間30℃での翻訳反応とインキュベートするmRNAの1〜2μgのを追加します。
- 氷の上で翻訳反応を置くことによって反応を停止します。
3。 in vitro翻訳反応でから新生ポリペプチドの単離
- RNCを分離するには、翻訳反応は、20mM HEPES-KOH pHが7の5〜30％のショ糖勾配の4.5ミリリットルの上に積層されている0.5、15 mMのMgCl 2、100mMの酢酸カリウム、1mMのDTT及び41000 rpmでベックマン·コールター社のSW55-Tiローター、4℃で2時間Cを使用して遠心分離した。
- 遠心分離後、ショ糖密度勾配は異なるリボソーム集団とそれに関連する新生鎖を分離する分画する。分離は、ISCO UA-6吸光度検出器を用いて254nmで連続記録とISCOプログラマブル密度勾配システムを使用して監視されます。
- 70Sリボソームを含む画分（s）を収集し、さらに実験の目的に応じて分析されます。
4。トリス - トリシンSDS PAGEでのリボソームに結合したタンパク質の観察
SECM拡張タンパク質はリボソーム70Sに接続されたままであるかどうかを確認するには、勾配分画を回収し、次のように扱われました。
- 各画分中のタンパク質は10％の最終濃度になるようにトリクロロ酢酸（TCA）を添加することにより沈殿させ、4℃overniでインキュベートしたGHT。
- 一晩インキュベートした後、試料をペレットに15分タンパク質を14,000×gで遠心分離した。以下の遠心上清を除去し、ペレットをアセトンを含有する溶液で2回洗浄した。1 mMのトリス-HCl pHは7.6（4:1）。ペレットは、さらに空気が乾燥した後、SDS-PAGEローディング緩衝液に溶解した。
- 処理された試料が解決され、トリス - トリシンSDS-PAGEにより分析した。
- 電気泳動後、ゲルを固定し、真空ゲル染色を使用して、オートラジオグラフィーにかけ乾燥させた。新生ポリペプチドの分布はphosphoimagingを用いて観察した。
5。代表的な結果
ここでは、安定した70Sリボソームに結合したフルレングスウシγ-Bクリスタリンの分離を説明する実験を提示します。 図1は、ウシγ-BクリスタリンのRNCの分離に必要な手順を示しています。 γ-BクリスタリンのC末端が32アミノ酸tで全体的な拡張されましたoは、リボソームトンネルからその全長タンパク質の押し出しを確保する、これはまた、融合ポリペプチドのC末端は非常に配置されたSECM失速シーケンスが含まれています。 in vitro翻訳に続いて 、70Sリボソームは、ショ糖密度勾配遠心法（図2.1）により単離した。蛋白質が安定してリボソームに結合したままであることを確認するためには、分数を含む70Sをプールした、脱塩、バッファーが交換され、ショ糖密度勾配遠心の追加ラウンド（図2.2）に供した。 図2に示す結果が明確にSECMを効率的にγ-BクリスタリンのRNCの翻訳停止を誘導することを示唆している。
図1。 RNCの分離に必要な手順の概略説明。ウシγ-BクリスタリンのC末端が32アミノ酸配列によって拡張されました。この拡張C-末端領域にもSECM逮捕配列を含む。 SECM配列を有するγ-BクリスタリンはpIVEX 2.3（T7ベース）プラスミドにクローニングした。 in vitro転写用テンプレートDNAをXbaIで直線化されました。線形化されたテンプレートは、さらにin vitro転写のために使用されていました。 DNAテンプレートのT7は、T7プロモーターの下流に位置する、γ-Bクリスタリン遺伝子を転写するT7 RNAポリメラーゼによって認識されている。 mRNAは、塩化リチウム沈澱法を用いて精製した。精製したmRNAはその後in vitro翻訳のために使用されていました。以下のインキュベーションは、翻訳反応は、5〜30％のショ糖勾配の上に重層し、2時間41000回転、4℃でベックマン·コールター社のSW55-Tiローターで遠心分離した。
図2。ウシγ-Bクリスタリンの分離が安定して70Sリボソームに結合したRNCは1μgのmRNAを100μlの反応E.で混合した大腸菌 S30抽出システム20μCiの[35 S]でプロトコルの項で述べたように-メチオニン、15分間30℃でインキュベートした。以下のインキュベーションは、翻訳反応は、20mMのHEPES-KOH pHは7.5、15 mMのMgCl 2、100mMの酢酸カリウム、1mMのDTTに5〜30％のショ糖勾配の上に重層し、41000で、ベックマン·コールター社のSW55-Tiローターで遠心分離した。 rpmで2時間、4℃。速度沈降に続いて、勾配がアンロードされ、リボソームプロルが得られた。データはPeakTrakプログラム（ISCO勾配密度勾配分画システム）によって記録された。画分を回収し、タンパク質は、CのTris-T 6％、16.5％のTにTCA沈殿させ、解決されましたricine PAGEゲル15。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィー用に公開されました。次の暴露は、ゲルは台風9410イメージングスキャナを使用してスキャンした。 図2.1は、フルレングス、γ-Bクリスタリンは、70Sリボソームの分画に存在することを示している。したがって、SECM失速シーケンスは、安定したウシγ-BクリスタリンのRNCの分離を可能にします。 図2.2のデータは、明確に分離されたRNCのは確かに安定していることを示しています。現在の実験では、ショ糖密度勾配遠心分離の最初のラウンド後の70S画分をプールし、スクロース、20 mMのHEPES-KOH pH7.5で、15mMのを含む溶液中に緩衝液交換に続いてアミコンウルトラ-4遠心式フィルターユニット（ミリポア）を使用して、削除されましたのMgCl 2、100mMの酢酸カリウム、1mMのDTT。このサンプルは、さらに5〜30％のショ糖密度勾配遠心分離によって分画し、追加のラウンドを行った。各画分は処理され、 図2.1のように分析した。
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Discussion
再現可能な結果を得るためには、in vitro転写と翻訳のために使用されるコンポーネントの品質と濃度が非常に重要です。慎重に処理した場合、我々は、in vitro転写と翻訳の抽出物で市販されている使用していると、彼らは効率的かつ再現可能な結果を与える。 mRNAの品質は翻訳に影響を与えることがないので、in vitro翻訳のためにそれを使用する前に、mRNAの整合性をテストするために最も重要である。 in vitro翻訳のためのインキュベーション時間は、タンパク質の長さによって異なります。また、遠心分離の時間/速度は場合には、70Sリボソーム画分をうまく解決されていないと50Sから分離し、それに応じて調整することができます。さらに、リボソーム結合タンパク質複合体は、RNaseのコンタミを避けるために慎重に処理する必要があります。また、バッファの状態を注意深く監視する必要がありますおよびMg 2 +をキレートするかもしれませんキレート剤は避けるべきである。
SECMを逮捕シーケンスは、その翻訳にリボソームタンパク質L4及びL22と同様にリボソームトンネル7,8の23S rRNA遺伝子と相互作用する。 SECM逮捕モチーフを構成する重要な残基の数、F XXXX XXXX WI GIRAGP 7（太字）の翻訳停止の効率性を確保し、計り知れない重要なものである。突然変異、または、これらの重要な残基の欠失は、翻訳伸長停止7,8の救済につながる可能性があります。したがって、そのままSECM逮捕モチーフF XXXX XXXX WI GIRAGP 7のシーケンスを維持することは研究対象の蛋白質が安定してリボソームに結合したままだろうことを保証するために不可欠です。
この技術は、共同翻訳の中間と様々なタンパク質の共翻訳折り畳み構造の解析に使用することができます。それが最近成功したO構造を正確に決定するために使用されていますF NMR 10-11の助けを借りていくつかのリボソーム結合した新生チェーン。さらに、この技術はまた、アクセサリータンパク質、補因子またはリガンドとの三次相互作用を分析するための所定のサイズの新生ペプチドを生成するために使用することができます。
RNCは複合体を生成する別のアプローチは、終止コドンを欠いているが切り捨てられたmRNAを使用することを伴うだろう。このアプローチは、広く共同翻訳、タンパク質のフォールディングは、 例えば12,16を参照して勉強する多くの研究者によって使用されています。しかし、それは多くの欠点を持っています。このアプローチは、in vivoでの採用とE.を用いた in vitro での使用にも問題ができません。 大腸菌は、大腸菌に存在するために抽出するSSRAシステムの大腸菌を媒介するその分解17につながる、インフレーム終止コドンなく、mRNAから翻訳されたタンパク質のC末端ペプチドタグ（AANDENYALAA）を添加。したがって、後者の場合では、1つは完全にreconstiを使用する必要がありtutedシステムおよび/または/抑制SSRAタグ付け機械を欠いているシステムです。それはほぼ同じ効率18でin vivoおよび in vitro で停止リボソーム複合体を生成することが証明されているようにSECM指向失速は、効率的でユニークです。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム助成RGP0024によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
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