Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Summary

Cardiac Kerne über Dichte Sedimentation isoliert und mit Antikörpern gegen immunmarkiert pericentriolar Material 1 (PCM-1) zu identifizieren und zu sortieren Kardiomyozyten Kerne durch Durchflusszytometrie.

Abstract

Identifizierung von Kardiomyozyten Kerne hat in Gewebeschnitten Herausforderung gewesen, da die meisten Strategien nur auf zytoplasmatische Markerproteine ^​​1 verlassen. Seltene Ereignisse in Herzmuskelzellen wie Proliferation und Apoptose erfordern eine genaue Identifizierung von Kardiomyozyten-Kerne auf die Zellerneuerung in der Homöostase und bei pathologischen Zuständen ² zu analysieren. Hier stellen wir eine Methode, um Kardiomyozyten Kerne aus post mortem Gewebe zu isolieren durch Sedimentation und Dichte Immunomarkierung mit Antikörpern gegen pericentriolar Material 1 (PCM-1) und anschließende Durchflusszytometrie-Sortierung. Diese Strategie ermöglicht einen hohen Durchsatz-Analyse und Isolation mit dem Vorteil bei der Arbeit ebenso gut auf frischen und gefrorenen Gewebe Archivalien. Dies macht es möglich, das Material bereits in Biobanken gesammelten studieren. Diese Technik ist und die Messung in einer Vielzahl von Arten und mehrfach Downstream-Anwendungen, wie ^{Kohlenstoff-14-3,} Zell-cycle-Analyse ^4, Visualisierung von Thymidin-Analoga (zB BrdU und IdU) ^4, Transkriptom-und epigenetische Analyse.

Protocol

1. Die Isolierung des Herz-Kerne Mantel Ultrazentrifuge Rohre (Beckman Zentrifugenröhrchen # 363.664) mit 10 ml 1% BSA / PBS Beschichtungslösung. Verschließen Sie die Röhrchen und lassen Sie sie für 30 min in einem Rohr Rotator drehen. Entfernen Sie die Beschichtungslösung und lassen Sie die Zentrifugenröhrchen Luft trocknen lassen (eine Tube pro Maus Herz für die Analyse der einzelnen Mäuseherzen, abwechselnd bis zu 5 Mäuseherzen oder 1 g Herzgewebe von einer anderen Spezies erforderlich ist (z. B….

Discussion

Genaue Identifizierung der Kardiomyozyten Kerne ist entscheidend für die Analyse der regenerativen Vorgänge im Myokard ^2,3. Herkömmliche Techniken zu Kardiomyozyten aus frischem Gewebe zu isolieren sind hauptsächlich auf enzymatischen Abbau von Proteinen der extrazellulären Matrix und die anschließende Reinigung in der interstitiellen Zellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit basiert. Die weitere Reinigung des lebenden Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen (ESC) Immunmarkierung mit …

Materials

1. Lysis Buffer

Name of the reagent

0.32 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM CaCl2

5 mM magnesium acetate

2.0 mM EDTA

0.5 mM EGTA

1 mM DTT

2. Sucrose buffer

Name of the reagent

2.1 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM magnesium acetate

1 mM DTT

3. Nuclei storage buffer (NSB plus)

Name of the reagent

0.44 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 mM KCl

10 mM MgCl2

1.5 mM spermine

Reagents and Equipment	Company
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415	Abcam
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374	Atlas Antibodies
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm	BD Biosciences
Glass douncer (40 ml) and pestle “L”	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer	IKA Germany
Dispersing tool S25 N-18 G	IKA Germany
Beckman Avanti Centrifuge	Beckman Coulter
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml	VWR
Beckman Centrifuge Tubes #363664	Beckman Coulter
JS13.1 free swinging rotor	Beckman Coulter
Influx cytometer	Beckman Coulter
Tube Rotator	VWR