Summary
En rask metode for å undersøke interaksjoner og effekter på molekylære mekanismene knyttet til nærværet av antistoffer i en intracellulær miljø er beskrevet. Fremgangsmåten innebærer transfeksjon av antistoffer i levende celler ved hjelp av et ikke-kovalent kompleks formasjon basert på en lipid formulering. Teknikken er tilpasningsdyktig til udødeliggjort cellelinjer og primære celler.
Abstract
Antistoffer gi muligheten til å få romanen innsikt i ulike arrangementer som finner sted i levende systemer. Evnen til å produsere svært spesifikke antistoffer mot target proteiner har åpnet for svært presise biologiske spørsmål tas opp. Viktigere, har antistoffer vært implisert i patogenesen av en rekke humane sykdommer inkludert systemisk lupus erythematosus (SLE), revmatoid artritt (RA), paraneoplastiske syndromer, multippel sklerose (MS) og human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) assosiert myelopati / tropisk spastisk paraparese (HAM / TSP) 1-9. Hvordan antistoffer forårsake sykdom er et område med pågående etterforskning, og data tyder på at interaksjoner mellom antistoffer og ulike intracellulære molekyler resultater i betennelser, endret cellulær messaging, og apoptose 10. Det har blitt vist at pasienter med MS og HAM / TSP produserer autoantistoffer til det intracellulære RNA bindingsprotein heterogen ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Nyere data indikerer at antistoffer til både intra-neuronal og overflateantigener er sykdomsfremkallende 3, 5-9, 11. Dermed, en prosedyre som gjør det mulig for studiet av intracellulær antistoff: ville protein interaksjoner låne stor innsikt i sykdommen patogenesen.
Gener er ofte transfekteres i primære celler og cellelinjer i kultur, har imidlertid transfeksjon av antistoffer i celler blitt hindret av endring av antistoff struktur eller dårlig transfeksjon effektivitet 12. Andre metoder for transfeksjon er antistoff transfeksjon basert på kationiske liposomer (bestående av DOTAP / DOPE) og polyethylenimines (PEI), som begge som resulterte i en ti-ganger reduksjon i antistoff transfeksjon forhold til kontroller 12. Metoden utføres i vår undersøkelse er lik kationiske lipid-medierte metoder og benytter et lipid-basert mekanisme for å danne ikke-kovalente komplekser med antistoffer gjennom elektrostatisk og hydrophobic interaksjoner 13. Vi utnyttet Ab-DeliverIN reagens, som er et lipid formulering som kan fange antistoffer gjennom ikke-kovalente elektrostatiske og hydrofobe interaksjoner og levere dem inne i celler. Således kjemisk og genetisk koblinger er ikke nødvendig for levering av funksjonelle antistoffer i levende celler. Denne metoden har gitt oss mulighet til å utføre ulike antistoff sporing og protein lokalisering eksperimenter, samt analyser av de molekylære konsekvensene av intracellulær antistoff: protein interaksjoner 9.
I denne protokollen, vil vi vise hvordan du transfektere antistoffer i nevroner raskt, reproduserbart og med en høy grad av transfeksjon effektivitet. Som et eksempel vil vi bruke anti-hnRNP A1 og anti-IgG antistoffer. For enkel kvantifisering av transfeksjon effektivitet brukte vi anti-hnRNP A1 antistoffer merket med Atto-550-NHS og FITC-merket IgG. Atto550 NHS er en ny etikett med høy molekylvekt absorpsjon og quantum yield. Eksitasjon kilde og fluorescerende filtre for Atto550 ligner Cy3 (eks. 556 Em. 578). I tillegg har Atto550 høy fotostabilitet. FITC-merket IgG ble brukt som en kontroll for å vise at denne metoden er allsidig og ikke fargestoff avhengige. Denne tilnærmingen og dataene som er generert vil bistå i forståelse av rollen som antistoffer til intracellulære mål antigener kan spille i patogenesen av menneskelige sykdommer.
Protocol
1. Antibody Labeling (Figur 1)
- Gjør 0,1 M NaHCO 3 buffer:
- 8,4 g NaHCO 3
- 29,2 g NaCl
- 1 liter H 2 O
- Bring bufferen opp til en pH på 8,4 med denne løsning (10,6 g Na 2 3 CO, 29,2 g NaCl, 1 liter H 2 0).
- Legg 35 ul Atto550 NHS til 70 pl anti-hnRNPA1 og 500 pl NaHCO 3 buffer og roterer i 1 time ved romtemperatur. Etter den timelange rotasjon, injiserer blandingen i en dialyzer og Dialyser i 2 liter PBS natten.
- Neste dag, konsentrere dialysert Atto550 NHS anti-hnRNPA1 med en spin kolonne (Amicon Ultra 0.5).
- Etter Atto550 NHS merket anti-hnRNPA1 antistoffet har vært konsentrert, nano-slipp prøven for å bestemme konsentrasjonen.
2. Antistoff Transfeksjon (figur 2)
- Seed 10 5 celler / brønn i 500 ul Dulbecco modifiserte Eagle Medium (DMEM/F12 10% FBS +1% antibiotika) i en 8 vel lysbilde 24 timer før transfeksjon. Cell sammenflyting bør være minst 70%.
- Tjuefire timer etter såing, tilsett 2 pl Ab-DeliverIN reagens til en Eppendorf tube.
- Deretter legger 2 ug Atto550 NHS merket anti-hnRNPA1 antistoff (0,5 ug / ul) til den samme Eppendorf-rør og inkuber 10-15 minutter ved RT.
- Under inkuberingen aspirer medier og legge 394 pl frisk DMEM media til cellene.
Merk: Tilsett 500 ul DMEM til ett kammer av uberørte celler til å fungere som en kontroll.
- Etter inkubering, tilsett 100 pl DMEM til antistoffet blandingen, blandes ved å pipettere opp og ned, og legge til cellene i DMEM for et samlet volum på 500 pl.
- Endre media etter 48 timers av antistoff levering.
Merk: Protokoll ble gjentatt med FITC merket som Rigg som positiv kontroll.
3. Live og Fast imaging for å fastslå Effektivitet
- Bilde cellene lever i 48 timer ved hjelp av Cy3 filter på en fluorescerende mikroskop til bilde de transfekterte Atto550 NHS merket antistoffer.
- Etter levende avbildning er fullført, aspirer media og fikse celler.
- Etter aspirasjonsdetektorer medier, behandle cellene med 0,4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur. Vask cellene 4 x 5 min hver med PBS. Deretter monteres celler med montering medier som inneholder DAPI reagens og fikse dekkglass. Måle transfeksjon effektivitet av de faste celler med Axiovision programvare. Hvis Axiovision programvare er ikke på hånden, bare telle hendelser fra bildet ved hånden og plugg resultatene i beregningen i 3.7. Alternativt kan ImageJ programvare kan brukes for disse beregningene.
- Først bruker du "Hendelser" måling å telle antall celler i ditt bilde av valg på 20x forstørrelse.
- Deretter bruker du "Events" måling for å telle celler som ikke varhell transfektert med antistoffer i samme 20x forstørrelse bilde.
- Du får tilgang til målte "Events" i et Excel-stil format, klikk på "Properties", klikk på "Measurement"-kategorien, og klikk for å se "Som tabell."
- Til slutt bruker følgende beregning for å bestemme transfeksjon effektivitet ved å sammenligne de to tidligere målt hendelser: ((Totalt celler - Untransfected celler) / Sum celler) x 100 = Transfeksjon effektivitet.
4. Representant Resultater
De levende bilder av untransfected (figur 3A) i forhold til transfekterte (figur 3B) nevroner avslører at merking av antistoffene (rød eller grønn i hver figur) er tydelig observert i cellene (figur 3B, C, D). Etter aspirasjon og vasking med media for å fjerne antistoffer mellom eller adherente til overflaten av celler, merkede antistoffer er fortsatt til stede i nevroner (figur 3C, D). Å beregne transfeksjon effektivitet, bruker Axiovision programvare for å beregne totale celler sammenlignet med celler som ikke ble vellykket transfektert. Disse verdier ble inngått en transfeksjon effektivitet formel å erverve transfeksjon effektivitet som en prosentandel av totale celler (figur 4).
Figur 1. Flytdiagram for de prosedyrer som brukes til å merke antistoffer med Atto 550 NHS ester etterfulgt av trinn for å konsentrere de merkede antistoffer. Klikk her for å vise større figur .
Figur 2. Flytskjema av prosedyrene anvendt for å transfektere merkede antistoffer i levende celler i kultur.arge.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 3. Levende bilder av transfekterte nevroner 48 hr følgende transfeksjon.
Figur 4. Reparert og skylt bilder med hendelser telles for å bestemme transfeksjon effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å teste hypoteser om spesifikke molekyler og deres uttrykk blir gener og andre vektorer som vanligvis transfektert inn i cellene. Det unike med denne prosedyren er muligheten til enkelt transfektere antistoffer i målcellene. Vi utførte denne metoden i fem separate eksperimenter hver i duplikater. Transfeksjon effektivitet resultatene var lik blant alle eksperimenter. Viktigere, muliggjør metoden oppføring av antistoffer inn i cellen uten å endre antistoff struktur eller funksjon. Videre, med bruk av fluorescens mikroskopi av levende neuroner, er vi i stand til å fastslå transfeksjon effektivitet, som vanligvis er over 55%. Dette gjør det mulig å teste hypoteser knyttet direkte til samspillet mellom antistoff av interesse og intracellulær mål. Selv om det ikke undersøkt her, kan Fab fragmenter også anvendes. Alternativt kan eksperimenter utformes som undersøker om å endre kultur forhold eksempel legge inflammatoriske cytokiner påvirker expressipå eller lokalisering av intracellulære mål.
Hvordan antistoffer kan målrette intracellulære antigener er et pågående etterforskning. Rådende teorien indikerer at etter cellulær skade, blir intracellulære antigener eksponert til adaptive immunrespons, som tillater for antistoff produksjon til målantigen. Antistoffrespons mot hnRNPs i SLE-pasienter er et eksempel på hvordan dette skjer trolig. SLE-pasienter gjør antistoffer mot hnRNP P2 og ved apoptose av målceller, er hnRNP P2 transportert til celleoverflaten hvor det er tilgjengelig for å generere en autoimmun respons 14. Dette ble også vist i nevrologisk sykdom, der studier antydet at bare overflateantigener på nevroner kan være mål for en sykdomsfremkallende autoimmun reaksjon 15, 16.. Denne ideen blir nå utfordret. Interessant nok er det nå data som tyder på at antistoffer kan skrive nevroner i en epitop bestemt måte. For eksempel i autoimmun retinopati, enNTI-enolase antistoffer trengt nevroner og endret funksjon av enolase, en cytoplasmisk glycolytic enzym 17. Videre, i en modell av stiv person syndrom, gikk anti-amphiphysin antistoffer nevroner in vivo, samlokalisert med presynaptiske markører og endret GABA utslipp 18. Dette kan være relatert til den unike struktur og funksjon av nerveceller. Studier som den som presenteres her løse disse viktige spørsmålene, som patogenesen av autoimmune sykdommer fortsette å bli studert og bedre forstått 9.
hnRNP A1 er en intracellulær antigen 5, 9. Derfor kreves vi en teknikk som ville tillate oss å teste om anti-hnRNP A1 antistoffer kan bidra til neuronal dysfunksjon. Fordi autoantistoffer til hnRNP A1 ble funnet i MS og skinke / TSP pasienter 3, 5-7, 9, 11, transfektert vi anti-hnRNP A1 og kontroll antistoffer i nevroner. Vi har bekreftet at antistoffer oppgitte cellene og ettermicroarray analyser (ved hjelp av både kontroll IgG og urørt nevroner som kontroller) viste at gener relatert til hnRNP A1 funksjon ble endret, noe som bekrefter at transfeksjon ikke endre anti-hnRNP A1 funksjon 9. Viktigere, viste ytterligere microarray analyser en sammenheng mellom anti-hnRNP A1 antistoffrespons med endret uttrykk for spastin, et gen som når mutert, etterligner den kliniske fenotypen av MS og skinke / TSP pasienter 9. Dette viser at antistoff transfeksjon kan brukes til å teste hvorvidt antistoffer mot intracellulære mål kan endre cellulære funksjoner. Dette har verktøy med en rekke andre autoimmune sykdommer som SLE, RA, og kreft-relaterte paraneoplastiske syndromer.
Oppsummert gir mulighet til pålitelig transfektere antistoffer i levende celler anledning til å stille spørsmål antistoff funksjon, antistoff:. Target interaksjoner og lokalisering av mål innenfor celler under normale og sykdomstilstander </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av Office of Research and Development, Medical Research Service, Department of Veterans Affairs. Denne studien ble finansiert av en VA Merit anmeldelse Award (til MCL) og University of Tennessee Health Science Center Multippel sklerose forskningsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
