Summary
גישה מהירה כדי לחקור אינטראקציות והשפעות על מנגנונים מולקולריים הקשורים לנוכחות של נוגדנים בסביבה תאית מתוארת. השיטה כרוכה transfection של נוגדנים לתאים חיים באמצעות היווצרות מורכבת שאינן קוולנטיים המבוססת על ניסוח שומנים בדם. הטכניקה ניתנת להתאמה לשורות תאים הנציחו ותאים ראשוניים.
Abstract
נוגדנים לספק את היכולת לקבל תובנה רומן לאירועים שונים המתרחשים במערכות חיים. היכולת לייצר נוגדנים ספציפיים מאוד לחלבוני היעד אפשרה לשאלות ביולוגיות מדויקות מאוד להתייחסות. חשוב לציין, הנוגדנים היו מעורבים בפתוגנזה של מספר המחלות אנושיות לרבות זאבת מערכתית (לופוס), דלקת מפרקים שגרוניים (RA), תסמונות paraneoplastic, טרשת נפוצה (MS) וטיפוס אנושי T-lymphotropic וירוס 1 (HTLV-1) קשור myelopathy / paraparesis ספסטית הטרופית (HAM / כפית) 1-9. איך לגרום למחלה היא נוגדני שטח של חקירה מתמשכת, והנתונים מצביעים על כך שאינטראקציות בין מולקולות נוגדנים ותוצאות תאיות שונות בדלקת, שינו סלולריים הודעות, ואפופטוזיס 10. הוכח כי חולים עם טרשת נפוצה וHAM / TSP לייצר נוגדנים עצמיים לחלבונים התאיים RNA מחייבים חלבונים הטרוגנית ribonuclear1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. הנתונים האחרונים מצביעים על כך נוגדנים לאנטיגנים משטח תוך עצבי ושניהם פתוגניים 3, 5-9, 11. לפיכך, הליך המאפשר לחקר נוגדנים תאיים: אינטראקציות חלבון הייתי משאיל תובנה גדולה להיווצרות מחלה.
גני transfected נפוץ לתוך תאים ראשוניים וקווים סלולריים בתרבות, לעומת זאת transfection של נוגדנים לתאים התעכב בשל שינוי של מבנה נוגדנים או יעילות transfection עניה 12. שיטות אחרות של transfection כוללות transfection נוגדן המבוסס על יפוזומים קטיוני (מורכב DOTAP / סמים) וpolyethylenimines (PEI); שניהם גרמו לירידה של פי עשרה בtransfection נוגדן השוואה לקבוצת ביקורת 12. השיטה מבוצעת במחקר שלנו היא דומה לשיטות קטיוני שומנים בתיווך ומשתמשת במנגנון מבוסס שומנים ליצירת קומפלקסים שאינם קוולנטיים עם הנוגדנים דרך אלקטרוסטטי וhydrאינטראקציות ophobic 13. אנו מנוצלים מגיבים Ab-סחורה ב, שהוא ניסוח שומנים מסוגל ללכוד נוגדנים דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופובי שאינם קוולנטיים ואספקתם בתוך תאים. לפיכך כימי וגנטיים זיווגים אינם הכרחיים עבור משלוח של נוגדנים פונקציונליים לתוך תאי חיים. שיטה זו אפשרה לנו לבצע מעקב נוגדנים שונים וניסויי חלבון לוקליזציה, כמו גם את הניתוח של ההשלכות המולקולריות של נוגדנים תאיים: אינטראקציות חלבון 9.
בפרוטוקול זה, אנו נראים כיצד transfect נוגדנים לנוירונים במהירות, reproducibly ועם רמה גבוהה של יעילות transfection. כדוגמה, ישתמשו נוגדני A1 ואנטי IgG נגד hnRNP. לכימות קל של יעילות transfection השתמשנו נוגדני A1 אנטי hnRNP כותרתו עם ATTO-550-NHS וFITC שכותרת IgG. Atto550 NHS הוא תווית חדשה עם ספיגה מולקולרית גבוהה והקוונטים ייישן. מקור עירור ומסנני ניאון לAtto550 דומה לCy3 (שמות 556 Em. 578). בנוסף, יש Atto550 photostability גבוה. FITC מתויג-IgG שמש כבקרה כדי להראות ששיטה זו היא תכליתית ולא לצבוע תלוי. גישה זו והנתונים שיופקו תסייענה בהבנה של התפקיד שנוגדנים לאנטיגנים תאיים היעד עשויים לשחק בפתוגנזה של מחלות בבני אדם.
Protocol
1. תיוג נוגדן (איור 1)
- הפוך 0.1 3 חיץ NaHCO M:
- 8.4 גרם NaHCO 3
- 29.2 גרם NaCl
- 1 הליטר H 2 O
- להעלות את המאגר לרמת חומציות של 8.4 עם הפתרון הזה (10.6 גרם Na 2 3 CO, 29.2 גרם NaCl, 1 הליטר H 2 0).
- הוסף 35 Atto550 NHS μl לאנטי hnRNPA1 ו500 3 חיץ μl μl 70 NaHCO ולסובב לשעה 1 בטמפרטורת חדר. אחרי הסיבוב באורך שעה, להזריק את התערובת לתוך dialyzer ודיאליזה ב2 ליטר של PBS בן לילה.
- למחרת, לרכז את Atto550 NHS אנטי hnRNPA1-דיאליזה באמצעות עמודת ספין (Amicon Ultra 0.5).
- לאחר Atto550 NHS כותרת הנוגדן אנטי hnRNPA1 כבר מרוכז, ננו טיפת מדגם כדי לקבוע את הריכוז.
2. Transfection נוגדן (איור 2)
- זרעי 10 5 תאים / גם לתוך 500 μl של Dulbecco השינוי של הנשר הבינוני (+1% אנטיביוטיקת FBS DMEM/F12 +10%) בשקופית 24 שעות גם 8 לפני transfection. confluency תא צריך להיות לפחות 70%.
- עשרים וארבע שעות לאחר זריעה, להוסיף 2 μl של ריאגנט Ab-סחורה בלתוך צינור אפנדורף.
- בשלב בא, להוסיף 2 מיקרוגרם של Atto550 NHS כותרת הנוגדן אנטי hnRNPA1 (0.5 מיקרוגרם / μl) לאותו הצינור אפנדורף ודגירה 10-15 דקות ב RT.
- במהלך הדגירה, לשאוב תקשורת ולהוסיף 394 μl של תקשורת DMEM הטריה לתאים.
שים לב: הוסף 500 DMEM μl לתא אחד של תאי תוליים לפעול כביקורת.
- לאחר דגירה, להוסיף 100 μl של DMEM לתערובת הנוגדנים, מערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה, ולהוסיף לתאים בDMEM להיקף כולל של 500 μl.
- שינוי התקשורת לאחר 48 שעות של לידת נוגדן.
הערה: הפרוטוקול חזר על עצמו עם FITC שכותרת ריג כביקורת חיובית.
3. הדמיה חייה וקבועה לקביעת יעילות
- תמונת תאי החיים 48 שעות בשימוש במסנן Cy3 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונה את Atto550 NHS transfected הנוגדנים שכותרתו.
- לאחר הדמיה חייה הושלמה, לשאוב את התקשורת ותאים לתקן.
- לאחר aspirating תקשורת, לטפל בתאים עם Paraformaldehyde 0.4% למשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. שטוף תאים 4 × 5 דקות כל אחת עם PBS. ואז, לעגן את התאים עם מדיה הרכבה המכילה ריאגנט DAPI וcoverslip תיקון. למדוד יעילות transfection של התאים הקבועים עם AxioVision תוכנה. אם AxioVision תוכנה היא לא בהישג יד, פשוט לספור את האירועים מהתמונה שלך על ידי יד ותוצאות חישוב בתקע 3.7. לחלופין, תוכנת ImageJ יכולה לשמש לחישובים אלה.
- ראשית, שימוש במדידה "האירועים" כדי לספור את המספר הכולל של תאים בתמונה על פי בחירתך ב20x הגדלה.
- לאחר מכן השתמשתי במדידה "האירועים" לספור את התאים שלא היוtransfected בהצלחה עם נוגדנים באותה התמונה בהגדלה 20x.
- כדי לגשת ל" אירועים "נמדדו בפורמט סגנון Excel, לחץ על" מאפיינים ", לחץ על הכרטיסייה" המדידה ", ולחץ לצפייה" כשולחן. "
- לבסוף, השתמש בחישוב הבא כדי לקבוע את יעילות transfection שלך על ידי ההשוואה בין שני אירועים שנמדדו בעבר: ((תאים - תאי סך Untransfected) / תאים סה"כ) = יעיל x 100 Transfection.
4. נציג תוצאות
תמונות החיות של untransfected (האיור 3A) בהשוואה ל( איור 3B) נוירונים transfected מגלה כי התיוג של הנוגדנים (אדום או ירוק בכל דמות) הוא ציין באופן ברור בתוך תאים (האיור 3B, C, D). בעקבות שאיפה וכביסה עם תקשורת כדי להסיר נוגדנים או בין חסיד אל פני השטח של תאים, נוגדנים שכותרתו הם עדיין נמצאים בתאי עצב (האיור 3C, ד). כדי לחשב את יעילות transfection, השתמש בתוכנת AxioVision לחשב תאים הכוללים בהשוואה לתאים שלא transfected בהצלחה. ערכים אלו נקשרו לנוסחת יעילות transfection לרכוש את יעילות transfection כאחוז מכלל תאים (איור 4).
איור 1. תרשים זרימה של הנהלים המשמשים לנוגדני תווית עם ATTO 550 NHS אסתר אחרי הצעדים הנדרשים כדי לרכז את הנוגדנים שהכותרת. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תרשים זרימה של הנהלים המשמשים לtransfect נוגדנים שכותרתו לתוך תאי חיים בתרבות.arge.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. חי תמונות של הנוירונים transfected 48 השעות transfection הבא.
איור 4. קבוע ושטף תמונות עם אירועים נספרו על מנת לקבוע יעילות transfection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על מנת לבדוק את ההשערות לגבי מולקולות ספציפיות וביטוייהם, גנים ווקטורים אחרים transfected נפוץ לתוך תאים. ההיבט הייחודי של הליך זה הוא היכולת בקלות transfect נוגדנים לתאי המטרה. בצענו בשיטה זו בחמישה ניסויים נפרדים, כל אחד בכפילויות. תוצאות יעילות transfection היו דומות בכל הניסויים. חשוב מכך, השיטה מאפשרת כניסה של נוגדנים לתא מבלי לשנות מבנה נוגדן או פונקציה. יתר על כן, בשימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי עצב חיים, אנו מסוגלים לקבוע יעילות transfection, אשר בדרך כלל עולה על 55%. זה מאפשר לבחון את ההשערות קשורות ישירות לאינטראקציה בין הנוגדן של עניין והמטרה התאית שלו. למרות שלא למד כאן, שברי Fab יכולים גם להיות מנוצלים. לחלופין, יכולים להיות מתוכננים ניסויים שיבדקו אם שינוי תנאי התרבות כגון הוספת ציטוקינים דלקתיים משפיע expressiאו לוקליזציה של מטרות תאיות.
איך נוגדנים יוכלו למקד אנטיגנים תאיים הוא אזור מתמשך של חקירה. התאוריה שלטת מציינת כי בעקבות פציעה סלולרית, אנטיגנים תאיים חשופים לתגובה החיסונית אדפטיבית, המאפשרת לייצור נוגדן לאנטיגן היעד. תגובת הנוגדנים לhnRNPs בחולי זאבת היא דוגמה איך זה סביר מתרחש. חולי SLE לייצר נוגדנים לP2 hnRNP ועל אפופטוזיס של תאי המטרה, P2 hnRNP מועבר לתא השטח שבו הוא זמין ליצירת תגובה אוטואימונית 14. זה גם מוצג במחל נוירולוגית, שבו מחקרים הראו כי אנטיגנים על פני שטח רק על נוירונים יכולים להיות מטרות לתגובה אוטואימונית פתוגניים 15, 16. רעיון זה עתה למבחן. מעניין לציין, שעכשיו יש נתונים המצביעים על כך נוגדנים יכולים להיכנס נוירונים באופן ספציפי epitope. לדוגמה, ברטינופתיה אוטואימונית,נוגדני NTI-enolase חדרו נוירונים ושינו את הפונקציה של enolase, אנזים cytoplasmic glycolytic 17. יתר על כן, במודל של תסמונת קשה אדם, נוגדנים נגד amphiphysin נכנסו נוירונים in vivo, שיתוף מקומי עם סמנים מראש סינפטיים ושחרור GABA השתנה 18. זה יכול להיות קשור למבנה והתפקוד הייחודיים של תאי עצב. מחקרים כמו זה שהוצג כאן לטפל בסוגיות החשובות הללו, כמו בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות תמשיך להיות למדה והבינו טובים יותר 9.
hnRNP A1 הוא אנטיגן תאי 5, 9. לכן, אנו נדרשים טכניקה שתאפשר לנו לבחון האם נוגדני A1 אנטי hnRNP עשויים לתרום לתפקוד עצבי. בגלל נוגדנים עצמיים לhnRNP A1 נמצאו בחולי טרשת נפוצה וHAM / 3 כפית, 5-7, 9, 11, אנו transfected נוגדני A1 ובקרה אנטי hnRNP לנוירונים. אנו מאשרים כי נוגדנים נכנסו לתאים ולאחרניתוחי microarray (שימוש הוא השליטה IgG ונוירונים תוליים כשולטים) הראו כי גנים הקשורים לתפקוד A1 hnRNP שונו, כך אשרו transfection שלא לשנות את התפקוד אנטי hnRNP A1 9. חשוב לציין, ניתוחי microarray נוספים הראו קשר בין תגובת נוגדני A1 אנטי hnRNP עם ביטוי משתנה של spastin, גן שכאשר מוטציה, מחק את הפנוטיפ הקליני של חולי טרשת הנפוצה וHAM / TSP 9. זה מראה שtransfection הנוגדן יכול לשמש כדי לבדוק אם נוגדנים למטרות תאיות יכולים לשנות תפקודים תאיים. זה כולל שירות עם מספר מחלות אוטואימוניות אחרות, כגון SLE, RA, ותסמונות paraneoplastic הקשורים לסרטן.
לסיכום, היכולת האמינה לtransfect נוגדנים לתוך תאי חיים מספקת את ההזדמנות כדי לשאול את השאלות של תפקוד נוגדנים, נוגדנים:. אינטראקציות היעד ולוקליזציה של מטרות בתוך תאים בתנאים נורמלים ומחלה </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי משרד המחקר והפיתוח, מחקר רפואי שירות, מחלקה לענייני יוצאי הצבא. מחקר זה מומן בפרס הצטיינות VA סקירה (לMCL) ואוניברסיטת טנסי קרן למדעי בריאות במרכז לחקר טרשת נפוצה על ידי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
