Summary
करने के लिए बातचीत और आणविक एक intracellular वातावरण में एंटीबॉडी की उपस्थिति से संबंधित तंत्र पर प्रभाव की जांच के लिए एक तेजी से दृष्टिकोण वर्णित है. विधि जीना एक लिपिड निर्माण पर आधारित एक गैर सहसंयोजक जटिल गठन का उपयोग कोशिकाओं में एंटीबॉडी के अभिकर्मक शामिल है. तकनीक अमर सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं के लिए अनुकूल है.
Protocol
1. एंटीबॉडी लेबलिंग (1 चित्रा)
- 0.1 एम NaHCO 3 बफर बनाओ:
- 8.4 छ NaHCO 3
- 29.2 छ NaCl
- 1 लीटर एच 2 हे
- बफर इस समाधान (10.6 छ ना 2 3 सीओ, 29.2 ग्राम NaCl, 1 लीटर 2 एच 0) के साथ 8.4 का एक pH लाओ.
- 70 μl विरोधी hnRNPA1 और 500 μl NaHCO 3 बफर 35 μl Atto550 एन एच एस जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बारी बारी से. घंटे तक रोटेशन के बाद, एक अपोहक में मिश्रण इंजेक्षन और पीबीएस के 2 लीटर में रातोंरात dialyze.
- अगले दिन, dialyzed Atto550 विरोधी hnRNPA1 एन एच एस एक स्पिन स्तंभ (Amicon अल्ट्रा 0.5) का उपयोग करते हुए ध्यान केंद्रित.
- बाद Atto550 एन एच एस लेबल विरोधी hnRNPA1 एंटीबॉडी ध्यान केंद्रित किया गया है, नैनो ड्रॉप नमूना एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए.
2. एंटीबॉडी प्रोटोकॉल (2 चित्रा)
- 10 Dulbecc के बीज 5 कोशिकाओं / 500 में अच्छी तरह से μlओ एक 8 अच्छी तरह से स्लाइड 24 अभिकर्मक करने से पहले घंटे में संशोधित ईगल मध्यम (DMEM/F12 +10% FBS एंटीबायोटिक 1%). सेल confluency कम से कम 70% होना चाहिए.
- बोने के बाद चौबीस घंटे एक Eppendorf ट्यूब में अब deliverin अभिकर्मक के 2 μl जोड़ें.
- अगले, एक ही Eppendorf ट्यूब लिए Atto550 एंटीबॉडी लेबल विरोधी hnRNPA1 एनएचएस के 2 ग्राम (0.5 ग्राम / μl) जोड़ने और आरटी पर 10-15 मिनट सेते हैं.
- ऊष्मायन के दौरान, मीडिया aspirate और कोशिकाओं को ताजा DMEM मीडिया के 394 μl जोड़ें.
नोट: अछूता कोशिकाओं के एक कक्ष के 500 μl DMEM जोड़ें एक नियंत्रण के रूप में कार्य.
- ऊष्मायन के बाद, DMEM के 100 μl एंटीबॉडी का मिश्रण करने के लिए जोड़ने के लिए, pipetting और नीचे मिश्रण और 500 μl की कुल मात्रा के लिए DMEM में कोशिकाओं को जोड़ने.
- एंटीबॉडी प्रसव के 48 घंटे के बाद मीडिया को बदलें.
नोट: प्रोटोकॉल FITC सकारात्मक नियंत्रण के रूप में रिग लेबल के साथ दोहराया गया था.
3. लाइव और फिक्स्ड इमेजिंग के लिए क्षमता का निर्धारण
- छवि कोशिकाओं 48 घंटा में रहते एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर Cy3 फिल्टर का उपयोग करने के लिए छवि ट्रांसफ़ेक्ट Atto550 लेबल एंटीबॉडी एन एच एस.
- रहते इमेजिंग के बाद पूरा हो गया है, मीडिया और तय कोशिकाओं aspirate.
- Aspirating मीडिया के बाद, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.4% Paraformaldehyde साथ कोशिकाओं का इलाज. कोशिकाओं 4 x 5 मिनट प्रत्येक पीबीएस के साथ धो लें. फिर, बढ़ते DAPI अभिकर्मक और तय coverslip वाले मीडिया के साथ कोशिकाओं माउंट. AxioVision सॉफ्टवेयर के साथ तय की कोशिकाओं के अभिकर्मक दक्षता उपाय. यदि AxioVision सॉफ्टवेयर हाथ पर नहीं है, बस हाथ और प्लग परिणामों से अपनी छवि से घटनाओं 3.7 में भरोसा गणना में. वैकल्पिक रूप से, ImageJ सॉफ्टवेयर इन गणनाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- सबसे पहले, "घटनाओं" माप का उपयोग करने के लिए अपनी पसंद की छवि में 20x बढ़ाई कोशिकाओं की कुल संख्या गिनती.
- अगला, "घटनाक्रम" माप का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं नहीं थे कि गिनतीसफलतापूर्वक एक ही 20x बढ़ाई छवि में एंटीबॉडी के साथ ट्रांसफ़ेक्ट.
- एक Excel शैली प्रारूप में मापा "घटनाओं" का उपयोग करने के लिए, "गुण" पर क्लिक करें, "मापन" टैब पर क्लिक करें, और देखने के लिए क्लिक करें "तालिका के रूप में."
- अंत में, पहले मापा दो घटनाओं की तुलना निम्नलिखित गणना अपने अभिकर्मक क्षमता का निर्धारण करने के लिए उपयोग: ((कुल कोशिकाओं - Untransfected कोशिकाओं) / कुल कोशिकाओं) x 100 = अभिकर्मक क्षमता.
4. प्रतिनिधि परिणाम
untransfected का जीना छवियों (चित्रा 3A) ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स (3B चित्रा) की तुलना से पता चलता है कि एंटीबॉडी की लेबलिंग (लाल या प्रत्येक व्यक्ति में हरी) कोशिकाओं (चित्रा 3 बी, सी, डी) में स्पष्ट रूप से मनाया जाता है. आकांक्षा के बाद और मीडिया के साथ धोने के लिए के बीच एंटीबॉडी या कोशिकाओं की सतह के अनुयायी को हटाने, लेबल एंटीबॉडी अभी भी न्यूरॉन्स (चित्रा -3 सी, डी) के भीतर मौजूद हैं. अभिकर्मक दक्षता की गणना करने के लिए, AxioVision सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट नहीं थे की तुलना में कुल कोशिकाओं की गणना. इन मूल्यों को एक अभिकर्मक दक्षता कुल कोशिकाओं के एक प्रतिशत (चित्रा 4) के रूप में अभिकर्मक दक्षता हासिल करने के लिए सूत्र में दर्ज किया गया.
चित्रा 1 ATTO 550 एनएचएस एस्टर के साथ लेबल एंटीबॉडी के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं का प्रवाह आरेख लेबल एंटीबॉडी ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक कदम के द्वारा पीछा किया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2 संस्कृति में जीवित कोशिकाओं में लेबल एंटीबॉडी transfect किया प्रक्रियाओं के प्रवाह आरेख.arge.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3 ट्रांसफ़ेक्ट 48 घंटा निम्नलिखित अभिकर्मक न्यूरॉन्स की छवियों जीते.
निश्चित चित्रा 4 और rinsed क्रम में गिना अभिकर्मक क्षमता का निर्धारण करने की घटनाओं के साथ छवियों.
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Discussion
आदेश में विशिष्ट अणु और उनके अभिव्यक्ति के बारे में hypotheses परीक्षण करने के लिए, जीन और अन्य वैक्टर सामान्यतः कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट हैं. इस प्रक्रिया का अनूठा पहलू यह आसानी से लक्ष्य कोशिकाओं में एंटीबॉडी transfect करने की क्षमता है. हम पाँच अलग डुप्लिकेट में प्रत्येक प्रयोगों में इस विधि का प्रदर्शन किया. अभिकर्मक दक्षता परिणाम सभी प्रयोगों के बीच इसी तरह के थे. महत्वपूर्ण बात है, विधि सेल में प्रतिरक्षी संरचना या समारोह में फेरबदल के बिना एंटीबॉडी के प्रवेश के लिए सक्षम बनाता है. इसके अलावा, जी न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ, हम अभिकर्मक दक्षता, का पता लगाएं, जो आमतौर पर 55% से अधिक निर्धारित करने में सक्षम हैं. यह एक सीधे ब्याज और उसके intracellular लक्ष्य की एंटीबॉडी के बीच बातचीत करने के लिए संबंधित hypotheses परीक्षण करने की अनुमति देता है. हालांकि यहां अध्ययन नहीं, फैब टुकड़े भी उपयोग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, प्रयोगों बनाया कि जांच अगर भड़काऊ साइटोकिन्स जोड़ने के रूप में संस्कृति शर्तों में फेरबदल expressi को प्रभावित करता हैपर या लिए intracellular लक्ष्य का स्थानीकरण.
कैसे एंटीबॉडी intracellular प्रतिजनों लक्ष्य हो सकता है जांच के चल रहे एक क्षेत्र है. प्रचलित सिद्धांत यह इंगित करता है कि चोट के बाद सेलुलर, intracellular प्रतिजनों अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, जो एंटीबॉडी लक्ष्य प्रतिजन के लिए उत्पादन के लिए अनुमति देता है उजागर कर रहे हैं. एंटीबॉडी SLE रोगियों में hnRNPs के लिए जवाब कैसे इस संभावना होता है की एक उदाहरण है. SLE रोगियों hnRNP p2 करने के लिए एंटीबॉडी और लक्ष्य कोशिकाओं की apoptosis पर hnRNP P2 कोशिका की सतह के लिए ले जाया जाता है जहां यह एक autoimmune 14 प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए उपलब्ध है. यह भी स्नायविक रोग में दिखाया गया था, जो अध्ययन का सुझाव दिया है है कि न्यूरॉन्स पर केवल सतह प्रतिजनों एक रोगजनक autoimmune प्रतिक्रिया 15, 16 के लिए लक्ष्य हो सकता है. अब इस विचार को चुनौती दी जा रही है. दिलचस्प है, वहाँ अब डेटा सुझाव है कि एंटीबॉडी एक मिलान विशिष्ट तरीके में न्यूरॉन्स में प्रवेश कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, autoimmune रेटिनोपैथी में, एकnti enolase एंटीबॉडी न्यूरॉन्स penetrated और enolase के समारोह में, एक cytoplasmic glycolytic 17 एंजाइम बदल. इसके अलावा, कड़ी व्यक्ति सिंड्रोम के एक मॉडल में, विरोधी amphiphysin एंटीबॉडी vivo में न्यूरॉन्स में प्रवेश किया, सह पूर्व synaptic मार्करों और बदल GABA 18 रिहाई के साथ स्थानीय. यह अद्वितीय और न्यूरॉन्स की संरचना और समारोह के लिए संबंधित हो सकता है. यहाँ प्रस्तुत की इन महत्वपूर्ण मुद्दों को संबोधित करने के लिए, के रूप में autoimmune रोग के रोगजनन करने के लिए अध्ययन जारी रखने के लिए और एक तरह अध्ययन बेहतर 9 समझ में आया.
hnRNP A1 एक intracellular 5 प्रतिजन, 9 है. इसलिए, हम एक तकनीक है कि हमें परीक्षण करने के लिए है कि विरोधी hnRNP A1 एंटीबॉडी neuronal शिथिलता में योगदान हो सकता है की अनुमति होगी की आवश्यकता है. क्योंकि hnRNP A1 autoantibodies एमएस और 3 / हाम टीएसपी रोगियों, 5-7, 9, 11 में पाया गया है, हम न्यूरॉन्स में विरोधी hnRNP A1 और नियंत्रण एंटीबॉडी ट्रांसफ़ेक्ट. हम इस बात की पुष्टि की कि एंटीबॉडी कोशिकाओं में प्रवेश किया और बादमाइक्रोएरे विश्लेषण (दोनों नियंत्रण आईजीजी और नियंत्रण के रूप में अछूता न्यूरॉन्स का प्रयोग करके) से पता चला है कि hnRNP A1 समारोह से संबंधित जीन बदल रहे थे, इस प्रकार की पुष्टि कि अभिकर्मक विरोधी hnRNP A1 समारोह 9 को बदल नहीं किया. महत्वपूर्ण बात है, आगे माइक्रोएरे विश्लेषण विरोधी hnRNP spastin, जो जब उत्परिवर्तित जीन बदल अभिव्यक्ति के साथ A1 एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के बीच एक संघ से पता चला है, एमएस और हैम / टीएसपी 9 रोगियों के नैदानिक phenotype mimics. इससे पता चलता है कि एंटीबॉडी अभिकर्मक कि परीक्षण intracellular लक्ष्य के लिए एंटीबॉडी सेलुलर कार्यों बदल सकते हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह SLE, आरए, और कैंसर से संबंधित paraneoplastic सिंड्रोम जैसे अन्य autoimmune रोगों के एक नंबर के साथ उपयोगिता है.
सारांश में, मज़बूती से जीवित कोशिकाओं में एंटीबॉडी transfect करने की क्षमता एंटीबॉडी समारोह, एंटीबॉडी के सवाल पूछने का अवसर प्रदान करता है: सामान्य और बीमारी की स्थिति के तहत कोशिकाओं के भीतर लक्ष्य बातचीत और लक्ष्य का स्थानीयकरण <./ P>
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के अनुसंधान और विकास के कार्यालय, मेडिकल रिसर्च सर्विस, दिग्गजों मामलों के विभाग द्वारा समर्थित है. इस अध्ययन में एक VA मेरिट समीक्षा पुरस्कार (एमसीएल) और विश्वविद्यालय टेनेसी स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र मल्टीपल स्केलेरोसिस रिसर्च फंड द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
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