Summary
Etablering af en orthotopisk blæretumor model til at vurdere antitumor virkninger af intravesikalt leveret Särna og overvågning tumorvækst ved hjælp af ultralyd og bioluminiscerende billedbehandling.
Abstract
Vi præsenterer en ny fremgangsmåde til behandling af blærecancer med intravesikalt leveret lille aktiverende RNA (Särna) i en orthotopisk xenotransplantat muse blæren tumormodel. Den musemodel er etableret af urethral kateterisation under inhaleret narkose. Kemisk forbrænding indføres derefter til blæren ved hjælp intravesical sølvnitratopløsning at forstyrre blæren glycosaminoglycan lag og tillader celler at vedhæfte. Efter adskillige vaske med sterilt vand, human blærekræft KU-7-luc2-GFP-celler instilleret gennem kateteret ind i blæren for at hvile i 2 timer. Efterfølgende vækst af blæretumorer bekræftes og overvåges af in vivo blæren ultralyd og bioluminiscerende billedbehandling. De tumorer behandles derefter intravesikalt med Särna formuleret i lipidnanopartikler (LNPs). Tumor vækst overvåges med ultralyd og bioluminescens. Alle trin i denne procedure er vist i den ledsagende video.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr emner er blevet godkendt af Institutional Animal Care og Use Committee (IACUC) ved University of California, San Francisco.
1. Cellepræparat
- Den humane blærecancer cellelinie KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) dyrkes i RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 50 pg / ml gentamicin.
- Kulturerne holdes ved 37 ° C, 5% CO2 med mediet ændrer hver to til tre dage.
- Cellerne blev høstet ved trypsin-spaltning og tælles under anvendelse af et hæmocytometer. En enkelt cellesuspension på 2 x 10 6 celler i 50 pi blev fremstillet i phosphatbufret saltvand og opbevaret på is.
2. Orthotopisk blæretumor Model
- Kvindelige nøgne (nu / nu)-mus 8-10 uger gamle (Simonsen Laboratory, Gilory, CA) blev anvendt.
- Placer et sterilt forklæde over en varmepude til at tjene enSA kirurgisk platform. Steril smøre gelé, 24-gauge katetre med stilet nåle, sølvnitratopløsning og sterilt vand er forberedt.
- Generel anæstesi induceres i mus med inhaleret isofluran (3% til induktion, 1-2% vedligeholdelse) og opretholdt ved hjælp af en næsekegle. Sterile oftalmiske salve påført på dyrets øjne, og en varmepude anvendes til at opretholde kropsvarme.
- Placer musen i liggende stilling.
- Forsigtigt fat i dyrets vulva med en pincet til stabilisering.
- Ved anvendelse af en 24-gauge intravenøs kateter med nålen fjernes stiletten er muse urinrøret kateteriseret. Rigelig smøring skal anvendes. Med muse liggende, er urinrøret placeret umiddelbart bag de vulva folder og anterior til vagina. En vinkel på 45 grader til at begynde taget for at kanyle urinrøret og passerer under skambenet. En mere flad vinkel tages derefter at passere gennem urinrøret i blæren. Blide bækken presHusk at rette urinrøret kan ofte hjælpe. Omhu må udvises for at undgå at skubbe for hårdt mod modstand, da dette kan føre til urethral eller blære perforering. Urin ses i kateteret bekræfter dets placering inden i blæren lumen.
- Aspirere urin fra kateteret og blæren lumen ved hjælp af stiletten nålen. Stiletten nål anvendes til alle efterfølgende ønsker og injektioner, hvilket efterlader kateteret på plads. Dette muliggør injektion af nøjagtige mængder ved at eliminere døde-rummet inden i kateteret, og det gør gentagne catheterizations unødvendig.
- At forringe glycosaminoglycan lag af blæren urothelium, er 10 pi 0,5 M sølvnitrat injiceret og fik lov at hvile i 10 sekunder. Dette kan danne et hvidt bundfald med resterende urin.
- Aspirer og kassér bundfaldet og blære indhold ved hjælp en stilet nål.
- Vask blæren ved at injicere 100 pi sterilt vand. Aspirer og kassér vandet. Tre gentagelser endteved vask med sterilt vand 3 gange for i alt 4 vaske.
- Placere en 4-0 silkeslips omkring urinrørsåbningen at okkludere urinrøret som forberedelse til fjernelse af kateter.
- Injicer tidligere fremstillet 2 x 10 6 KU-7-luc2-GFP-celler i 50 pi ved hjælp af stiletten nål.
- Samtidigt fjerne kateteret og stiletten nålen, hvorved urinrøret okkluderet af silkeslips.
- Musen vil blive opretholdt under fuld narkose i 2 timer før silkeslips fjernes, og dyret vækkes.
3. Ultralyd
- Generel anæstesi induceres med forstøvet isofluran og opretholdt ved hjælp af næsekeglen.
- En VisualSonics Vevo 770 In Vivo høj opløsning Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada) med RMV-704 40 MHz probe blev brugt.
- Placer musen i liggende position på ultralyd platformen.
- Fastgør dyrets bagbenmed tape for at undgå overskydende bevægelse under manipulation af ultralydsonden.
- Anvendelse ultralyd gel til musen bækkenet.
- Lavere en RMV-704 (40 MHz) ultralydssonden på musen bækken for at få tværgående eller langsgående billeder.
- Hvis tumor er fundet, kan billederne gemmes til måling af tumor dimensioner.
4. Bioluminescent Imaging
- Udføre intraperitoneal injektion af 200 pi (150 mg / kg) luciferin substrat.
- Fremkald generel anæstesi med forstøvet isofluran og vedligeholde via næse kegle.
- Anbring mus i liggende stilling i bioluminescens Imager.
- Fem minutter efter luciferin injektion måle bioluminescens fra dyret fotoner per sekund.
5. Sarna Forberedelse
- Syntetisere RNA-oligonukleotider på en skala på 50-100 pmol.
- Annealing komplementære enkeltstrengede oligonukleotider inationale Tempus-kontorer duplex saRNAs.
- Lipid-nanopartikler (LNP)-Särna fremstilles med det ioniserbare lipid 1,2-dilinoleyl-4-(2 - dimethylaminoethyl) - [1,3]-dioxolan (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl cholin, kolesterol og PEG-DMG ved hjælp af en spontan dannelse af vesikler formulering procedure som tidligere beskrevet. en
6. Intravesikal administration af formulerede Sarna
- Efter etablering af orthotopisk blæren tumormodel behandles mus med intravesical lille aktiverende RNA (Särna) formuleret i lipidnanopartikler (LNPs) (tabel 1).
- Generel anæstesi etableres og opretholdes med fordampet isofluran, og sterile oftalmiske smøremiddel påføres.
- Placer dyret i liggende stilling.
- Udføre urethral kateterisering som tidligere beskrevet.
- Placer en 4-0 silkeslips omkring urinrøret og kateter.
- Aspirere al urin fra kateteret ogblæren ved hjælp af en tom sprøjte og stiletten nål.
- Injicere LNP-Särna intravesikalt for en total dosis på 50 pi (3 mg / kg). Samtidigt fjerne kateteret og stiletten nålen, hvorved urinrøret okkluderet af silkeslips.
- Mus forbliver bedøvet med urinrøret okkluderet i 2 timer.
- Behandling med intravesikale LNP-Särna blev påbegyndt på dag 4 efter tumorimplantation. Mus blev behandlet serielt hver 3. dag, i alt 14 behandlinger.
7. Repræsentative resultater
Blæretumorer stammer fra Ku-7-luc2-GFP-celler kan overvåges ved luciferase bioluminescerende billeddannelse (fig. 1A og C) og blæren ultralyd (fig. 1B og D). Tumorer er ofte påvises inden for 3-5 dage efter celleinokulering. Vi fandt vellykket blære tumorimplantation i over 90% af musene. Som behandling med intravesical dsRNA ensues kan progressionen af tumoren skal overvåges with disse modaliteter. Efter at dyret er aflivet, kan tumorvækst også bekræftes ved hjælp af GFP-fluorescens. I almindelighed betyder bioluminescens korreleret med en gennemsnitlig ultralyd dimensioner for blæretumorer, som det ses visuelt i fig 1C og 1D. Men efter blev dyrene aflivet, og tumoren blev bekræftet ved GFP, fandt vi, at bioluminescens korreleret nærmere med tilstedeværelsen af levedygtig tumor end gjorde ultralyd målinger. Dette var især udtalt blandt mus behandlet med Särna (i modsætning til kontroller), fordi resterende arvæv hos behandlede mus var ofte visualiseret ved ultralyd, men kunne ikke skelnes fra levende tumor.
Figur 1. Tumor vækstkinetik af blæretumorer. (A) Bioluminescence billedbehandling måler luciferaseaktiviteten inden blæretumorer at bekræfte deres placering og vækst. (B) In vivo blæren ultrasound under anvendelse af en 40 MHz probe frembringer tumorer billeder, hvis dimensioner kan måles nøjagtigt. (C) grafer, der illustrerer tumorens gradvise stigning i Bioluminescence and ultralyd dimensioner. Værdier repræsenterer betyder (+ / - standardafvigelse) målinger fra 6 dyr. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer en protokol til etablering af en mus ortotopisk xenograft blæretumor model efterfulgt af intravesikal behandling af tumorer med LNP formuleret Särna der retter sig mod promotor af p21 CIP1/WAF1 (p21) for transkriptionsaktivering. 2, 3 De fremkomne tumorer kan være bekræftet og overvåges med bioluminiscerende billedbehandling og blære ultralyd. Orthotopisk model kan være overlegne i forhold til intraperitoneal, subkutan eller intravenøs modeller ved at tilvejebringe et miljø af urin og urothelium, at mere naer endogen blærecancer. En række orthotopisk mus blæretumorer er blevet etableret under anvendelse af både direkte blærevæggen indsprøjtning samt intravesikal instillation. 4-8 intravesikal instillation af tumor, som vist her, mere nøje efterligner humane blæretumorer, der begynder på overfladen i slimhindeepitelet og vokse dybere som de fremskridt. Vores fremgangsmåde til anvendelse af sølvnitrat til at rumme BLADDers til tumoroptagelse er billig og teknisk enkel.
Hadaschik et al. Beskrev intravesikal af blæretumorer i mus og rapporterede pålidelig bioluminiscerende tumor vurdering. 5 Vi ligeledes fundet høje vellykket tumorimplantering med kateterisation og celle instillation. Vore tumorer blev ikke kun bekræftet med bioluminescens, men også med in vivo blæren ultralyd, hvilket giver en yderligere fremgangsmåde til kvantificering tumorudvikling.
I denne protokol, noterer vi en række ændringer til andres teknik. Vi anvendte instillation sølvnitratopløsning at forstyrre blæren ekstracellulære glycosaminoglycan lag for tumorcelleimplantation stedet for elektrokauterisation. Vi fandt, at dette er en billig, enkel og pålidelig metode, minimeres risikoen for brugerfejl. Under ultralyd evaluering af blæren, fandt vi det unødvendigt at udføre urethral kateteriseringforhånd. Så længe dyret ikke var blevet udsat for betydelige nød til at forårsage vandladning, før de undergår anæstesi blev mus blæren pålideligt udspilet under billeddannelse at muliggøre en fremragende tumor visualisering. Uden tvivl var urethral kateterisation den mindst troværdige skridt af protokollen. Det er vores erfaring, er kateterisering af atymiske nøgne mus vanskeligere end i C57 mus. Men med den teknik, der beskrives i denne protokol og video, blev over 90% af dyrene gentagne gange kateteriseres succes for både tumor instillation og behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
LCL er en navngiven opfinder den verserende patentansøgninger relateret til Särna, som er blevet indgivet af University of California San Francisco og har licens til Alnylam Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Denne forskning er finansieret af AACR Henry Shepard Blære Cancer Research Grant (09-60-30-LI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
- Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
- Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).
- Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).
