Summary
Beskrevet her er en teknik, hvor lipopolysaccharid injiceres i lakterende muse brystkirtel via brystvorten at simulere mastitis, en betingelse, der almindeligvis forårsaget af bakteriel infektion. Lipopolysaccharid injektion resulterer i øget nuclear factor kappa B (NF-KB) signalering, visualiseret ved bioluminescerende billeddannelse af en NF-KB luciferase reporter mus.
Abstract
Dyremodeller for human sygdom er nødvendige for at strengt studere stadier af sygdommen og dermed forbundne mekanismer, og i sidste ende, som prækliniske modeller til at teste indgreb. Ved disse fremgangsmåder beskriver vi en teknik, hvor lipopolysaccharid (LPS) injiceres i lakterende muse brystkirtel via brystvorten, effektiv modellering mastitis eller inflammation af kirtlen. Denne simulerede infektion resulterer i forøget nuclear factor kappa B (NF-KB) signalering, som visualiseres ved bioluminescerende billeddannelse af en NF-KB luciferase reporter mus 1.
Vores ultimative mål med at udvikle disse metoder var at undersøge inflammation associeret med mastitis i lakterende kirtel, der ofte inkluderer rødme, hævelse, og immun celleinfiltration 2,3. Derfor var vi meget opmærksomme at snit eller nogen form for sårdannelse på huden, brystvorten eller kirtlen for at indføre LPS kunneikke anvendes i vore metoder, da den fremgangsmåde sandsynligvis ville forvirre den read-out af inflammation. Vi har også ønsket en straight-forward metode, der ikke kræver specielt fremstillet håndtegnede pipetter eller anvendelse af mikromanipulatorer at holde disse specialiserede værktøjer på plads. Derfor besluttede vi at bruge et kommercielt tilgængeligt insulin sprøjte og at injicere midlet i den mammae kanal af et intakt nippel. Denne metode har været vellykket og tilladt os at studere betændelse i forbindelse med LPS-injektion uden yderligere virkninger overlejret med fremgangsmåden ifølge injektion. Desuden denne fremgangsmåde anvendes et NF-KB luciferase reporter transgen mus og bioluminescerende imaging-teknologi til visuelt og kvantitativt viser øget NF-KB signalering inden for LPS-injicerede kirtel 4.
Disse metoder er af interesse for forskere af mange discipliner, der ønsker at model sygdom i diegivende brystkirtel, som i sidste ende, at teknikkenbeskrevet her kan anvendes til injektion af en række stoffer, og er ikke begrænset til kun LPS.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Vanderbilt University Institutional Animal Care og Use Udvalg.
1. Fremstilling af transgene mus
- Hunmus, der var positive for NGL (N F-KB-G FP-L uciferase) reporter-transgen (beskrevet tidligere 1) anvendes til denne procedure. Når kvinder er mindst 6 uger gamle, parre dem med en FVB vildtype han. Harem avl kan anvendes (op til 4 hunner i et bur med en mandlig). (Bemærk: FVB-stamme mus blev anvendt til den foreliggende undersøgelse Mørkere stamme-mus, såsom C57BL6 kan også anvendes, men disse mus skal barberes før billeddannelse.).
- Starter til 15 dage efter parring, hunnerne regelmæssigt kontrollere for tegn på graviditet (store fremspringende omkreds). Hver kvinde skal adskilles gang gravid, og hannen fjernet fra avl bur, når den sidste kvinde bliver gravid.
- Se de adskilte hunner end noterer dato for fødslen, når et kuld vises. Et kuld mindst 6 hvalpe kræves for tilstrækkelig laktation. Otte dage efter fødslen af kuldet, fortsætte med protokollen (se figur 1 for en tidslinje skematisk).
2. Forberedelse til injektion
- Opløs E. coli LPS i PBS til en slutkoncentration på 0,1 ug / ul. 50 ul af denne opløsning, eller i alt 5 pg, blive injiceret i mælkekirtlen. Fremstille et andet rør i PBS alene skal anvendes til kontrol injektion.
- Set-up en dissekere omfang og isofluran anæstesi udstyr. En næse-keglen apparat bør fastgøres til det stadium, hvor dissektionsmikroskop hvor musen skal placeres. En god lyskilde, om hvorvidt fra anvendelsesområdet selv eller fra ekstra projektører også fremstilles.
- Når set-up er færdig, start isofluran maskine og luftgennemstrømning.
3. Intraductal Injektion af LPS
- Indlæse den korte nål med 50 gl af LPS-opløsningen. Udtage dette.
- Anesthetize musen, der skal injiceres ved først at anbringe hunnen i en isofluran fyldt kasse og derefter en gang vejrtrækning er aftaget, flytte hende ind på scenen og placere næsen i næse-keglen. Brug en tå knibe for at bekræfte musen er fuldt bedøvet. Overvåg musens vejrtrækning under hele proceduren og juster isofluran niveau i overensstemmelse hermed. Buret indeholder kuld af unger, at den kvindelige er blevet taget fra bør nøje afsat indtil dæmningen kan returneres efter proceduren.
- Anvende en lille dråbe af 70% ethanol for at gøre pelsen lå fladt og for at hjælpe med at visualisere nippel fastgjort til højre nr. 4 inguinal brystkirtel på musens nedre abdomen.
- Fokuser dissekering mulighed for en optimal visning af brystvorten. Omhyggeligt bruge et sæt fine tænger til yderligere trække ud sutten væk fra huden, men gør ikke punktere eller skade brystvorten på nogen måde. Dentang bør aldrig tæt spændes sammen ved at manipulere væv, men anvendes med et let hold, der kræver minimal belastning på brystvorten.
- Brug af tangen i venstre for hold forsigtigt brystvorten på plads. Langsomt bringe den forudindlæste sprøjte i synsfeltet med højre hånd. Sprøjten bør holdes så ingen repositionering skal ske med henblik på at injicere indholdet.
- Når først nålen er i betragtning, sigte omhyggeligt ved den lille duktalt åbning i midten af brystvorten, og sæt sprøjten.
- Uden repositionering hånden, injicere indholdet af sprøjten og fjern nålen fra brystvorten.
- Indlæse en anden sprøjte med 50 pi PBS for kontrollen injektion. Placer musen på scenen og for den bedste visning af venstre # 4 lyskebrok brystkirtel nippel på den anden side af musens underlivet. Gentag trin fra 3,4 til 3,7 ved hjælp af PBS-fyldte sprøjte.
- Når begge injektioner er komplEte, afbryde anæstesi og flytte musen til et opsving bur. Overvåg hunnen at sikre, at hun bliver mobil inden for 5 min. Tillad musen for at forblive i recovery bur i 1 time. Efter 1 time for inddrivelse, skal du placere den kvindelige tilbage i buret med hendes kuld hvalpe. Mus bør undersøges regelmæssigt for 6 timer efter injektion, før du fortsætter til billedbehandling. Det er vores erfaring, blev der ikke negative konsekvenser noteret i enten den kvindelige eller hvalpene i perioden mellem injektion og billeddannelse. Men hvis tegn på lidelse er observeret i den kvindelige (f.eks krum stilling, bide eller bevogtning af injektionsstedet, generel apati) eller hvalpene (ingen bevægelse, blålig hudfarve) forsøget bør ophøre.
4. Bioluminescent Imaging at Visualiser NF-KB Activity
- Når mus er blevet transporteret til imaging facilitet, begynder den billeddannende procedure ved at åbne softwaren og initialisering af maskinen. Tænd eroflurane maskine og luftstrøm, sikrer, at bedøvelse strømmer både kassen og den billeddannende kammeret.
- Placer musen under isofluran anæstesi i den klare anæstesi boksen. Når vejrtrækningen er aftaget, skal du bruge en tå knibe for at bekræfte musen er fuldt bedøvet. Derefter injiceres 100 pi af luciferin substrat i mus ved retro-orbital injektion 5 ved anvendelse af en steril sprøjte.
- Umiddelbart overføre musen til billedbehandling kammer og placere næsen under isofluran næse-kegle placeret der. Musen skal være liggende. Fastgør hver fod på scenen med tape.
- Input de relevante indstillinger til IVIS software til at tage både et hvidt lys fotografisk billede og et billede af den bioluminescerende aktivitet. Eksponeringen tid skal være 10 sek. Hente billedet.
- Når billederne er blevet erhvervet, skal du lade musen til at komme sig og derefter placere hende tilbage i buret med sine hvalpe og periodisk overvågning.
- Den fotografiske og selvlysendebilleder automatisk overlejret og vises på skærmen, som i figur 2. Analyser de erhvervede billederne ved at placere regionen af interesse eller "ROI" cirkler af samme størrelse over hver side af musens nedre abdomen (én over PBS-injicerede kirtel og én over LPS-injicerede kirtel). Indstil udlæsning til fotoner. En række skal vises angiver luminescens påvises i hver ROI (se Figur 2B). Brug dette nummer i statistiske analyser.
- For at vise den optimale billedkvalitet, yderligere justere tærsklen for det viste signal. Dette vil ikke ændre den samlede luminescens læse-out, men vil give dig mulighed for at fjerne baggrunden signal og visualisere forskellene mellem kontrol og LPS-behandlede kirtel. Nedsæt mængden af luminescens vist indtil PBS-injicerede kirtel er fri for baggrunden signal. Det bør forlade den forøgede signal i LPS-behandlede kirtel stadig viser sig i billedet, som det ses i figur 2.
- Additional analyse, herunder protein-og RNA-analyser, kan fuldføres med brystvæv indsamlet fra det kvindelige post mortem 6.
5. Repræsentative resultater
Til opnåelse fortolkelige resultater fra disse fremgangsmåder, skal LPS (eller PBS) kun infunderes i brystkirtlerne kanaler, forlader tilstødende væv uforstyrret. Injektion i det subkutane væv omkring brystvorten vil resultere i inflammation på grund af skade snarere end den simulerede infektion. Injektion af trypanblåt farvestof fortyndet i PBS er nyttig, når lære teknikken. Figur 3A viser en vellykket injiceret kirtel infuseret med 100 ul trypanblåt i PBS. Som vist, skal kun den duktale træet blive fyldt med den indsprøjtede opløsning, og der bør ikke være bolus på injektionsstedet. En "bolus" i denne sammenhæng er en ophobning af den injicerede væske ved brystvorten eller i vævet omkring brystvorten uden infusion i duktale træet. Dette er shselv i figur 3B. Bemærk venligst, at praksis injektioner er vist i figur 3 blev afsluttet i en kvindelig på dag 21 i laktationen. Under højden af laktationen (dag 8-10, det stadium, hvor LPS injiceres ved brug af den nuværende protokol), er mælk rigelige og det er vanskeligt at visualisere kanalerne og bestemmer, om injektionen er udført korrekt. Derfor senere tidspunkter i laktationen er bedre for praksis injektioner.
Succesrig injektion af LPS i brystkirtlerne kanaler medfører øget NF-KB-aktivitet i kirtlen. Det bør være klart af reporter-mus efter IVIS billeddannelse, og den LPS-injicerede kirtel bør have væsentligt højere luciferaseaktivitet (målt ved foton count) end PBS-injicerede kirtel, som vist i figur 2 (i gennemsnit, LPS-kirtel læser 200% af PBS styresignalet). En statistisk signifikant stigning i luminescens inden for de LPS-behandlede kirtler som compared til den kontralaterale kontrol blev opnået gennem færdiggørelsen af en gruppe på 4 mus 4. En ekstra undersøgelse har også udnyttet intraductal mammary injektion af enten E. coli eller LPS i NF-KB reporter transgene. Svarende til vores eget arbejde, disse forfattere oplevede en betydelig stigning i reporter aktivitet 6 timer efter E. coli injektion 2.
Bemærk venligst, på grund af konstitutiv NF-KB-aktivitet i hjernen og andre abdominale organer, lederne og abdomen vores reporter mus viser konsekvent et signal, når afbildes, selv ved baseline forud for enhver manipulation. Således bør dette signal ignoreres med hensyn til dette forsøg. En oplagt signal bør forblive inden for LPS-injicerede brystkirtel efter billedet udlæses justeres for at minimere baggrund luminescens i PBS kirtel. Figur 2 viser billeder med baggrunden reduceret.
Mislykket injektion af kirtlen vilsandsynligvis resultere i beskadigelse af niplen. Dette vil forårsage bemærkes, hud-level inflammation som vil være indlysende ved billeddannelse. Denne type sår signal vil være meget stærk og begrænset til brystvorten område, hvor skaden indtraf, ikke hidrører hele kirtlen, som ses efter en vellykket LPS injektion i kanalerne.
Figur 1. Skematisk af forretningsordenen.
Figur 2. Repræsentative resultater fra IVIS bioluminescerende billeddannelse. (A) Erhvervet billede med baggrund reduceret, afslører øget luciferaseaktivitet i LPS-injicerede kirtel. (B) Billede fra A med regionen af interesse kvantificeringer tilføjet. Klik her for at se større figur .
Figur 3 Practice injektion:.. Mælkekirtlen injiceret med farvestof via intraductal injektion For at afprøve nøjagtigheden af levering via brystvorten, blev en mus på dag 21 af laktationen injiceret med 100 pi af trypanblåt farvestof fortyndet i PBS. Efter aflivning blev kirtlen eksponeret for visualisering. (A) succesrig injektion og (B) bolus af farvestof på brystvorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her udnytter vi en transgen NF-KB reporter mus og en optimeret injektionsteknik til model mastitis, betændelse i brystvæv oftest forårsaget af bakteriel infektion. Det mest kritiske skridt i denne procedure er den intraductal injektion selv.
I praksis er det normalt klart, om intraductal injektion har været vellykket. Injektionen af midlerne (LPS eller PBS) skal føles fluid og der bør være lidt eller ingen modstand som sprøjten tømmes. Den mest almindelige faldgrube er beskadigelse af sutten fører til hindret passage i kirtlen. Dette kan visualiseres ved at kigge på brystvorten via dissektionsmikroskop. Beskadigelse kan undgås ved tilstrækkelig øvelse, delikatesse ved manipulering af brystvorten, og ved at sikre, at kun den mindste af nåle (31G eller højere) anvendes til at udføre fremgangsmåden. Desuden, hvis nålen ikke er placeret korrekt, eller hvis den glider mid-indsprøjtning, en build-Up af LPS eller PBS kan danne på injektionsstedet og væsken vil ikke gennemsyrer kanalerne. Hvis dette sker, kan du enten visuelt se ophobning af væske i huden omkring brystvorten, eller injektion vil ikke føle væske. Selv om denne faldgrube man ikke helt kan elimineres, kan hændelser undgås for det meste ved praksis og gennem anvendelse af de rigtige værktøjer.
Teknikken anvendes her til injektion var kritisk for dette særlige eksperiment. Nogle offentliggjorte fremgangsmåder til intraductal injektion i mælkekirtlen kræver skæring / fjernelse af brystvorten og / eller indsnit gennem huden 7,8. I dette tilfælde var det primære slutpunkt for undersøgelsen for at bestemme NF-KB relateret inflammation i kirtlen, eventuelle indsnit eller forstyrrelse af huden eller nippel, var uønskelig og ville inducere en inflammatorisk signal som følge af vævsbeskadigelse, der ville forvirre Den LPS-inducerede signal.
Derudover voresinjektion blev udført med et kommercielt tilgængeligt insulinsprøjte og uden anvendelse af en trukket mikropipette eller mikromanipulatorer, som i flere andre metoder til injektion, som ikke udnytter nippel fjernelse 9, 10. Vi mener, at dette var kun muligt, fordi den diegivende brystvorte er lidt forstørret og noget lettere at injicere end en ung, jomfru mus brystvorte. For at injicere jomfruelige mus, kan strengere værktøjer være påkrævet.
Det fremgår af figur 2, at hvis korrekt udført, injektion af LPS ind i kanalerne af muse brystkirtel forårsager lokaliseret inflammation som visualiseret ved en forøgelse af NF-KB luciferase reporter aktivitet. Andre har analyseret mere udførligt denne model af akut mastitis, enten E. coli eller LPS injektion i mælkekirtlen og efterfølgende analyse af vævet 2-3, 8, 10-14. Blandt mange fund, viser disse undersøgelser, at det inflammatoriske respons is moduleret af interaktioner med CD14, og at den resulterer i en neutrofil-indstrømning reguleret af mammale alveolære makrofager. Som foreslået i både vores tidligere offentliggjorte arbejde 4, såvel som af andre 2 kan denne model af mastitis yderligere bruges til at undersøge mekanismerne og terapeutiske relevante i mennesker, hvor så mange som 3-33% af ammende kvinder lider af denne smertefulde infektion (procentdel varierer baseret på undersøgelse metode) 15. Det kan også være et nyttigt forskning redskab for dem i mejeriindustrien, hvor mastitis er en bekostelig sygdom, der fører til betydelige tab i mælkeproduktion hvert år 16.
Endelig har de NGL transgene reporter mus, der anvendes her, og de tilsvarende fungerende HLL reporter mus 17 været anvendt i talrige undersøgelser for at kontrollere, kvantificere, og spore op eller nedregulering af NF-KB-aktivitet inden for en bred vifte af sygdomme og udviklingsmæssige modeller, herunder akut lungeskade, lungecancer, luftvejene forgrening morfogenese, insulinresistens, fedme og myokardieinfarkt 1, 17-21. Denne model giver et yderligere eksempel på anvendeligheden af disse reporter transgene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud CA113734 tildelt F Yull og Department of Veterans Affairs (TS Blackwell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
References
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. In vivo imaging of NF-κB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection. Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages. Veterinary Research. 41, 10 (2010).
- Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection. J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40, 155-160 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. (21), e2828 (2011).
- Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Research. 11, R66 (2009).
- Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model. Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).
- Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice. Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis. Veterinary Research. 41, 53 (2010).
- Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge. Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).
- Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis. Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).
- Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice. Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).
- Osterman, K. L., Rahm, V. A. Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome. Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).
- Sordillo, L. M., Streicher, K. L. Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).
- Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS. Chest. 116, 73S-74S (1999).
- Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).
- Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis. The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).
- Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice. Cell. 138, 961-975 (2009).
- Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart. The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).
