Summary
Eine schnelle Annäherung an Interaktionen und Wirkungen auf molekularer Mechanismen in Bezug auf die Anwesenheit von Antikörpern in einer intrazellulären Umgebung untersucht wird beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Transfektion von Antikörpern in lebende Zellen mit einem nicht-kovalenten Komplex-Bildung auf einem Lipid Formulierung. Die Technik ist anpassbar an immortalisierten Zelllinien und primäre Zellen.
Abstract
Antikörper bieten die Möglichkeit, neue Einblicke in die verschiedenen Ereignisse in lebenden Systemen zu gewinnen. Die Fähigkeit, hochspezifische Antikörper zu produzieren Zielproteine wurde für sehr präzise biologischer Fragestellungen gelassen adressiert werden. Wichtigerweise haben Antikörper in die Pathogenese einer Reihe von menschlichen Erkrankungen, einschließlich systemischem Lupus erythematodes (SLE), rheumatoider Arthritis (RA), paraneoplastischen Syndromen, Multiple Sklerose (MS) und menschlichen T-lymphotropen Virus Typ 1 (HTLV-1) in Verbindung gebracht assoziierte Myelopathie / tropische spastische Paraparese (HAM / TSP) 1-9. Wie Krankheiten verursachen Antikörper ist ein Bereich der laufenden Untersuchung und Daten nahe, dass Wechselwirkungen zwischen Antikörpern und verschiedene intrazelluläre Moleküle führt zu Entzündung, zellulärer verändert Messaging und Apoptose 10. Es hat sich gezeigt, dass Patienten mit MS und HAM / TSP Autoantikörper produzieren, um die intrazelluläre RNA-Bindeprotein heterogenen ribonuclear Protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Neuere Daten weisen darauf hin, dass Antikörper, sowohl Intra-neuronale und Oberflächenantigene pathogenen 3, 5-9, 11 sind. So ein Verfahren, das für die Untersuchung der intrazellulären Antikörpers ermöglicht: Protein Interaktionen würde großen Einblick in Krankheitsentstehung verleihen.
Gene häufig in primären Zellen und Zelllinien in Kultur transfiziert wurde jedoch Transfektion von Antikörpern in Zellen durch Änderung des Antikörpers Struktur oder schlechte Transfektionseffizienz 12 behindert. Andere Transfektionsmethoden sind Antikörper Transfektion auf kationischen Liposomen (bestehend aus DOTAP / DOPE) und Polyethylenimine (PEI) bezogen, welche beide in einem Zehn-fache Abnahme der Antikörper Transfektion resultierte, verglichen mit Kontrollen 12. Das Verfahren unserer Studie durchgeführt ähnelt kationische Lipid-vermittelte Methoden und verwendet eine Lipid-basierten Mechanismus zur nicht-kovalente Komplexe mit den Antikörpern zu bilden, durch elektrostatische und hydrophobic Wechselwirkungen 13. Wir verwendeten Ab-deliverin Reagenz, das eine Lipidformulierung einfangen kann Antikörper durch nichtkovalente elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen und liefert sie innerhalb der Zellen ist. So chemischen und genetischen Kupplungen sind nicht notwendig für die Lieferung von funktionellen Antikörpern in lebenden Zellen. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, führen verschiedene Antikörper Tracing und Proteinlokalisierung Versuche sowie die Analysen der molekularen Folgen von intrazellulären Antikörper: Protein Wechselwirkungen 9.
In diesem Protokoll wird gezeigt, wie an Antikörper zu Neuronen transfizieren rasch, reproduzierbar und mit einem hohen Grad der Transfektionseffizienz. Als ein Beispiel verwenden wir anti-hnRNP A1 und Anti-IgG-Antikörpern. Für die einfache Quantifizierung der Transfektionseffizienz verwendet man Anti-Antikörper mit hnRNP A1 Atto-550-NHS und FITC-markierten-IgG markiert. Atto550 NHS ist ein neues Label mit hochmolekularen Absorption und Quanten-yield. Anregungsquelle und fluoreszierenden Filter für Atto550 ähneln Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Darüber hinaus hat Atto550 hohe Photostabilität. FITC-markiertes IgG wurden als Kontrolle verwendet, um anzuzeigen, dass dieses Verfahren vielseitig und nicht färben abhängig ist. Dieser Ansatz und die Daten, die erzeugt wird Verständnis der Rolle, dass Antikörper gegen Zielantigene intrazelluläre könnte in der Pathogenese von Erkrankungen des Menschen spielen, zu unterstützen.
Protocol
Ein. Antibody Labeling (Abbildung 1)
- Machen 0,1 M NaHCO 3-Puffer:
- 8,4 g NaHCO 3
- 29,2 g NaCl
- 1 Liter H 2 O
- Bringen der Puffer bis zu einem pH von 8,4 mit dieser Lösung (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 Liter H 2 0).
- Fügen Sie 35 ul Atto550 NHS bis 70 ul anti-hnRNPA1 und 500 ul NaHCO 3-Puffer und drehen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem einstündigen Rotation, spritzen die Mischung in einen Dialysator und dialysieren in 2 l PBS über Nacht.
- Am nächsten Tag konzentrieren die dialysierte Atto550 NHS anti-hnRNPA1 unter Verwendung eines Spin-Säule (Amicon Ultra 0.5).
- Nachdem die Atto550 NHS markierten Anti-Antikörper hnRNPA1 konzentriert worden ist, Nano-Drop Probe zur Bestimmung der Konzentration.
2. Antikörper Transfektion (Abbildung 2)
- Seed 10 5 Zellen / Well in 500 ul Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM/F12 +10% FBS +1% Antibiotikum) in einem 8 sowie Schlitten 24 Stunden vor der Transfektion. Zellkonfluenz sollte mindestens 70% betragen.
- Vierundzwanzig Stunden nach dem Aussäen, fügen 2 ul Ab-deliverin Reagenz in ein Eppendorf-Röhrchen.
- Anschließend fügen 2 ug Atto550 NHS markierten Anti-Antikörper hnRNPA1 (0,5 ug / ul) an dieselbe Eppendorfröhrchen Inkubation und 10-15 min bei RT.
- Während der Inkubation anzusaugen Medien und fügen 394 ml frisches DMEM-Medium zu den Zellen.
Hinweis: In 500 ul DMEM zu einer Kammer der unberührten Zellen als Kontrolle dienen.
- Nach der Inkubation mit 100 ul DMEM an den Antikörper Mischung, mischen durch Pipettieren rauf und runter, und fügen Sie zu den Zellen in DMEM mit einem Gesamtvolumen von 500 ul.
- Ändern Sie die Medien nach 48 h von Antikörper Lieferung.
Hinweis: Das Protokoll wurde mit FITC als positive Kontrolle markierten Rigg wiederholt.
3. Live und Fixed Imaging Effizienz bestimmen
- Bildzellen bei 48 h unter Verwendung der Cy3-Filter auf einem Fluoreszenzmikroskop Die zur Bebilderung der transfizierten Atto550 NHS markierten Antikörpern.
- Nach Live-Bildgebung abgeschlossen ist, saugen die Medien und fix Zellen.
- Nach Absaugen Medien behandeln Zellen mit 0,4% Paraformaldehyd für 15 Min. bei Raumtemperatur. Waschen der Zellen 4 x 5 min mit jeweils PBS. Dann montieren Zellen mit Eindeckmedium enthält DAPI Reagenz und fix Deckglas. Messen Transfektionseffizienz der fixierten Zellen mit AxioVision Software. Wenn Axiovision Software ist nicht auf der Hand, zählen Sie einfach die Ereignisse aus dem Bild mit der Hand und stecken Ergebnisse in die Berechnung bei 3,7. Alternativ kann ImageJ Software für diese Berechnungen verwendet werden.
- Erstens, die "Events"-Messung, um die Gesamtzahl der Zellen in Ihrem Bild der Wahl zählen 20-facher Vergrößerung.
- Weiter, verwenden Sie die "Events"-Messung, um die Zellen, die nicht zählenerfolgreich mit Antikörpern in der gleichen 20-facher Vergrößerung Bild transfiziert.
- Um die gemessenen "Events" in einer Excel-Stil-Format zuzugreifen, auf "Eigenschaften" klicken, klicken Sie auf die "Measurement"-Registerkarte, und klicken Sie auf, um anzuzeigen "Wie die Tabelle."
- Schließlich verwenden Sie die folgende Berechnung, um Ihre Transfektionseffizienz zu bestimmen, indem die beiden zuvor gemessenen Ereignisse: ((Summe Zellen - transfizierten Zellen) / Total Cells) x 100 = Transfektionseffizienz.
4. Repräsentative Ergebnisse
Die Live-Bilder von untransfizierten (3A) auf transfizierten (3B) Neuronen im Vergleich zeigen, dass die Markierung der Antikörper (rot oder grün in jeder Figur) ist klar innerhalb der Zellen (3B, C, D) beobachtet. Nach Absaugen und Waschen mit Medien, um Antikörper zwischen oder Anhänger der Oberfläche von Zellen zu entfernen, sind noch vorhandenen markierten Antikörpern in Neuronen (3C, D). Um die Transfektionseffizienz zu berechnen, verwenden Sie die Software AxioVision zur gesamten Zellen im Vergleich zu Zellen, die nicht erfolgreich transfiziert wurden zu berechnen. Diese Werte wurden in einen Transfektionseffizienz Formel, um die Transfektionseffizienz als Prozentsatz der gesamten Zellen (Abbildung 4) übernehmen wird.
Abbildung 1. Ablaufschema der Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit der Atto 550 NHS-Ester gefolgt von den Schritten erforderlich, um die markierten Antikörpern zu konzentrieren. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Ablaufschema der Verfahren verwendet werden, um markierte Antikörper in lebende Zellen in Kultur zu transfizieren.arge.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Live-Bilder der transfizierten Neuronen 48 hr nach Transfektion.
Abbildung 4. Behoben und Bilder gespült mit Ereignissen, um gezählt, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen.
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Discussion
Um Hypothesen über spezifische Moleküle und deren Expression zu testen, werden Gene und andere Vektoren üblicherweise in Zellen transfiziert. Die Besonderheit dieses Verfahrens ist die Fähigkeit, leicht transfizieren Antikörper in Zielzellen. Wir führten diese Methode in fünf getrennten Experimenten jeweils in Duplikaten. Transfektionseffizienz Ergebnisse waren ähnlich bei allen Experimenten. Insbesondere erlaubt der Verfahrenseintrag von Antikörpern in die Zelle ohne Veränderung Antikörper Struktur oder Funktion. Ferner wird bei der Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie lebender Neuronen, sind wir in der Lage, Transfektionseffizienz, die üblicherweise mehr als 55% zu ermitteln. Dies erlaubt es, Hypothesen direkt an der Wechselwirkung zwischen dem Antikörper von Interesse und deren intrazellulären Angriffspunkt verwandt testen. Obwohl keine Untersuchungen hier können Fab-Fragmente ebenfalls verwendet werden. Alternativ können Experimente, dass prüfen, ob Veränderung Kulturbedingungen wie das Hinzufügen von inflammatorischen Zytokinen beeinflusst expressi werdenauf oder Lokalisierung von intrazellulären Ziele.
Wie Antikörper könnten intrazelluläre Antigene Ziel ist ein kontinuierlicher Bereich der Untersuchung. Vorherrschende Theorie zeigt, daß nach zelluläre Verletzung, intrazelluläre Antigene an der adaptiven Immunantwort, die zur Antikörperproduktion auf das Ziel-Antigen ermöglicht freiliegen. Die Antikörper-Antwort auf hnRNPs bei SLE-Patienten ist ein Beispiel dafür, wie dies wahrscheinlich auftritt. SLE-Patienten zu machen Antikörpern gegen hnRNP P2 und bei der Apoptose von Zielzellen, hnRNP P2 wird zur Zelloberfläche transportiert, wo sie verfügbar, eine Autoimmunantwort 14 erzeugen. Dies wurde auch bei neurologischen Erkrankungen gezeigt, bei dem Studien vorgeschlagen, dass nur Oberflächenantigene auf Neuronen könnte Ziele für einen pathogenen Autoimmunantwort 15, 16 sein. Diese Idee wird nun in Frage gestellt. Interessanterweise gibt es nun Daten vor, dass Antikörper können Neuronen in einem Epitop spezifischen Weise einzugeben. Zum Beispiel wird in autoimmune Retinopathie, einenti-Enolase Antikörper eingedrungen Neuronen und verändert die Funktion der Enolase, eine zytoplasmatische glykolytischen Enzyms 17. Ferner wird in einem Modell der steif-Person-Syndrom, eingegeben Anti-Antikörper Amphiphysin Neuronen in-vivo-, Co-lokalisierten mit präsynaptischen Marker und veränderten GABA-Freisetzung 18. Das könnte im Zusammenhang mit der einzigartigen Struktur und Funktion der Nervenzellen. Studien wie die hier vorgestellte Lösung dieser wichtigen Fragen, wie der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen weiterhin untersucht und besser verstanden 9.
hnRNP A1 ist ein intrazelluläres Antigen 5, 9. Daher benötigten wir eine Technik, die es uns ermöglichen zu prüfen, ob anti-hnRNP A1 Antikörper könnten zu neuronalen Funktionsstörungen beitragen würde. Weil Autoantikörpern gegen hnRNP A1 bei MS und HAM / TSP Patienten 3, 5-7, 9, 11 gefunden, transfiziert wir Anti-hnRNP A1 und Kontroll-Antikörper zu Neuronen. Wir haben bestätigt, dass die Antikörper die Zellen eingegeben und nachMicroarray-Analysen (sowohl mit Kontroll-IgG und unberührte Neuronen als Kontrollen) zeigten, dass Gene, die mit hnRNP A1-Funktion verändert wurden, und bestätigt damit, dass die Transfektion nicht verändert anti-hnRNP A1 Funktion 9. Wichtig ist, zeigten weitere Mikroarrayanalysen einer Assoziation zwischen dem Anti-hnRNP A1 Antikörperreaktion mit veränderter Expression Spastin, ein Gen, das im Fall einer Mutation ahmt die klinischen Phänotyp von MS und HAM / TSP Patienten 9. Dies zeigt, dass Antikörper Transfektion verwendet werden, um zu testen, ob Antikörper gegen intrazelluläre Targets können zellulären Funktionen zu verändern. Dies hat Dienstprogramm mit einer Reihe anderer Autoimmunerkrankungen wie SLE, RA, und die krebsbedingte paraneoplastischen Syndromen.
Zusammenfassend bietet die Fähigkeit, zuverlässig transfizieren Antikörper in lebenden Zellen die Möglichkeit, Fragen von Antikörper-Funktion, Antikörper fragen:. Ziel-Interaktionen und Lokalisierung von Zielen innerhalb der Zellen unter normalen und Krankheitszuständen </ P>
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch das Office of Research and Development, Medical Research Service, Department of Veterans Affairs unterstützt. Diese Studie wurde von einer VA Merit Review Award (MCL) und der University of Tennessee Health Science Center Multiple Sclerosis Research Fund finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
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