Быстрое подход к исследованию взаимодействия и воздействия на молекулярные механизмы, связанные с наличием антител в внутриклеточной среде описывается. Метод включает в себя трансфекцию антител в живой клетки с помощью нековалентных образование комплекса на основе липидного состава. Техника адаптирована к увековечили клеточных линий и первичных клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Антитела Трансфекция в нейроны, как инструмент для изучения патогенеза заболевания
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Антитела позволяют по-новому взглянуть на различные процессы, происходящие в живых системах. Возможность получения высокоспецифичных антител к целевым белкам позволила решать очень точные биологические задачи. Важно отметить, что антитела задействованы в патогенезе ряда заболеваний человека, включая системную красную волчанку (СКВ), ревматоидный артрит (РА), паранеопластические синдромы, рассеянный склероз (РС) и миелопатию/тропический спастический парапарез, ассоциированные с человеческим Т-лимфотропным вирусом 1-го типа (HAM/TSP) 1-9. Механизмы, посредством которых антитела вызывают заболевание, остаются предметом активных исследований; имеющиеся данные свидетельствуют о том, что взаимодействия между антителами и различными внутриклеточными молекулами приводят к воспалению, нарушению клеточной сигнализации и апоптозу 10. Было показано, что пациенты с РС и HAM/TSP вырабатывают аутоантитела к внутриклеточному РНК-связывающему белку — гетерогенному рибонуклеопротеину A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Современные данные указывают на патогенность антител как к внутринейрональным, так и к поверхностным антигенам 3, 5-9, 11. Таким образом, методика, позволяющая изучать внутриклеточные взаимодействия антитела с белком, позволила бы значительно лучше понять патогенез данных заболеваний.
Гены обычно трансфицируют в первичные клетки и клеточные линии в культуре, однако трансфекция антител в клетки была затруднена из-за изменения структуры антител или низкой эффективности трансфекции 12. Другие методы трансфекции включают трансфекцию антител на основе катионных липосом (состоящих из DOTAP/DOPE) и полиэтилениминов (PEI); оба этих метода привели к десятикратному снижению уровня трансфекции антител по сравнению с контролем 12. Метод, примененный в нашем исследовании, аналогичен методам с использованием катионных липидов и использует липидный механизм для формирования нековалентных комплексов с антителами посредством электростатических и гидрофобных взаимодействий 13. Мы использовали реагент Ab-DeliverIN, который представляет собой липидную формуляцию, способную захватывать антитела за счет нековалентных электростатических и гидрофобных взаимодействий и доставлять их внутрь клеток. Таким образом, химическое и генетическое связывание не требуется для доставки функциональных антител в живые клетки. Этот метод позволил нам провести различные эксперименты по отслеживанию антител и локализации белков, а также проанализировать молекулярные последствия внутриклеточных взаимодействий антитело:белок 9.
В данном протоколе мы продемонстрируем, как быстро и воспроизводимо трансфецировать антитела в нейроны с высокой эффективностью трансфекции. В качестве примера мы будем использовать антитела к hnRNP A1 и антитела IgG. Для удобного количественного определения эффективности трансфекции мы использовали антитела к hnRNP A1, меченные Atto-550-NHS, и IgG, меченные FITC. Atto550 NHS — это новый краситель с высоким молекулярным поглощением и квантовым выходом. Источник возбуждения и флуоресцентные фильтры для Atto550 аналогичны Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Кроме того, Atto550 обладает высокой фотостабильностью. Меченные FITC IgG использовались в качестве контроля, чтобы показать универсальность данного метода и его независимость от типа красителя. Этот подход и полученные данные помогут в понимании роли антител к внутриклеточным целевым антигенам в патогенезе заболеваний человека.
Протокол
1. Антитела маркировки (рис. 1)
- Сделайте 0,1 М NaHCO 3 буфера:
- 8,4 г NaHCO 3
- 29,2 г NaCl
- 1 л H 2 O
- Принесите буфера до рН 8,4 с этим решением (10,6 г Na 2 CO 3, 29,2 г NaCl, 1 л H 2 0).
- Добавить 35 мкл Atto550 NHS до 70 мкл анти-hnRNPA1 и 500 мкл буфера NaHCO 3 и вращать в течение 1 часа при комнатной температуре. После часового вращения, вводят смесь в диализатора и диализировать в 2 л PBS в течение ночи.
- На следующий день, сосредоточиться диализованной Atto550 NHS анти-hnRNPA1 использованием спин ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
С целью проверки гипотезы о конкретных молекул и их выражения, гены и другие векторы, как правило, трансфицировали в клетки. Уникальной особенностью этой процедуры является возможность легко трансфекции антител в клетки-мишени. Мы провели этот метод в пяти отдельных экспериментов каждая в двух экземплярах. Результаты эффективности трансфекции были похожи между всеми экспериментами. Важно отметить, что метод позволяет въезд антител в клетки без изменения структуры антител или функции. Кроме того, с помощью флуоресцентной.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Управления научных исследований и разработок, медицинских исследований службы, Департамента по делам ветеранов. Это исследование было профинансировано VA премии отзыв заслуги (в MCL) и Университета Теннесси Научного центра здоровья Несколько Fund Research склероз.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| Флуоресцентного микроскопа AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| AxioVision версии 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC-меченными анти-Ригга | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS эфир | Сигма | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS +1% антибиотиков | Gibco | 11320-033 | |
| Поли-D-лизин, 8-а Слайды культуры | BD | 354632 | |
| Многоцелевой Rotator | Научно IndustriES Inc | Модель 151 | |
| DAPI Монтаж СМИ | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Диализатор | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ультра-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Параформальдегид (4% раствор) | Электрон наук микроскопии | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
Ссылки
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
