Summary
Hier beschrieben ist ein Verfahren, bei dem Lipopolysaccharid in der laktierenden Milchdrüse der Maus über den Nippel, um Mastitis zu simulieren, ein Zustand, üblicherweise durch bakterielle Infektion verursacht wird injiziert. Lipopolysaccharide Injektion führt zu einer erhöhten nuclear factor kappa B (NF-kappaB) Signaltechnik, visualisiert durch Biolumineszenz Bildgebung eines NF-kappaB Luciferase-Reporter-Maus.
Abstract
Tiermodelle von Krankheiten sind, um konsequent zu studieren Stadien der Krankheitsprogression und die damit verbundenen Mechanismen, und schließlich, als prä-klinischen Modellen Interventionen zu testen notwendig. Bei diesen Verfahren beschreiben wir eine Technik, bei der Lipopolysaccharid (LPS) in der laktierenden Milchdrüse der Maus über den Nippel, effektiv Mastitis Modellierung oder Entzündung, der Drüse eingespritzt wird. Diese simulierte Infektion führt zu einer erhöhten nuclear factor kappa B (NF-kappaB) Signalisierung, wie visualisiert durch Biolumineszenz Bildgebung eines NF-kappaB Luciferase-Reporter Maus 1.
Unser oberstes Ziel bei der Entwicklung dieser Methoden war, um die Entzündung mit Mastitis in der laktierenden Drüse, die oft auch Rötungen, Schwellungen und Immunzellen Infiltration 2,3 assoziiert zu studieren. Daher konnten wir sehr bewusst, dass Einschnitt oder jede Art von verwundeten der Haut, den Nippel oder die Drüse, um die LPS konnte einzuführennicht in unserem Verfahren verwendet werden, da der Ansatz eher verwirren würden die Ausleseschaltung von Entzündungen. Wir wollten eine straight-forward-Methode, die nicht verlangen, speziell angefertigten handgezeichneten Pipetten oder den Einsatz von Mikromanipulatoren diese spezielle Werkzeuge in Position zu halten. Somit haben wir festgestellt, einen handelsüblichen Insulin-Spritze zu verwenden und die Mittel in den Kanal mammary eines intakten Nippel injizieren. Diese Methode war erfolgreich und erlaubte uns, die Entzündung mit LPS-Injektion verbundenen ohne zusätzliche Effekte durch den Prozess der Injektion überlagert studieren. Zusätzlich hat dieses Verfahren auch eine NF-kappaB-Luciferase Reporter transgene Maus und biolumineszierende Bildgebungstechnologie verwendet werden, um visuell anzuzeigen und quantitativ erhöht NF-KB Signalisierung innerhalb des LPS-injizierten Verschraubung 4.
Diese Methoden sind von Interesse für Wissenschaftler aus vielen Disziplinen, die wollen Modell Krankheit innerhalb der laktierenden Brustdrüse, wie letztlich die Technikhier beschriebenen könnten zur Injektion einer Reihe von Stoffen genutzt werden, und ist nicht nur auf LPS begrenzt.
Protocol
Alle Tierversuche wurden von der Vanderbilt University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.
Ein. Herstellung transgener Mäuse
- Weibliche Mäuse, positiv für die NGL (N F-KB-G FP-L uciferase) Reporter-Transgen (zuvor beschriebene 1) sind für dieses Verfahren verwendet. Wenn Weibchen mindestens 6 Wochen alt sind, paaren sie mit einem FVB Wildtyp männlich. Harem Zucht verwendet werden (bis zu 4 Weibchen in einem Käfig mit 1 Mann) werden. (Achtung: FVB Stamm-Mäuse wurden für die vorliegende Studie verwendet Dunkler Stamm-Mäuse wie C57Bl6 können ebenfalls verwendet werden, aber diese Mäuse müssen vor der Bebilderung rasiert werden.).
- Ab 15 Tage post-Paarung, überprüfen Sie die Weibchen regelmäßig auf Anzeichen einer Schwangerschaft (große, hervorstehende Umfang). Jede Frau muss getrennt einmal schwanger werden und das Männchen aus der Zucht Käfig entfernt werden, sobald das letzte Weibchen schwanger wird.
- Sehen Sie sich die getrennten Weibchen eind beachten Sie das Datum der Geburt, wenn ein Wurf erscheint. Ein Wurf von mindestens 6 Welpen ist für eine angemessene Stillzeit erforderlich. Acht Tage nach der Geburt des Wurfes, mit dem Protokoll (siehe Abbildung 1 für eine Zeitachse schematisch) fortzufahren.
2. Vorbereitung zur Injektion
- Lösen Sie die E. coli LPS in PBS auf eine Endkonzentration von 0,1 ug / ul. 50 ul dieser Lösung oder insgesamt 5 ug, wird in die Brustdrüse injiziert werden. Vorbereiten einer zweiten Röhre von PBS allein für die Steuerung Injektion verwendet werden.
- Set-up ein Binokular und Isofluran Anästhesiegeräten. Ein Nasenkegel Vorrichtung sollte der Stufe des Binokular wo die Maus gestellt werden gesichert werden. Eine gute Lichtquelle sollte, ob aus dem Anwendungsbereich selbst oder von zusätzlichen Scheinwerfern ebenfalls hergestellt werden.
- Sobald das Set-up abgeschlossen ist, starten Sie die Isofluran-Maschine und Luftströmung.
3. Intraduktalen Injektion von LPS
- Legen Sie die kurze Nadel Spritze mit 50 ul der LPS-Lösung. Setzen Sie diese beiseite.
- Anesthetize der Maus, indem zuerst die Weibchen in einer Isofluran gefüllten Kasten und dann noch einmal Atmung verlangsamt injiziert werden, verschieben sie auf die Bühne und platzieren ihre Nase in der Nase-Membran. Verwenden Sie einen Zeh Prise zu bestätigen, dass die Maus ist vollständig betäubt. Überwachen der Maus die Atmung während des gesamten Verfahrens und stellen Sie die Isofluran entsprechend an. Der Käfig mit dem Wurf von Welpen, dass die Weibchen aus getroffen wurde sorgfältig eingestellt werden beiseite, bis der Damm nach der Prozedur zurückgegeben werden können.
- Verwenden Sie einen kleinen Tropfen von 70% Ethanol, um das Fell flach und zu visualisieren die Brustwarze an der rechten # 4 inguinal Milchdrüse auf die Maus Unterbauch.
- Fokussieren Sie das Sezieren Spielraum für eine optimale Sicht auf die Brustwarze. Vorsichtig verwenden eine Reihe von feinen Pinzette weiter ziehen die Brustwarze von der Haut weg, aber nicht gewaltsam öffnen oder zu verletzen die Brustwarze in keiner Weise. DieZange sollte niemals straff gespannt werden gemeinsam beim Manipulieren des Gewebes, sondern verwendet einen leichten Halt, die die minimale Menge von Stress erfordert auf der Brustwarze.
- Verwenden Sie die Zange in der linken Hand sanft halten die Brustwarze in Kraft. Langsam bringen die vorinstallierte Spritze in das Sichtfeld mit der rechten Hand. Die Spritze ist so gehalten, daß keine Neupositionierung zu treten, um den Inhalt zu injizieren aufweist.
- Sobald die Spritze ist in Sicht, sorgfältig zielen auf die kleinen duktalen Öffnung im Zentrum der Brustwarze, und legen Sie die Spritze.
- Ohne Neupositionierung der Hand, spritzen den Inhalt der Spritze und entfernen Sie die Nadel aus der Brustwarze.
- Legen Sie eine zweite Spritze mit 50 ul PBS zur Kontrolle Injektion. Positionieren Sie die Maus auf der Bühne und für die beste Ansicht der linken # 4 inguinal Brustdrüse Nippel auf der anderen Seite der Maus Unterbauch. Wiederholen Sie die Schritte von 3,4 bis 3,7 mit der PBS-geladenen Spritze.
- Sobald beide Injektionen sind komplete, einzustellen Anästhesie und bewegen Sie die Maus auf eine Erholung Käfig. Überwachen Sie den weiblichen um sicherzustellen, dass sie mobilen innerhalb von 5 min wird. Lassen Sie die Maus, um bei der Verwertung Käfig für 1 Stunde bleiben. Nach 1 Stunde der Erholung, legen Sie die Frauen zurück in den Käfig mit ihrem Wurf von Welpen. Mäuse sollten in regelmäßigen Abständen für 6 Stunden nach der Injektion überwacht werden, bevor die Bildgebung. In unserer Erfahrung, wurden keine nachteiligen Folgen in beiden die weibliche oder die Welpen in der Zeit zwischen Injektion und Bildgebung festgestellt. Allerdings, wenn Anzeichen von Leiden in der weiblichen eingehalten werden (z. B. gekrümmte Haltung, Beißen oder Bewachung der Injektionsstelle, allgemeine Lethargie) oder den Welpen (keine Bewegung, bläuliche Farbe der Haut) sollte das Experiment abgebrochen werden.
4. Bioluminescent Imaging zu visualisieren NF-kappaB Aktivität
- Sobald Mäusen haben die Bildgebung Anlage transportiert wurde, beginnen die bildgebenden Verfahren, indem Sie die Software und die Initialisierung der Maschine. Schalten Sie den istoflurane Maschine und Luftstrom, so dass die Narkose wird sowohl an der Box und der Abbildungskammer fließt.
- Legen Sie die Maus unter Isofluran-Narkose in der klaren Anästhesie-Box. Sobald Atmung verlangsamt hat, verwenden Sie einen Zeh Prise zu bestätigen, dass die Maus ist vollständig betäubt. Dann injizieren 100 ul Luciferinsubstrat in der Maus durch retro-orbitale Einspritzung 5 mit einer sterilen Spritze.
- Sofortüberweisung die Maus an die Bildgebung Kammer und legen ihre Nase unter der Isofluran Nasenkegel dort angesiedelt. Die Maus sollte in Rückenlage. Sichern Sie jeden Fuß auf die Bühne mit Klebeband.
- Eingang die entsprechenden Einstellungen der Software, um sowohl IVIS ein weißes Licht fotografischen Bild und ein Bild der biolumineszenten Aktivität. Die Belichtungszeit sollte 10 sec sein. Erwerben Sie das Bild.
- Nachdem die Bilder erworben wurden, ermöglichen die Maus zu erholen und dann legen Sie sie zurück in den Käfig mit ihren Welpen und überwachen regelmäßig.
- Die fotografische und lumineszierendeBilder werden automatisch überlagert und angezeigt auf dem Bildschirm, wie in 2. Analysieren der erfassten Bilder, indem Region von Interesse oder "ROI" Kreisen gleicher Größe über jede Seite der Mäuse Unterleib (eine über das PBS-injiziert Drüse und eine über der LPS-Injektion Drüse). Stellen Sie das Auslesen Photonen. Eine Reihe sollte angezeigt, die den Lumineszenz innerhalb jeder ROI nachgewiesen (siehe Abbildung 2B). Verwenden Sie diese Nummer in der statistischen Analyse.
- Um die optimale Bild anzuzeigen, weiter anpassen die Schwelle von Signal angezeigt. Dies ändert nicht die gesamte Lumineszenz Auslesen, sondern ermöglicht es Ihnen, Hintergrund-Signal zu entfernen und zu visualisieren die Unterschiede zwischen der Kontroll-und LPS-behandelten Drüse. Verringern der Menge der Lumineszenz angezeigt, bis der PBS-injiziert Drüse frei von Hintergrund-Signal ist. Dies sollte nun die erhöhte Signal in der LPS-behandelten Verschraubung noch erkennbar in dem Bild, wie in 2 gesehen.
- Additional Analyse, einschließlich Protein-und RNA-Assays, mit Brustgewebe aus dem weiblichen post-mortem 6 gesammelt abgeschlossen sein.
5. Repräsentative Ergebnisse
Auf interpretierbare Ergebnisse dieser Methoden erhalten, muss LPS (oder PBS) nur in die Milchgänge infundiert werden, so dass das angrenzende Gewebe ungestört. Injektion in das subkutane Gewebe um die Brustwarze wird bei Entzündungen aufgrund einer Verletzung statt der simulierten Infektion führen. Injektion von Trypanblau-Farbstoff in PBS verdünnt ist hilfreich, wenn das Erlernen der Technik. 3A zeigt einen erfolgreich injiziert Verschraubung mit 100 ul Trypanblau in PBS infundiert. Wie gezeigt, sollte nur der duktalen Baum mit der injizierten Lösung gefüllt werden, und es sollte keine Bolus sein an der Injektionsstelle. A "Bolus" in diesem Zusammenhang ist ein Aufbau der injizierten Flüssigkeit an der Brustwarze oder in dem Gewebe um die Brustwarze ohne Infusion in den duktalen Baum. Dies ist sheigenen in 3B. Bitte beachten Sie, dass die Praxis Injektionen in 3 gezeigt in einem weiblichen wurden am Tag 21 der Laktation abgeschlossen. Auf dem Höhepunkt der Stillzeit (Tag 8-10, in welchem Stadium LPS injiziert unter Verwendung der aktuellen Protokoll) ist Milch reichlich vorhanden und es ist schwierig, die Kanäle zu visualisieren und zu bestimmen, ob die Injektion korrekt beendet wurde. Daher sind späteren Zeitpunkten in der Laktation besser für die Praxis Injektionen.
Erfolgreiche Injektion von LPS in die Milchgänge führt zu einer erhöhten NF-kappaB Aktivität innerhalb der Drüse. Dies sollte in der Reportersonde Maus auf IVIS Bildgebung ersichtlich, und der LPS-Injektion Drüse sollte wesentlich höhere Luciferaseaktivität (gemessen durch Photonenzählung) als der PBS-injizierten Drüse haben, wie in 2 gezeigt (im Durchschnitt, liest der LPS Drüse 200% des PBS-Steuerungs-Signal). Ein statistisch signifikanter Anstieg der Lumineszenz innerhalb der LPS-behandelten Drüsen Layoutared zur kontralateralen Kontrolle wurde zwar der Fertigstellung einer Gruppe von 4 Mäusen 4 erreicht. Eine weitere Studie hat auch intraduktalen Mamma Injektion von E. genutzt coli oder LPS in NF-kappaB-Reporter transgenics. Ähnlich wie bei unserer eigenen Arbeit, sah diese Autoren eine signifikante Erhöhung der Reporter-Aktivität 6 Stunden nach E. coli-Injektion 2.
Bitte beachten Sie, aufgrund konstitutive NF-KB-Aktivität im Gehirn und anderen abdominellen Organen, die Köpfe und Bäuche unserer Reportermäuse zeigen durchwegs ein Signal, wenn abgebildet, auch an der Basislinie vor jeglicher Manipulation. Somit sollte dieses Signal im Hinblick auf diesem Experiment ignoriert. Eine offensichtliche Signal sollte innerhalb der LPS-Injektion Brustdrüse, nachdem das Bild ausgelesen wird eingestellt, um Hintergrundlumineszenz im PBS Drüse minimieren bleiben. 2 zeigt Bilder mit der Hintergrund vermindert.
Erfolglose Injektion der Drüse wirdhöchstwahrscheinlich zu Schäden an der Brustwarze. Dies führt dazu, spitz, Haut-Level-Entzündung, die offensichtlich sein wird bei der Bildgebung. Diese Art der Verwundung Signal wird sehr stark sein und beschränkt sich auf die Brustwarze, wo der Schaden eingetreten ist, nicht ausgehen in der Drüse, als nach einem erfolgreichen LPS-Injektion in die Kanäle zu sehen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Vorgehensweise.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus IVIS biolumineszierenden Bildgebung. (A) aufgenommenen Bildes mit Hintergrund verringert und enthüllt erhöhte Luciferaseaktivität in der LPS-injizierten Drüse. (B) Bild von A mit region of interest Quantifizierungen hinzugefügt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3 Praxis Injektion:.. Brustdrüse mit Farbstoff über intraduktalen eingespritzt Um die Genauigkeit der Zustellung über den Nippel zu testen, eine Maus am Tag 21 der Laktation wurde mit 100 ul Trypanblau-Farbstoff injiziert, verdünnt in PBS. Nach Opfers, wurde die Drüse zur Visualisierung ausgesetzt. (A) Injektion erfolgreich und (B) Farbstoff-Bolus an der Brustwarze.
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Discussion
Hier eine transgene NF-KB-Reporter Maus und ein optimiertes Modell zu Injektionstechnik Mastitis nutzen, Entzündung des Brustgewebes am häufigsten durch bakterielle Infektion verursacht. Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist die intraduktalen Injektion selbst.
In der Praxis ist es in der Regel zeigen, ob der intraduktalen Injektion erfolgreich war. Die Injektion der Substanzen (LPS oder PBS) sollen sich Fluid und es sollte wenig bis keinen Widerstand als die Spritze geleert wird. Die häufigste Fallstrick ist Beschädigungen des Nippels führt zu Freier Durchgang in der Drüse. Dies kann visualisiert werden, indem man die Nippel durch das Binokular. Schaden kann durch eine ausreichende praktische Erfahrung, Delikatesse, wenn die Manipulation der Brustwarze, und indem sichergestellt wird, dass nur die kleinste der Nadeln (31G oder höher) wird verwendet, um das Verfahren durchzuführen vermieden werden. Darüber hinaus, wenn die Nadel nicht korrekt positioniert ist, oder wenn es rutscht mittleres Injektion, ein Build-Up von LPS oder PBS können an der Injektionsstelle zu bilden, und die Flüssigkeit nicht durchdringen die Kanäle. Wenn dies geschieht, können Sie entweder visuell sehen die Ansammlung von Flüssigkeit in der Haut um die Brustwarze oder die Injektion nicht das Gefühl Flüssigkeit. Obwohl diese Gefahr nicht vollständig eliminiert werden, können Fälle zum größten Teil durch die Praxis und durch die Verwendung der entsprechenden Werkzeuge vermieden werden.
Die Technik hier für Injektion war entscheidend für diesen besonderen Experiment. Einige publizierten Methoden für intraduktalen Injektion in die Brustdrüse erfordern Schneid / Entfernung der Brustwarze und / oder Schnitt durch die Haut 7,8. In diesem Fall, da der primäre Endpunkt der Studie war es, NF-KB Entzündungen in Verbindung innerhalb der Stopfbüchse zu bestimmen, waren keine Einschnitte oder Störung der Haut oder Brustwarze unerwünscht und würde eine entzündliche Signal aufgrund der Gewebeverletzung das wäre verwechseln induzieren die LPS-induzierte Signal.
Zusätzlich unsererInjektion wurde mit einem kommerziell erhältlichen Insulinspritze und ohne die Verwendung eines gezogenen Mikropipette oder Mikromanipulatoren abgeschlossen, wie in einigen anderen Methoden, die für die Injektion nicht nutzen Nippel Entfernen 9, 10. Wir glauben, dies war nur möglich, weil die stillende Brustwarze ist leicht vergrößert und etwas leichter zu injizieren als eine junge, jungfräuliche Maus Brustwarze. Um virgin Mäusen injiziert, kann strengere Werkzeuge benötigt werden.
Wie sich aus Fig. 2, daß, wenn richtig ausgeführt, Injektion von LPS in die Kanäle des Maus Brustdrüse lokalisierte Entzündung als visualisierte verursacht durch eine Zunahme der NF-KB-Luciferase-Reporter-Aktivität. Andere haben analysiert, in größerem Umfang dieses Modell der akuten Mastitis, entweder durch E. coli oder LPS-Injektion in die Brustdrüse und anschließender Analyse des Gewebes 2-3, 8, 10-14. Unter den vielen Erkenntnissen, zeigen diese Studien, dass die entzündliche Reaktion is moduliert durch Wechselwirkungen mit CD14, und dass es zu einer neutrophilen Einstroms durch mammary Alveolarmakrophagen reguliert. Wie in unseren beiden bisher veröffentlichten Arbeiten 4, sowie die der anderen zwei dieses Modell von Mastitis kann weiter verwendet werden, um Mechanismen und Therapien für den Menschen relevanten studieren, wo so viele wie 3-33% der stillenden Frauen von dieser schmerzhaften Infektion leiden vorgeschlagen (Prozentsatz variiert je nach Methodik der Studie) 15. Es kann sich auch als ein nützliches Forschungsinstrument für die in der Milchwirtschaft, wo Mastitis ist eine teure Krankheit, die zu erheblichen Verlusten in der Milchproduktion jedes Jahr 16.
Schließlich haben die NGL transgenen Reporter Mäusen verwendet hier und die ähnlich funktionierende HLL Reporter Mäusen 17 in zahlreichen Studien verwendet worden, um zu überprüfen, zu quantifizieren, und verfolgen die nach oben oder unten Regulierung der NF-kappaB-Aktivität in einer Vielzahl von Krankheiten und Entwicklungsstörungen Modelle einschließlich akuter LungeVerletzung, Lungenkrebs, Atemwegs Verzweigung Morphogenese, Insulinresistenz, Fettleibigkeit und Myokardinfarkt 1, 17-21. Dieses Modell bietet eine zusätzliche Beispiel für die Nützlichkeit dieser Reporter Transgenen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH CA113734 verliehen F Yull und dem Department of Veterans Affairs (TS Blackwell) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
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