Summary
心肌细胞核通过密度沉淀分离与1 pericentriolar材料（PCM-1）识别和排序流式细胞仪检测心肌细胞核抗体immunolabeled。
Abstract
鉴定心肌细胞的细胞核已在组织切片挑战，因为大多数的战略仅依靠细胞质标记蛋白1。在罕见的事件，如心肌细胞增殖和凋亡需要的心肌细胞的细胞核的准确识别，分析细胞在病理条件下的稳态和重建。在这里，我们提供了一种方法来隔离验尸组织密度沉淀和免疫标记抗体对pericentriolar材料（PCM-1）和随后的流式细胞仪分选心肌细胞核。这一战略使一个高吞吐量的分析与新鲜组织和冰冻的档案材料，同样的工作的优势和隔离。这使人们有可能已经在生物银行收集研究材料。这项技术是适用和广泛的物种进行测试，适用于多种下游应用，如碳14约会3，细胞CYCLE分析，可视化胸腺嘧啶核苷类似物（如BrdU和IDU）4，转录组和表观遗传分析。
Protocol
1。分离心脏核
- 外套超离心管（贝克曼离心管＃363664）10毫升1％BSA / PBS涂层解决方案。例管，并让他们旋转管旋转30分钟。删除的涂层解决方案，让空气干燥离心管（每管小鼠心脏单小鼠心脏，交替上升至5小鼠心脏或1克的心脏组织的分析，从不同的物种（如人类）可以处理在一管）。
- 以下所有步骤应在冰上进行。解剖用手术刀从新鲜或冷冻单元的小鼠心脏的左心室。请注意，此协议进行了优化，对小鼠心脏，但也可以适应老鼠或人类的心脏。另外，使用1克的心脏组织，从不同的物种。
- 用手术刀修剪成小隔间的标本。
- 组织块转移到一个50毫升的猎鹰裂解液15毫升钢管。
- 均质的心脏组织的T-25超Turrax探头均质（伊嘉）为10秒24,000转。
- 同等体积的裂解液30毫升稀释匀浆。
- 使用玻璃douncer（40毫升）进一步均质的组织和自由的原子核。执行一个大型的间隙杵八杆。
- 通过粗核隔离通过100μm和70μm的尼龙网格过滤器（BD Biosciences公司），连续。
- 原油核自旋向下隔离在一个冷冻离心机（4℃）10分钟在700 XG。
- 小心去除上清相管和擦拭纸巾筒内部。要小心不要打扰细胞核沉淀。
- 溶解粗核蔗糖缓冲5毫升的隔离，吸取解决方案几次上下。添加蔗糖缓冲另有25毫升溶解的颗粒。
- 加入10毫升新鲜制备的蔗糖缓冲涂层的超高速离心管（见第1.1步）。</ LI>
- 仔细覆盖重悬细胞核从步骤1.9的缓冲蔗糖溶解的颗粒蔗糖缓冲增加了10毫升。
- 之前，他们到JS13.1自由摆动转子平衡离心管中，并放入高速离心机（贝克曼阿凡提的S-25）的转子。
- 在4°C的自旋核样本为60分钟13,000 XG。
- 当自旋已完成，取出管小心从转子和丢弃反相管上清液和擦拭用纸巾管内剩余的碎片。
- 溶解在细胞核存储缓冲区（国安局加上缓冲区）1毫升的核颗粒。注：加国安局包含1.5毫米胺作为一种DNA稳定。
- 进行步骤2.1中，心肌细胞核染色。
2。免疫组织化学染色的流式细胞仪
- 准备染色阴性对照。以细胞核样品20μL出等分和DD 980μL国安局加缓冲。
- 在1:500稀释到immunolabel心肌细胞核的核样本加入反pericentriolar的材料1抗体（兔抗 - PCM-1，阿特拉斯抗体）。加入相同的稀释步骤2.1准备，作为反PCM-1抗体阴性对照同型抗体。
- 孵育4℃过夜，阴性对照和样品管。
- 阴性对照和样品洗净至少一次与国安局加缓冲（降速管在10分钟的700 XG在冷冻离心机（4℃），弃去上清和细胞核沉淀溶于1毫升国安局加缓冲）。
- 添加抗兔荧光二抗（FITC或APC）在1:1000稀释阴性对照和样品管。
- 在4°C孵育1小时阴性对照和样品管。
- 阴性对照和样品洗净至少一次与国安局，加上缓冲区（700 XG降速管在冷冻离心机（4℃）10分钟。弃上清和细胞核沉淀溶于1毫升国安局加缓冲）。
- 进行流式细胞仪分析和排序。
3。流式细胞仪
- 大衣核收集管（猎鹰15毫升），1％BSA / PBS溶液，然后再开始流式细胞仪分选步骤1.1中所述。
- 过滤器通过30微米的细胞过滤器的样品和阴性对照和加载第一个阴性对照，流式细胞仪（屋宇署流入）。定义界定汗衫和核（单核），基于前向散射（FSC），前向散射脉冲宽度（FS脉宽）和侧散射（SSC）（ 图2a和b）的第一和第二门。添加样品的DNA染色（DRAQ5（1:500）），可以帮助识别原子核人口的最初。
- 加载immunolabeled样品和定义的第三个门，隔离非心肌细胞的细胞核（PCM-1负）心肌细胞核（PCM-1，收集到阳性）。开始排序（ 图2c和d）。
可选：为了分析核DNA含量（套数），并进行细胞周期分析，添加适当的DNA染色的原子核（如赫斯特33342或DRAQ5），（ 图2e）。
- 经过流式细胞仪分选，放在冰核和重新分析，以确定排序纯度（ 图3a和b）。
- 在15分钟的冷冻离心机在1500 XG分类收集管核自旋向下。
- 细胞核沉淀溶解在缓冲区与下游应用兼容。
4。代表结果
细胞核形态和完整性可以通过DNA污渍和评估（ 图1）显微镜观察。评估成功的PCM-1的标签可以通过荧光显微镜和流式细胞仪（ 图1和图2c和d）。 PCM-1-positive和消极的人群应彼此分开（ 图2c和d）。约30％的所有核应该在小鼠左心室心肌细胞核（ 图2d）。排序纯度可通过重新分析排序的细胞核（ 图3a和b）评估。两个原子核的人群应该有一个排序纯度超过95％。
图1。 PCM-1识别心肌细胞核。心肌细胞核（一）与PCM-1（B）和Nkx2.5（三）在成年鼠心脏的抗体染色。 （四）PCM-1标记的细胞核周围心肌细胞的细胞质（肌球蛋白重链（MHC））和心肌细胞核的准确识别，记录PCM-1染色（比例尺为20μm和10表达的转录因子Nkx2.5微米（D，插图））。 （五）心肌细胞核分离可视化与DNA染色DRAQ5。 （f和g）CardiomyocYTE细胞核标记抗体对PCM-1（比例尺为10微米）。请注意，PCM-1 epinuclear染色组织切片的心肌细胞的细胞核和孤立的细胞核（箭头）模式。
图2。流式细胞仪分选 （一） 心肌细胞的细胞核。心肌细胞核确定前向散射（FSC）和侧散射（SSC）。 （二）第二个门标识单核FSC和FS脉冲宽度5。 （C，D）荧光门使心肌细胞核的分离（PCM-1-阳性）和非心肌细胞（PCM-1负），从心脏组织的细胞核。 （五）鼠心肌细胞大多（> 80％）二倍体（2n），只有一小部分是四倍体（4N）6。请注意，人类心肌细胞中含有的多倍体核的频率较高（> 2N）7,8。
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Discussion
心肌细胞核的准确鉴定为2,3在心肌再生过程的分析是至关重要的。主要是基于传统技术从新鲜组织分离的心肌细胞细胞外基质蛋白消化酶和随后的间质细胞，低速离心净化。从胚胎干细胞（ESC）的生活心肌的进一步净化可进行免疫标记表面标志物，如9或10 SIRPA线粒体染料，固定的心肌细胞可以识别如肌球蛋白重链（MHC）或核蛋白质，如细 胞质标记GATA4或Nkx2.5。然而，Nkx2.5和GATA4的表达并不局限于成熟的心肌细胞，但也可以在祖细胞中检测到，在发展过程中和心肌梗死后11,12。遗传策略，以确定心肌特异性最高，但Cannot适用于大型动物模型或人类1。现有战略的局限性，导致依靠量化罕见的事件，如细 胞增殖，凋亡和嵌合体1,13争议的结论。因此，有必要建立一个准确的策略，以识别和纯化成熟分化的心肌细胞核。
在这里，我们描述了一个净化技术的基础上pericentriolar材料（PCM-1）。以前，我们加强 我们的核隔离的有效性，显示三个独立的核标记，PCM-1，我和心肌钙蛋白T，找出相同的心肌人口2,3纯化人口表明了心肌细胞的特定基因产物的高浓缩铀等肌钙蛋白，肌球蛋白重链蛋白和转录因子Nkx2.5和GATA4 2,3。
目前的协议，PCM-1的基础上，已成功地应用于f分析人类和小鼠的心肌细胞的营业额2,4以及分析心肌转录剖面2。我们预期，也可以适应来自其他物种的心肌细胞的隔离所提出的战略。 PCM-1，一个中心体蛋白，重新定位于核膜的积累，形成不溶性基质，仅在2,14分化的心肌细胞（ 图1）。流式细胞仪可以快速大量的细胞，这是需要量化罕见的事件，如心肌细胞凋亡和细胞周期重新进入15不偏不倚的分析。此外，核苷类似物（如尿嘧啶）的增殖实验，可随时申请使用我们提出的技术4。我们的技术优势，可以在多核心肌16,17，提供了重要的信息进行分析的DNA含量的单一心肌细胞的细胞核（核套数）鉴别心肌重复和polyploidisation 6-8。然而，由于我们的战略性质，心肌细胞多核化的特征是不可能的。
该方法的进一步应用染色质的表观遗传变化，核蛋白，protein-DNA/RNA相互作用和核转录18,19重点研究。
由于组织冻融稳定的原子核，所提出的核隔离策略也可以应用于冷冻组织，使它能够利用生物银行存档的材料。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢马塞洛·托罗用流式细胞仪的协助下。这项研究是由瑞典的心脏和肺脏基金会，欧盟委员会第七框架计划“CardioCell”，瑞典研究理事会，亚洲电影大奖保险和ALF的支持。转播是由德意志研究联合会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
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