Summary
De oprichting van een orthotope blaas tumor model om anti-tumor effecten van intravesicaal geleverd Sarna en monitoring groei van de tumor door middel van ultrageluid en bioluminescente beeldvorming te evalueren.
Abstract
We presenteren een nieuwe methode voor de behandeling van blaaskanker met intravesicaal afgeleverd kleine activerende RNA (Särna) in een orthotope xenograft muis blaas tumor model. De muis model wordt vastgesteld door urethrale catheterisatie onder inhalatie-narcose. Chemische brandwonden wordt vervolgens naar de blaas slijmvlies met behulp van intravesicale zilvernitraatoplossing om de blaas te glycosaminoglycaan laag verstoren en maakt het mogelijk cellen te hechten aan. Na enkele wasbeurten met steriel water, menselijke blaaskanker KU-7-luc2-GFP cellen worden bijgebracht door de katheter in de blaas te wonen gedurende 2 uur. Na de groei van blaastumoren wordt bevestigd en gecontroleerd door in vivo blaas echografie en bioluminescente beeldvorming. De tumoren worden dan intravesicaal behandeld met Särna geformuleerd in lipide nanodeeltjes (LNPs). Groei van de tumor wordt gecontroleerd met echografie en bioluminescentie. Alle stappen van deze procedure worden aangetoond in de bijgevoegde video.
Protocol
Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Californië, San Francisco.
1. Celpreparaat
- De menselijke blaaskanker cellijn KU-7-luc2-GFP (Remklauw Life Sciences, Hopkinton, MA) gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 50 pg / ml gentamicine.
- Cultures op 37 ° C, 5% CO2 met medium verandert elke twee tot drie dagen.
- De cellen werden geoogst door trypsine spijsvertering en geteld met behulp van een hemocytometer. Een celsuspensie van 2 x 10 6 cellen in 50 ul werd bereid in met fosfaat gebufferde zoutoplossing en op ijs bewaard.
2. Orthotope Blaas Tumor Model
- Vrouwelijk naakt (nu / nu) muizen 8-10 weken oud (Simonsen Laboratory, Gilory, CA) werden gebruikt.
- Plaats een steriel laken meer dan een verwarmingselement aan een dienstis een chirurgische platform. Steriel glijmiddel, 24-GEKOME TEKST katheters met stilet naalden, zilvernitraatoplossing, en steriel water worden bereid.
- Narcose wordt geïnduceerd in de muizen met geïnhaleerde isofluraan (3% inductie 1-2% voor onderhoud) en onderhouden via neuskegel. Steriele oogzalf wordt toegevoerd aan ogen van het dier en een warmte pad wordt de lichaamswarmte handhaven.
- Plaats de muis in rugligging.
- Voorzichtig te begrijpen van het dier vulva met een pincet om te stabiliseren.
- Met behulp van een 24-GEKOME TEKST intraveneuze katheter met de verwijderde naald stilet, wordt de muis plasbuis gecatheteriseerd. Voldoende smering moet worden gebruikt. Met de muis rugligging, wordt de plasbuis zich direct plaatsvond na de vulva plooien en juist voor de vagina. Een hoek van 45 graden initieel genomen om de urethra canule en passeren onder het schaambeen. Een kleine hoek wordt genomen door de urethra overgaan in de blaas. Zachte bekken drukervoor dat u recht de urinebuis kan vaak helpen. Er moet worden genomen om te voorkomen dat te hard duwen tegen weerstand, omdat dit kan leiden tot urethra of blaas perforatie. Urine gezien binnen de katheter bevestigt haar locatie in de blaas lumen.
- Zuig urine van de katheter en de blaas lumen met behulp van de stilet naald. De stilet naald wordt bij alle volgende verlangens en injecties, waardoor de katheter plaats. Hierdoor injectie van nauwkeurige volumes, doordat het dode ruimte binnen de katheter, en maakt herhaald katheterisaties overbodig.
- Om de glycosaminoglycaan laag van de blaas urotheel schaden, wordt 10 pi van 0,5 M zilvernitraatoplossing geïnjecteerd en toegestaan om te wonen voor 10 seconden. Dit kan vormen een witte neerslag met de rest van urine.
- Zuig en gooi de neerslag en de blaas de inhoud met behulp van een stilet naald.
- Was de blaas door het injecteren van 100 ul steriel water. Zuig en gooi het water. Repebij wassen met steriel water 3 keer voor een totaal van 4 wasbeurten.
- Plaats een 4-0 zijden stropdas rond de urethrale meatus om de urinebuis af te sluiten ter voorbereiding van katheter verwijderen.
- Injecteer eerder bereide 2 x 10 6 KU-7-luc2-GFP-cellen in 50 ul met behulp van de stilet naald.
- Tegelijkertijd verwijdert de katheter en stilet naald, waardoor de urinebuis afgesloten door de zijden das.
- De muis zal worden gehandhaafd onder algemene verdoving voor 2 uur voor de zijden stropdas wordt verwijderd en het dier wordt gewekt.
3. Ultrageluid
- Algemene anesthesie wordt geïnduceerd met verdampte isofluraan en onderhouden via neuskegel.
- Een VisualSonics Vevo 770 in vivo met hoge resolutie Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada) met de RMV-704 40 MHz probe werd gebruikt.
- Plaats de muis in liggende positie op de echografie platform.
- Zet het dier achterpotenmet tape om het teveel aan beweging te vermijden tijdens het manipuleren van het echoapparaat.
- Breng echografie gel om de muis te bekken.
- Laat een RMV-704 (40 MHz) ultrasone sonde op de muis bekken om dwars-of langsrichting beelden te verkrijgen.
- Als tumor wordt gevonden, kunnen de beelden worden opgeslagen voor het meten van de tumor dimensies.
4. Bioluminescente Imaging
- Voer intraperitoneale injectie van 200 ul (150 mg / kg) luciferine substraat.
- Laten narcose met verdampte isofluraan en te onderhouden via de neuskegel.
- Plaats muizen in liggende positie binnen de bioluminescentie imager.
- Vijf minuten na luciferine injectie, het meten van de bioluminescentie van het dier in fotonen per seconde.
5. Sarna Voorbereiding
- Synthetiseren RNA oligonucleotiden op een schaal van 50-100 mol.
- Gloei complementaire enkelstrengs oligonucleotiden iNTO duplex saRNAs.
- Lipide-nanodeeltjes (LNP)-Sarna bereid met de ioniseerbare lipide 1,2-dilinoleyl-4-(2 - dimethylamino) - [1,3]-dioxolaan (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl choline, cholesterol en PEG-DMG met een spontane vesicles formulering procedure als eerder beschreven. een
6. Intravesicale toediening van geformuleerde Sarna
- Na oprichting van de orthotope blaas tumor model worden muizen behandeld met intravesicale kleine activerende RNA (Särna) geformuleerd in lipide nanodeeltjes (LNPs) (tabel 1).
- Narcose wordt opgesteld en bijgehouden met verdampte isofluraan, en steriele oftalmologische smeermiddel wordt toegepast.
- Plaats het dier in rugligging.
- Voer urethrale catheterisatie zoals eerder beschreven.
- Plaats een 4-0 zijden stropdas rond de plasbuis en katheter.
- Zuig alle urine van de katheter enblaas met behulp van een lege spuit en stilet naald.
- Intravesicaal Injecteer LNP-Sarna voor een totale dosis van 50 pL (3 mg / kg). Tegelijkertijd verwijdert de katheter en stilet naald, waardoor de urinebuis afgesloten door de zijden das.
- De muis blijft verdoofd met de urethra opgesloten gedurende 2 uur.
- Behandeling met intravesicale LNP-Sarna begon op dag 4 na tumor implantatie. Muizen werden serieel behandeld elke 3 dagen, een totaal 14 behandelingen.
7. Representatieve resultaten
Blaastumoren als gevolg van de KU-7-luc2-GFP-cellen kan gevolgd worden door luciferase bioluminescente beeldvorming (figuur 1A en C) en blaas echografie (figuur 1B en D). Tumoren zijn vaak waarneembaar binnen 3-5 dagen na de inenting cel. We vonden succesvolle blaas tumor implantatie in meer dan 90% van de muizen. Als de behandeling met intravesicale dsRNA volgt, kan de progressie van de tumor worden gecontroleerd wie deze modaliteiten. Nadat het dier is geslacht, kan groei van de tumor ook worden bevestigd met behulp van GFP-fluorescentie. In het algemeen betekent bioluminescentie gecorreleerd met gemiddelde afmetingen ultrasone blaastumoren zoals visueel gezien in fig. 1C en 1D. Na dieren gedood en tumor werd bevestigd door GFP, vonden wij dat bioluminescentie nauwer gecorreleerd met de aanwezigheid van levensvatbare tumor dan wel echometingen. Dit was vooral duidelijk bij muizen behandeld met Sarna (in tegenstelling tot controles), omdat resterende littekenweefsel in behandelde muizen was vaak gevisualiseerd door middel van ultrageluid, maar kon niet worden onderscheiden van de live-tumor.
Figuur 1. Tumor groeikinetiek van blaastumoren. (A) bioluminescentie meet de luciferase-activiteit binnen de blaastumoren te bevestigen hun locatie en groei. (B) In vivo blaas ultrasound het gebruik van een 40 MHz probe produceert tumor beelden waarvan de afmetingen nauwkeurig kan worden gemeten. (C) Grafieken ter illustratie van de tumor de progressieve toename van de bioluminescentie en echografie afmetingen. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelde (+ / - standaarddeviatie) metingen van 6 dieren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een protocol voor de oprichting van een muis orthotope xenograft blaas tumor model, gevolgd door intravesicale behandeling van de tumoren met LNP geformuleerd Sarna dat de promotor van p21 cip1/waf1 (p21) richt zich voor transcriptionele activering. 2, 3 De resulterende tumoren kan bevestigd en bewaakt met bioluminescente beeldvorming en blaas echografie. Orthotope modellen kunnen beter intraperitoneaal, subcutaan of intraveneus modellen door een milieu van urine en urotheel die beter endogene blaaskanker benadert. Een verscheidenheid van orthotope muis blaastumoren zijn vastgesteld met behulp van zowel directe blaaswand injectie en intravesicale instillatie. 4-8 Intravesicale instillatie van de tumor, zoals hier blijkt, nauwer bootst de menselijke blaas tumoren die oppervlakkig beginnen in het mucosale epitheel en groeien dieper als ze vooruitgang. Onze methode van het gebruik van zilvernitraat aan blad tegemoetders voor tumor opname is goedkoop en technisch eenvoudig.
Hadaschik et al.. Beschreven intravesicale instillatie van blaastumoren in muizen en gerapporteerd betrouwbare bioluminescente tumor beoordeling. 5 We vonden eveneens een hoog percentage succesvolle implantatie tumor door middel van catheterisatie en cel instillatie. Onze tumoren werden niet alleen bevestigd met bioluminescentie, maar ook met in vivo blaas echografie, die een extra methode voor het kwantificeren van progressie van de tumor.
In dit protocol, merken wij op diverse wijzigingen van anderen techniek. We gebruikten het indruppelen van de zilvernitraatoplossing om de blaas te extracellulaire glycosaminoglycaan laag voor tumorcel implantatie, in plaats van elektrocauterisatie verstoren. We vonden dit een goedkope, eenvoudige en betrouwbare methode die potentieel voor fouten van gebruikers tot een minimum beperkt zijn. Tijdens de echo van de blaas, we vonden het niet nodig om urethrale katheterisatie uit te voerentevoren. Zolang het dier niet was blootgesteld aan significante mate lijden aan het plassen veroorzaken voor het ondergaan van anesthesie, werd de muis blaas betrouwbaar opgezwollen tijdens de beeldvorming te zorgen voor een uitstekende tumor visualisatie. Zonder twijfel, urethrale katheterisatie was de minst betrouwbare stap van het protocol. In onze ervaring, catheterisatie van athymische naakt muizen is moeilijker dan in C57 muizen. Echter, met de techniek beschreven in dit protocol en video, werden meer dan 90% van de dieren herhaaldelijk met succes gecatheteriseerd voor zowel de tumor instillatie en behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
LCL is een benoemde uitvinder op octrooi-aanvragen met betrekking tot Sarna die zijn ingediend door de Universiteit van Californië in San Francisco en in licentie gegeven aan Alnylam Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt gefinancierd door de AACR Henry Shepard Bladder Cancer Research Grant (09-60-30-LI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
- Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
- Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).
- Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).
