Summary
Vi beskriver her en teknik, der nu rutinemæssigt anvendes til at isolere stabilt bundet ribosom vordende kæde-komplekser (RNC'er). Denne teknik udnytter den erkendelse, at en 17 aminosyre langt SecM "arrest sekvens" kan standse translation forlængelse i en prokaryot (
Abstract
Omfattende forskning har givet rigelige beviser tyder på, at proteinfoldning i cellen er en co-translationel proces 1-5. Men den nøjagtige vej at polypeptidkæde følger i løbet af co-translationel folde for at opnå den funktionelle form er stadig en gåde. For at forstå denne proces og til at bestemme den nøjagtige konformationen af de co-translationale foldning mellemprodukter, er det vigtigt at udvikle teknikker, der tillader isolering af RNC'er bærer nascente kæder af forudbestemte størrelser, så de yderligere strukturel analyse.
SecM (sekretion monitor) er et 170 aminosyre E. coli-protein, der regulerer ekspressionen af den nedstrøms SecA (sekretion kørsel) ATPase i secM-SecA operon 6. Nakatogawa og Ito oprindeligt fundet, at en 17 aminosyre lange sekvens (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) i den C-terminale region af SecM proteinet er tilstrækkeligt til atforårsage blokering af SecM forlængelse ved Gly165, hvorved der frembringes peptidyl-glycyl-tRNA stabilt bundet til det ribosomale P-site 7-9. Vigtigere, blev det konstateret, at denne 17 aminosyrer lange sekvens kan fusioneres til den C-terminale ende af praktisk talt alle fuld længde og / eller trunkeret protein således tillader fremstillingen af RNC'er bærer nascente kæder forudbestemte størrelser 7. Således, når det er fusioneret eller indsættes i målproteinet, SecM blokering sekvens frembringer standsning af polypeptidet kædeforlængelse og genererer stabile RNC'er både in vivo i E. E. coli celler og in vitro i et celle-frit system. Saccharosegradientcentrifugering yderligere anvendes til at isolere RNC'er.
De isolerede RNC'er kan anvendes til at analysere strukturelle og funktionelle træk ved de co-translationelle foldning mellemprodukter. For nylig er denne teknik blevet anvendt til at opnå indsigt i strukturen af adskillige ribosom bundne nascente kæder 10,11. Her beskrives isoleringen af bovine gamma-B crystallin RNC'er fusioneret til SecM og genereret i et in vitro translationssystem.
Protocol
1. DNA-template Fremstilling og in vitro-transskription
- Genet af interesse klones i enhver T7 og / eller f.eks SP6-promotoren baseret plasmid. Til opnåelse RNC'er af interesse, er C-terminalen af målpolypeptidet forlænget ved tilføjelse arrestationen inducerende sekvens SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. For at sikre, at polypeptidfragmentet af interesse vil ekstrudere af den ribosomale tunnelen, den C-terminale del af målproteinet skal udvides med mindst 30 aminosyrer 12-14. En fleksibel glycin-serin rig linker kan indføres mellem proteinet og SecM arrest sekvensen for at undgå mulige konformationelle begrænsninger.
- Til in vitro-transkription bør template-DNA lineariseret med restriktionsenzymet skære nedstrøms for ORF. Et behov for at kontrollere fuldstændig linearisering af plasmid-DNA ved at køre restriktionsfordøjelse produktet agarosegelelektroforese.
- Den lineariserede plasmid yderligere anvendes til in vitro transcription reaktionen. Forskellige koncentrationer af template-DNA kan testes for at identificere optimale DNA koncentration, der kræves til in vitro transkription. Generelt med Ambion s MEGAscript Højt udbytte Transcription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), giver 1 pg lineariseret DNA 40-60 mikrogram mRNA. In vitro-transskription sker efter producentens anvisninger (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
- Efter in vitro-transskription, mRNA oprenses ved lithiumchlorid nedbør i henhold til producentens anvisninger (Ambion har MEGAscript Højt udbytte Transcription Kit, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- mRNA integritet yderligere efterprøves ved elektroforese under anvendelse acrylamid eller agarose geler.
2. In vitro translation
Til in vitro-translation under anvendelse af RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD), skal du følge nedenstående trin:
- Fremstilling af 100 gl af en in vitro translationsreaktion følgende producentens anvisninger. Kort fortalt, i nuclease frit vand tilsættes 24 ul aminosyreblanding minus methionin (1 mM), 10 enheder ribonucleaseinhibitor (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi af radioaktivt [35S]-methionin (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 gl reaktionsblanding, 24 pi Rekonstitution puffer og 24 pi af E. coli-lysat.
- Inkuberes reaktionsblandingen ved 30 ° C i 5 minutter til præ opvarmes translationsreaktionen. Tilsættes 1-2 ug af mRNA til translation reaktionen og inkuber ved 30 ° C i 10-15 min.
- Reaktionen standses ved at placere translationsreaktionen på is.
3. Isolering af nascente polypeptid fra in vitro translationsreaktion
- At isolere RNC'er er translationsreaktionen lag oven på 4,5 ml 5-30% sucrose-gradient i 20 mM HEPES-KOH pH 70,5, 15 mM MgCl2, 100 mM kaliumacetat, 1 mM DTT og centrifugeret under anvendelse Beckman Coulter SW55-Ti rotor ved 41.000 rpm, 4 ° C i 2 timer.
- Efter centrifugering er saccharosegradient fraktioneres til at isolere forskellige ribosomale populationer og tilhørende nascente kæder. Separation overvåges ved hjælp af ISCO Programmable Density Gradient System med kontinuerlig registrering ved 254 nm under anvendelse af en ISCO UA-6 absorbansdetektor.
- Den fraktion (er) indeholdende 70S-ribosomer opsamles og analyseres yderligere afhængig af formålet af eksperimentet.
4. Observation af protein bundet til ribosomet med Tris-tricin SDS PAGE
For at kontrollere, om SecM udvidede proteinet forbliver knyttet til 70S ribosom, blev gradientfraktioner indsamles og behandles som følger:
- Protein i hver fraktion blev udfældet ved tilsætning af trichloreddikesyre (TCA) til en slutkoncentration på 10% og inkuberes ved 4 ° C overniGHT.
- Efter inkubation natten over blev prøverne centrifugeret ved 14.000 x g i 15 minutter for at pelletere proteinet. Efter centrifugering blev supernatanten fjernet, og pelleten blev vasket to gange med opløsningen indeholdende acetone: 1 mM Tris-HCI pH 7,6 (04:01). Pelleten blev yderligere lufttørret og opløst i SDS-PAGE loadingbuffer.
- Den behandlede prøve blev opløst og analyseret ved Tris-Tricin-SDS-PAGE.
- Efter elektroforese, Gelerne blev fikseret tørret under anvendelse af vakuum gel Dyer og underkastet autoradiografi. Fordelingen af nascente polypeptider blev observeret under anvendelse phosphoimaging.
5. Repræsentative resultater
Her udgør et eksperiment beskriver isoleringen af fuld-længde bovint gamma-B crystallin stabilt bundet til 70S ribosom. Figur 1 viser trinene, der er involveret i isoleringen af bovine gamma-B crystallin RNC'er. C-terminalen af gamma-B crystallin blev forlænget samlet ved 32 aminosyrer to sikre fuld-længde protein ekstruderer ud af det ribosomale tunnelen, hvilket også indbefatter SecM blokering sekvens placeret i det C-terminale ende af fusionspolypeptidet. Efter in vitro translation blev 70S-ribosomer isoleret ved sucrose-gradient centrifugering (fig. 2,1). For at sikre, at proteinet forbliver stabilt bundet til ribosomet blev 70S fraktioner blandedes, afsaltet, bufferudskiftet og underkastes en yderligere runde af sucrose-gradient centrifugering (fig. 2,2). Resultatet præsenteret i Figur 2 viser tydeligt, at SecM effektivt kan fremkalde translationel anholdelsen af Gamma-B crvstallin RNC'er.
Figur 1. Skematisk beskrivelse af de involverede trin i isoleringen af RNC'er. C-terminus af bovint gamma-B crystallin er blevet udvidet ved 32 aminosyresekvens. Denne udvidedeC-terminale regioner også SecM arrest sekvens. Gamma-B crystallin med SecM sekvensen blev klonet i pIVEX 2,3 (T7 baseret) plasmid. Til in vitro-transkription af skabelon-DNA blev lineariseret ved XbaI. Lineariserede template blev yderligere anvendt til in vitro-transskription. T7 i DNA-templaten genkendes af T7 RNA polymerase, som transkriberer den gamma-B crystallin-genet placeret nedstrøms for T7-promotoren. mRNA blev oprenset under anvendelse af lithiumchlorid udfældning metode. Det oprensede mRNA blev derefter anvendt til in vitro-translation. Efter inkubering blev translationsreaktionen lag oven på 5-30% saccharosegradient og centrifugeret i Beckman Coulter SW55-Ti rotor ved 41.000 rpm, 4 ° C i 2 timer.
Figur 2. Isolering af bovint gamma-B crystallin RNC'er stabilt bundet til 70S ribosom. 1 ug mRNA blev blandet i 100 ul reaktion E. coli S30-ekstrakt system som nævnt i protokollen sektion med 20 gCi [35S]-methionin og inkuberet ved 30 ° C i 15 min. Efter inkubering blev translationsreaktionen lag oven på 5-30% sucrose-gradient i 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM kaliumacetat, 1 mM DTT og centrifugeret i Beckman Coulter SW55-Ti rotor ved 41.000 rpm, 4 ° C i 2 timer. Efter hastighed sedimentation blev gradient losses, og ribosomet pro le blev opnået. Dataene blev registreret ved PeakTrak programmet (ISCO gradient densitetsgradientfraktionering system). Fraktioner blev opsamlet, at proteinet var TCA udfældet og opløst på 16,5% T, 6% C Tris-Tricinusolie PAGE-gel 15. Gelen blev tørret og eksponeret for autoradiografi. Efter eksponering gelen blev scannet med Typhoon 9410 billeddannelse scanneren. Figur 2,1 viser, at fuld-længde Gamma-B crvstallin er til stede i 70S ribosom-fraktioner. Således SecM staller sekvens tillader isolering af de stabile bovine gamma-B crystallin RNC'er. Data i Figur 2,2 viser tydeligt, at de isolerede RNC'er er virkelig stabil. I den aktuelle forsøget 70S fraktionerne efter første runde af sucrose-gradient centrifugering blev samlet og saccharosen blev fjernet under anvendelse af Amicon Ultra-4 centrifugalfilterenhed (Millipore), efterfulgt af bufferudskiftning i opløsning indeholdende 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM kaliumacetat, 1 mM DTT. Denne prøve blev yderligere udsat for en yderligere runde af centrifugering gennem 5-30% saccharosegradient og fraktioneres. Hver fraktion blev behandlet og analyseret som i figur 2.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For reproducerbare resultater, og koncentration af de komponenter, der anvendes til in vitro transkription og translation er kritiske. Vi har anvendt kommercielt tilgængeligt in vitro transkriptions-og translationselementer ekstrakter og de giver en effektiv og reproducerbare resultater, hvis den håndteres forsigtigt. Kvaliteten af mRNA kan påvirke translation, så er det af yderste vigtighed for at teste integriteten af mRNA'en før brug for in vitro translation. Inkubationstid for in vitro translation varierer med længden af proteinet. Desuden kan tiden / hastighed centrifugering justeres i overensstemmelse hermed i tilfælde er 70S ribosomale fraktionen ikke godt opløst, og adskilt fra 50S. Endvidere bør ribo bundne protein komplekser håndteres omhyggeligt for at undgå RNase forurening. Desuden bør pufferbetingelser monitoreres nøje og chelateringsmidler, der kan chelat Mg2 +, bør undgås.
SecM anholdelsesekvensen efter dets translation interagerer med ribosomale proteiner L4 og L22 samt 23S rRNA i det ribosomale tunnelen 7,8. En række kritiske rester, udgør SecM anholdelsen motivet, F XXXX WI XXXX GIRAGP 7 (med fed skrift) er af stor betydning, at sikre effektiviteten af translationel anholdelsen. Mutationer eller deletioner af disse kritiske rester kan føre til lindring af oversættelsen forlængelse anholdelsen 7,8. Således opretholder sekvensen af SecM arrest motivet F XXXX WI XXXX GIRAGP 7 intakt er absolut nødvendig for at sikre, at proteinet under undersøgelse ville forblive stabilt bundet til ribosomet.
Denne teknik kan anvendes til analyse af strukturen af co-translationale mellemprodukter og co-translationel foldning af forskellige proteiner. Det er for nylig blevet succesfuldt anvendt til at bestemme den nøjagtige struktur of flere ribo bundne spirende kæder ved hjælp af NMR 10-11. Endvidere kan denne teknik også anvendes til at generere nascente peptider forudbestemte størrelser til analyse af deres tertiære interaktioner med accessoriske proteiner, cofaktorer eller ligander.
En alternativ fremgangsmåde til fremstilling RNC'er komplekser indebærer anvendelse af trunkerede mRNA'er, der mangler stopkodon. Denne tilgang er blevet brugt af mange forskere til at studere co-translationel proteinfoldning se f.eks 12,16. Det har imidlertid et antal ulemper. Denne fremgangsmåde kan ikke anvendes in vivo og også problematisk til anvendelse in vitro med E. coli ekstrakt grund af tilstedeværelse i E. coli af SsrA, der medierer tilsætning af den C-terminale peptid tag (AANDENYALAA) til proteiner oversat fra mRNA'er uden i-ramme stop codon, hvilket fører til deres nedbrydning 17. Derfor, i sidstnævnte tilfælde må man anvende et fuldstændigt reconstituted system og / eller et system, der mangler / undertrykke SsrA-tagging maskiner. SecM-rettet stampe, er effektiv og enestående, da det har vist sig at producere stampe ribo-komplekser in vivo og in vitro med næsten samme effektivitet 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Human Frontier Science Program tilskud RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System | |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O.
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J.
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S.
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
