Summary
Beskrevet her er en teknikk hvor lipopolysakkarid injiseres i lakterende musen melkekjertlene via brystvorten for å simulere mastitt, en tilstand som vanligvis er forårsaket av bakteriell infeksjon. Lipopolysakkarid injeksjon resulterer i økt kjernefysiske faktor kappa B (NF-κB) signal, visualisert gjennom bioluminescent avbildning av en NF-κB luciferase reporter mus.
Abstract
Dyremodeller av menneskelig sykdom er nødvendig for å strengt studere stadier av sykdomsutvikling og tilhørende mekanismer, og til slutt, som pre-kliniske modeller å teste intervensjoner. I disse metodene, beskriver vi en teknikk der lipopolysakkarid (LPS) er injisert i lakterende musen melkekjertlene via brystvorten, effektivt modellering mastitt, eller inflammasjon, av kjertelen. Dette simulerte infeksjon resulterer i økt kjernefysiske faktor kappa B (NF-κB) signal, som visualiseres gjennom bioluminescent avbildning av en NF-κB luciferase reporter mus 1.
Vårt endelige mål å utvikle disse metodene var å studere betennelsen assosiert med mastitt i lakterende kjertel, som ofte inkluderer rødhet, hevelse og immunceller infiltrasjon 2,3. Derfor var vi klar over at snittet eller noen form for å såre av huden, brystvorten, eller kjertel for å innføre LPS kunneikke benyttes i våre metoder siden tilnærmingen vil trolig konfundere Utlesing av betennelse. Vi har også ønsket en rett-frem metode som ikke krever spesielt laget håndtegnede pipetter eller bruk av mikromanipulator å holde disse spesialiserte verktøy på plass. Dermed bestemmes vi å bruke en kommersielt tilgjengelig insulin sprøyten og for å injisere den middel inn mammary kanalen på en intakt brystvorte. Denne metoden var vellykket og tillater oss å studere betennelsen assosiert med LPS injeksjon uten noen ekstra effekter kledde av prosessen med injeksjon. I tillegg har denne metoden også benyttet en NF-κB luciferase reporter transgene mus og bioluminescent tenkelig teknologi for å visuelt og kvantitativt vise økt NF-κB signalering innenfor LPS-injisert kjertel 4.
Disse metodene er av interesse for forskere fra mange disipliner som ønsker å modellere sykdom i ammende melkekjertlene, som til syvende og sist, teknikkenbeskrevet her kunne benyttes for injeksjon av en rekke stoffer, og er ikke begrenset til bare LPS.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av Vanderbilt University Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Forbereder transgene mus
- Hunnmus, positive for NGL (N F-κB-G FP-L uciferase) reporter transgene (beskrevet tidligere 1) brukes til denne prosedyren. Når kvinner er minst 6 uker gamle, pare dem med en FVB villtype hann. Harem avl kan brukes (opp til 4 kvinner i et bur med en hann). (Merk: FVB belastningsmålere mus ble brukt for denne studien Mørkere belastningsmålere mus eksempel C57Bl6 kan også brukes, men disse musene må barbert før avbildning.).
- Starter på 15 dager etter parring, sjekk hunnene regelmessig for tegn på graviditet (store utstående omkrets). Hver hunn må skilles gang gravid og hannen fjernet fra avl buret når den siste kvinnelige blir gravid.
- Se separerte kvinner end oppmerksom fødselsdato når et kull vises. En kull av minst 6 valper er nødvendig for adekvat laktasjon. Åtte dager etter fødselen av kull, fortsette med protokollen (se figur 1 for en tidslinje skjematisk).
2. Forberedelse til Injection
- Oppløse E. coli LPS i PBS til en endelig konsentrasjon på 0,1 ug / ul. 50 ul av denne løsningen, eller totalt 5 ug, vil bli injisert i melkekjertlene. Forbered et andre rør av PBS alene som skal brukes til kontroll injeksjon.
- Sette opp en dissekere omfang og isofluran anestesi utstyr. En nese-membran apparater skal være festet til scenen av dissekere omfang der musen skal plasseres. En god lyskilde bør enten fra omfanget selv eller fra ekstra spoter også fremstilles.
- Når set-up er fullført, starter du isofluran maskin og luftstrøm.
3. Intraductal Injeksjon av LPS
- Laste kort kanyle sprøyten med 50 pl av den LPS-løsning. Sett denne til side.
- Anesthetize musen som skal injiseres ved først å plassere den kvinnelige i en isofluran fylt boksen og deretter en gang puste er redusert, flytte henne opp på scenen og plassere henne nesen i nesen-membran. Bruk en tå klype for å bekrefte musen er fullt bedøvet. Overvåke musen pust gjennom hele prosedyren og justere isofluran nivå tilsvarende. Buret inneholder kull med unger som den kvinnelige har blitt tatt fra bør nøye satt til side til demningen kan returneres etter inngrepet.
- Bruk en liten dråpe 70% etanol for å gjøre pelsen lå flatt og å visualisere brystvorten festet på høyre # 4 inguinal melkekjertlene på musens nedre del av magen.
- Fokuser dissecting muligheter for en optimal visning av brystvorten. Nøye bruke et sett av fine pinsett for å ytterligere trekke ut brystvorten vekk fra huden, men gjør ikke punkteres eller skade brystvorten på noen måte. Dentang skal aldri tett klemmes sammen når manipulere vev, men brukes med en lett hold som krever minimal mengde av stress på nippelen.
- Bruk pinsett i venstre hånd til å forsiktig holde brystvorten på plass. Sakte bringe forhåndslastet sprøyten inn i synsfeltet ved hjelp av høyre hånd. Sprøyten bør holdes slik at det ikke reposisjonering må skje for å injisere innholdet.
- Når sprøyten er i sikte, sikte nøye på den lille duktalt åpningen innen midten av brystvorten, og sett i sprøyten.
- Uten reposisjonere hånden, injisere innholdet av sprøyten og fjern nålen fra nippelen.
- Laste en andre sprøyte med 50 ul PBS for kontrollen injeksjon. Reposisjonere musen på scenen og for den beste utsikten over den venstre nr. 4 inguinal melkekjertlene nippel på den andre siden av musens nedre del av magen. Gjenta trinn 03.04 til 03.07 ved hjelp av PBS-lastet sprøyte.
- Når begge injeksjoner er komplEte, avbryte anestesi og flytte musen til en utvinning bur. Overvåke den kvinnelige å sørge for at hun blir mobil innen 5 min. Lar musen forbli i utvinningsgrad buret i 1 time. Etter 1 time for utvinning, plasserer den kvinnelige tilbake i buret med henne kull unger. Mus bør periodisk monitoreres for 6 hr etter injeksjonen før du fortsetter til bildebehandling. I vår erfaring, ingen uønskede konsekvenser bemerket i enten kvinnelig eller valpene i perioden mellom injeksjon og bildebehandling. Men hvis tegn på stress er observert i den kvinnelige (f.eks krum holdning, biting eller vokter av injeksjonsstedet, generell slapphet) eller valpene (ingen bevegelse, blålig farge på huden) forsøket bør seponeres.
4. Bioluminescent Imaging å visualisere NF-κB aktivitet
- Når mus har blitt fraktet til bildebehandling anlegget, begynner imaging prosedyre ved å åpne programvaren og initialiserer maskinen. Slå på eroflurane maskin og luftstrøm, slik at bedøvelsen strømmer til både boks og bildebehandling kammeret.
- Plasser mus under isofluran anestesi i den klare anestesi boksen. Når pusting har avtatt, bruk en tå klype for å bekrefte musen er fullt bedøvet. Deretter injiserer 100fil luciferin substrat i musen ved retro-orbital injeksjon 5 ved hjelp av en steril sprøyte.
- Umiddelbart overføre musen til bildebehandling kammer og plassere henne nesen under isofluran nese-membran ligger der. Musen bør være liggende. Fest hver fot på scenen med tape.
- Input de riktige innstillingene til IVIS programvare for å ta både et hvitt lys fotografisk bilde og et bilde av bioluminescent aktivitet. Eksponeringstiden skal være 10 sek. Hente bildet.
- Når bildene er kjøpt, lar musen til å gjenopprette og deretter plassere henne tilbake i buret med valpene og overvåke med jevne mellomrom.
- Den fotografiske og selvlysendebilder automatisk kledde og vises på skjermen, som i figur 2. Analysere de innsamlede bilder ved å plassere region av interesse eller "ROI" sirkler av lik størrelse over hver side av musens nedre abdomen (en over PBS injisert kjertel og en over LPS-injisert kjertel). Still lese-out til fotoner. En rekke bør vises indikerer luminescens detektert innenfor hver ROI (se figur 2B). Bruk dette nummeret i statistisk analyse.
- For å vise det optimale bildet, videre justere terskelen signal vises. Dette vil ikke endre den totale luminescence lese-out, men vil tillate deg å fjerne bakgrunn signal og visualisere forskjellene mellom kontroll og LPS-behandlet kjertel. Minske luminescens vist til PBS-injisert kjertel er fri for bakgrunn signal. Dette bør forlate den økte signal i LPS-behandlede kjertel fortsatt tydelige i bildet, som vist på fig 2.
- Additional analyse, inkludert protein og RNA-analyser, kan fullføres med mammary vev hentet fra kvinnelige post-mortem 6.
5. Representant Resultater
For å oppnå interpretable resultater fra disse metodene må LPS (eller PBS) infunderes bare inn mammary kanaler, forlater tilstøtende vev uforstyrret. Injeksjon i det subkutane vevet rundt brystvorten vil resultere i inflammasjon på grunn av skade snarere enn den simulerte infeksjon. Injeksjon av trypan blått fargestoff fortynnet i PBS er nyttig når man lærer teknikken. Figur 3A viser en vellykket injisert kjertel infused med 100 ul trypan blå i PBS. Som vist, bør kun duktalt treet fylles med den injiserte løsningen, og det bør ikke være noen bolus på injeksjonsstedet. En "bolus" i denne sammenheng er en opphopning av den injiserte væske på brystvorten eller i vevet som omgir nippelen uten infusjon i duktale treet. Dette er shegne i Figur 3b. Vær oppmerksom på at praksis injeksjoner vist i figur 3 ble avsluttet i en kvinne på dag 21 i laktasjonen. Under høyden av amming (dag 8-10, scenen der LPS injiseres med den gjeldende protokollen), er melk rikelig og det er vanskelig å visualisere de kanaler og avgjøre om injeksjonen er utført riktig. Derfor senere tidspunkt i laktasjonen er bedre for praksis injeksjoner.
Vellykket injeksjon av LPS i mammary kanaler gir økt NF-κB aktivitet i kjertelen. Dette bør være tydelig i reporteren mus upon IVIS bildebehandling, og LPS-injiserte kjertel bør ha vesentlig høyere luciferase aktivitet (målt ved foton teller) enn den PBS-injisert kjertel, som vist i figur 2 (i gjennomsnitt, leser LPS kjertel 200% av den PBS styresignal). En statistisk signifikant økning i luminescens innenfor LPS-behandlede kjertler som kompared til kontralaterale kontroll ble oppnådd om fullføringen av en gruppe av 4 mus 4. En annen studie har også brukt intraductal mammary injeksjon av enten E. coli eller LPS i NF-κB reporter transgenics. I likhet med vårt eget arbeid, så disse forfatterne en betydelig økning i reporter aktivitet 6 timer etter E. coli injeksjon 2.
Vennligst merk at på grunn konstituerende NF-κB aktivitet i hjernen og andre abdominale organer, hoder og mager av våre reporter mus viser gjennomgående et signal når avbildes, selv ved baseline før eventuell manipulering. Derfor bør dette signalet ignoreres med hensyn til dette eksperimentet. Et klart signal bør forbli i LPS-injisert melkekjertlene etter bildet utlesning justeres for å minimere bakgrunnen luminescens i PBS kjertel. Figur 2 viser bilder med bakgrunnen reduseres.
Mislykket injeksjon av kjertelen vilmest sannsynlig resultere i skader på brystvorten. Dette vil føre til spisse, hud-nivå betennelse som vil være tydelig ved avbildning. Denne typen wounding signal vil være meget sterk og begrenset til brystvorten området hvor skaden oppsto, ikke emanating hele kjertel, som sett etter en vellykket LPS injeksjon inn i kanalene.
Figur 1. Skjematisk prosedyre.
Figur 2. Representative resultater fra IVIS bioluminescent imaging. (A) Ervervet bilde med bakgrunn redusert, avslører økt luciferase aktivitet i LPS-injisert kjertel. (B) Bilde fra A med region av interesse quantifications lagt til. Klikk her for å se større figur .
Figur 3 Practice injeksjon:.. Melkekjertlene injisert med fargestoff via intraductal injeksjon for å teste nøyaktigheten av levering via brystvorten, ble en mus på dag 21 i laktasjonen injisert med 100 ul trypan blått fargestoff fortynnet i PBS. Etter ofring ble kjertelen eksponert for visualisering. (A) vellykket injeksjon og (B) bolus av fargestoff på brystvorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi utnytte en transgen NF-κB reporter mus og en optimalisert injeksjonsteknikk å modellere mastitt, betennelse i brystvevet oftest forårsaket av bakteriell infeksjon. Den mest kritiske trinnet i denne prosedyren er intraductal injeksjon selv.
I praksis er det vanligvis tydelig om intraductal injeksjon har vært vellykket. Injeksjon av agentene (LPS eller PBS) skal føle fluid og det bør være liten eller ingen motstand når sprøyten er tømt. Den vanligste fallgruve er skader på brystvorten som fører til hindret passasje inn i kjertelen. Dette kan visualiseres ved å se på nippelen gjennom dissekerende omfang. Skade kan unngås ved tilstrekkelig praksis delikatesse når manipulere brystvorten, og ved å sikre at bare den minste av nåler (31G eller høyere) er brukt til å utføre prosedyren. I tillegg, hvis nålen ikke er riktig plassert, eller om det glipper mid-injeksjon, en byggeOpp av LPS eller PBS kan danne på injeksjonsstedet og væsken vil ikke gjennomsyre kanalene. Hvis dette skjer, kan du enten visuelt se opphopning av væske i huden rundt brystvorten, eller injeksjon vil ikke føle væske. Selv denne fallgruven ikke kan helt bli eliminert, kan forekomster unngås for det meste av praksis og gjennom bruk av riktig verktøy.
Teknikken som brukes her til injeksjon var avgjørende for denne spesielt eksperiment. Noen publiserte metoder for intraductal injeksjon i melkekjertlene krever skjæring / fjerning av nippelen og / eller innsnitt gjennom huden 7,8. I dette tilfellet, som det primære endepunktet av studien var å bestemme NF-κB relatert betennelse i kjertelen, var noen snitt eller perturbasjon av hud eller nippel uønsket og vil indusere en inflammatorisk signal grunnet vevsskade som ville forvirre LPS-indusert signal.
I tillegg, vårinjeksjon ble gjennomført med et kommersielt tilgjengelig insulin sprøyte og uten bruk av en trukket mikropipette eller mikromanipulator, som i flere andre metoder for injeksjon som ikke benytter brystvorte fjerning 9, 10. Vi tror dette var bare mulig fordi ammende brystvorten er litt forstørret og noe lettere å injisere enn en ung, jomfru mus brystvorte. Å injisere jomfruelige mus kan strengere verktøy være nødvendig.
Det er klart fra figur 2 at hvis korrekt utført, fører injeksjon av LPS i kanalene av musen melkekjertlene lokalisert betennelse som visualisert ved en økning i NF-κB luciferase reporter aktivitet. Andre har analysert mer omfattende denne modellen av akutt mastitt, enten via E. coli eller LPS injeksjon i melkekjertlene og påfølgende analyse av vev 2-3, 8, 10-14. Blant mange funn, disse studiene viser at inflammatorisk respons ifiltre modulert av interaksjoner med CD14, og at det resulterer i en nøytrofil innstrømning regulert av mammary alveolære makrofager. Som antydet både i vår tidligere publiserte arbeider 4, så vel som for andre 2.5 denne modellen av mastitt videre brukes til å studere mekanismene og terapeutika relevante for mennesker, hvor så mange som 3-33% av ammende kvinner lider av dette smertefull infeksjon (Andelen varierer basert på studier metodikk) 15. Det kan også være en nyttig forskning verktøy for de i meieriindustrien, der mastitt er en kostbar sykdom som fører til betydelige tap i melkeproduksjonen hvert år 16.
Endelig har de NGL transgene reporter mus som brukes her og tilsvarende fungerende HLL reporter mus 17 blitt brukt i en rekke studier for å bekrefte, kvantifisere og spore opp eller ned regulering av NF-κB aktivitet innen en rekke sykdommer og utviklingsforstyrrelser modeller, inkludert akutt lungeskade, lungekreft, luftvei forgrening morphogenesis, insulinresistens, fedme, og myokardial 1 infarkt, 17-21. Denne modellen gir et ytterligere eksempel på nytten av slike rapportørgrupper transgenics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH stipend CA113734 tildelt F Yull og Department of Veterans Affairs (TS Blackwell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
References
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. In vivo imaging of NF-κB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection. Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages. Veterinary Research. 41, 10 (2010).
- Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection. J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40, 155-160 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. (21), e2828 (2011).
- Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Research. 11, R66 (2009).
- Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model. Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).
- Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice. Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis. Veterinary Research. 41, 53 (2010).
- Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge. Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).
- Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis. Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).
- Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice. Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).
- Osterman, K. L., Rahm, V. A. Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome. Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).
- Sordillo, L. M., Streicher, K. L. Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).
- Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS. Chest. 116, 73S-74S (1999).
- Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).
- Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis. The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).
- Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice. Cell. 138, 961-975 (2009).
- Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart. The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).
