Summary
Быстрое подход к исследованию взаимодействия и воздействия на молекулярные механизмы, связанные с наличием антител в внутриклеточной среде описывается. Метод включает в себя трансфекцию антител в живой клетки с помощью нековалентных образование комплекса на основе липидного состава. Техника адаптирована к увековечили клеточных линий и первичных клеток.
Protocol
1. Антитела маркировки (рис. 1)
- Сделайте 0,1 М NaHCO 3 буфера:
- 8,4 г NaHCO 3
- 29,2 г NaCl
- 1 л H 2 O
- Принесите буфера до рН 8,4 с этим решением (10,6 г Na 2 CO 3, 29,2 г NaCl, 1 л H 2 0).
- Добавить 35 мкл Atto550 NHS до 70 мкл анти-hnRNPA1 и 500 мкл буфера NaHCO 3 и вращать в течение 1 часа при комнатной температуре. После часового вращения, вводят смесь в диализатора и диализировать в 2 л PBS в течение ночи.
- На следующий день, сосредоточиться диализованной Atto550 NHS анти-hnRNPA1 использованием спин колонки (Amicon Ультра 0,5).
- После Atto550 NHS меченые анти-hnRNPA1 антитела были сосредоточены, нано-падение образца для определения концентрации.
2. Антитела Трансфекция (рис. 2)
- Семенной 10 5 клеток / лунку в 500 мкл DulbeccО, модифицированная Eagle Medium (DMEM/F12 +10% FBS +1% антибиотик) в 8 хорошо слайд 24 часов до трансфекции. Сотовые слияния должна быть не менее 70%.
- Двадцать четыре часа после посева, добавить 2 мкл Ab-DeliverIN реагента в пробирку Эппендорф.
- Затем добавьте 2 мкг Atto550 NHS меченые анти-hnRNPA1 антител (0,5 мкг / мкл) в той же трубке Эппендорф и инкубировать 10-15 мин при комнатной температуре.
- Во время инкубации, аспирации медиа и добавьте 394 мкл свежей среды DMEM к клеткам.
Примечание: Добавить 500 мкл DMEM в одной палате нетронутыми клетки выступать в качестве контроля.
- После инкубации, добавьте 100 мкл DMEM с антителом смесь, перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, и добавить к клеткам в DMEM при общем объеме 500 мкл.
- Изменение средствах массовой информации после 48 часов антител доставки.
Примечание: Протокол был повторен с FITC меченых Ригг в качестве положительного контроля.
3. Онлайн и фиксированной изображений для определения эффективности
- Изображение клетки живут на 48 часов использования Cy3 фильтр на флуоресцентный микроскоп для получения изображений трансфицированных Atto550 NHS меченых антител.
- После живого изображения была завершена, аспирации средств массовой информации и исправление клеток.
- После аспирационных средств массовой информации, лечить клетками с 0,4% параформальдегид в течение 15 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки 4 х 5 мин с PBS. Затем смонтировать клетки с монтажной средах, содержащих DAPI реагентов и исправление покровное. Измерение эффективности трансфекции фиксированных клеток с AxioVision программного обеспечения. Если AxioVision программное обеспечение не на руку, просто считать события из вашего изображения вручную и подключить результатов в расчет в 3,7. Кроме того, ImageJ программное обеспечение может быть использовано для этих расчетов.
- Во-первых, использовать "События" измерения для подсчета общего количества клеток в вашем образе выбор на 20-кратным увеличением.
- Затем с помощью "События" измерения для подсчета клеток, которые не былиУспешно трансфицировали антител в том же 20-кратным увеличением изображения.
- Чтобы получить доступ к измеренным "События" в формате Excel стиля, нажмите на кнопку "Свойства", нажмите кнопку "Измерение" на вкладке и нажмите кнопку, чтобы просмотреть "Как видно из таблицы».
- Наконец, используйте следующие расчеты, чтобы определить вашу эффективность трансфекции путем сравнения двух ранее измеренных событий: ((Всего клетки - клетки нетрансфицированных) / Total Cells) х 100 = эффективность трансфекции.
4. Представитель Результаты
Живые образы нетрансфицированных (рис. 3А) по сравнению с трансфицированных (рис. 3В) нейронов показывают, что маркировка антитела (красным или зеленым в каждом рисунке) отчетливо наблюдается в клетках (рис. 3B, C, D). После аспирации и промывания со средствами массовой информации для удаления антител или между приверженцами поверхности клеток, меченых антител по-прежнему присутствуют в нейронах (рис. 3, D). Для расчета эффективности трансфекции, использовать программное обеспечение AxioVision для расчета общей клетках по сравнению с клетками, которые не были успешно трансфицировали. Эти значения были введены в формулу эффективности трансфекции приобрести эффективности трансфекции в процентах от общего числа клеток (рис. 4).
Рисунок 1. Блок-схема процедуры, используемые для метки антител с Atto 550 NHS эфир следуют шаги, необходимые для концентрации меченых антител. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Блок-схема процедуры, используемые для трансфекции меченых антител в живые клетки в культуре.arge.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.
Рисунок 3. Прямые изображения трансфецированных нейронов 48 часов после трансфекции.
Рисунок 4. Исправлена и промывать изображения с события учитываются в целях определения эффективности трансфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С целью проверки гипотезы о конкретных молекул и их выражения, гены и другие векторы, как правило, трансфицировали в клетки. Уникальной особенностью этой процедуры является возможность легко трансфекции антител в клетки-мишени. Мы провели этот метод в пяти отдельных экспериментов каждая в двух экземплярах. Результаты эффективности трансфекции были похожи между всеми экспериментами. Важно отметить, что метод позволяет въезд антител в клетки без изменения структуры антител или функции. Кроме того, с помощью флуоресцентной микроскопии живых нейронов, мы можем определить эффективность трансфекции, которая обычно превышает 55%. Это позволяет проверять гипотезы непосредственно связаны с взаимодействием между антителом интерес и внутриклеточные мишени. Хотя это и не учился здесь, Fab фрагментов также может быть использован. Кроме того, эксперименты могут быть разработаны, что если рассматривать изменения условий культивирования, такие как добавление цитокинов влияет expressiна локализацию или внутриклеточных мишеней.
Как антитела могут быть нацелены внутриклеточных антигенов является постоянным область исследований. Преобладающая теория указывает, что после повреждение клеток, внутриклеточные антигены подвергаются адаптивного иммунного ответа, который позволяет для получения антител к антигену-мишени. Антител в ответ на hnRNPs у больных СКВ является примером того, как это, вероятно, происходит. Больных СКВ вырабатывать антитела к P2 hnRNP и на апоптоз клетки-мишени, hnRNP P2 транспортируется на поверхность клетки, где он доступен для создания аутоиммунного ответа 14. Это было также показано в неврологическое заболевание, при котором исследования показали, что только поверхностные антигены на нейроны могут стать мишенью для патогенных аутоиммунного ответа 15, 16. Эта идея в настоящее время оспаривается. Интересно, что в настоящее время данные, свидетельствующие, что антитела можно ввести нейроны в эпитопа специфическим образом. Например, при аутоиммунных ретинопатии,NTI-энолаза антитела проникают нейронов и изменили функции энолаза, цитоплазматический фермент гликолиза 17. Кроме того, в модели жесткой человека синдром, анти-amphiphysin антител вступили нейронов в живом организме, совместно с локализованными пресинаптических маркеров и изменение выпуска ГАМК-18. Это может быть связано с уникальной структуры и функции нейронов. Исследования как тот, представленные здесь решения этих важных вопросов, как патогенезе аутоиммунных заболеваний продолжают изучать и лучше понимать 9.
hnRNP A1 является внутриклеточным антигеном 5, 9. Таким образом, мы потребовали технику, которая позволила бы нам проверить, является ли анти-hnRNP A1 антитела могли бы способствовать нейронов дисфункции. Потому что аутоантитела к hnRNP A1 были найдены в MS и HAM / TSP пациента 3, 5-7, 9, 11, трансфицированные анти-hnRNP A1 и контроль антител в нейроны. Мы подтвердили, что антитела вошел в клетках и послемикрочипов анализа (с использованием как контроль IgG и нетронутой нейронов в качестве контроля) показал, что гены, связанные с hnRNP A1 функции были изменены, тем самым подтверждая, что трансфекция не изменяет анти-hnRNP A1 функции 9. Важно отметить, что дальнейший анализ микрочипов показало связь между анти-hnRNP A1 антител с измененным выражением spastin, ген, который при мутировал, имитирует клиническую фенотип MS и HAM / TSP пациента 9. Это показывает, что антитела трансфекции может быть использована для проверки антител к внутриклеточным цели может изменить клеточных функций. Это утилита с рядом других аутоиммунных заболеваний, таких как СКВ, РА, связанных с раком паранеопластический синдромов.
Таким образом, способность надежно трансфекции антител в живых клетках предоставляет возможность задать вопросы антител функции, антитела. Целевого взаимодействия и локализации цели в клетках при нормальных и болезненных состояний </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Управления научных исследований и разработок, медицинских исследований службы, Департамента по делам ветеранов. Это исследование было профинансировано VA премии отзыв заслуги (в MCL) и Университета Теннесси Научного центра здоровья Несколько Fund Research склероз.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
