Summary
Stabilire un modello di tumore della vescica ortotopica per valutare gli effetti antitumorali di sarna via endovescicale consegnate e monitoraggio della crescita tumorale con l'ecografia e imaging bioluminescente.
Abstract
Presentiamo un nuovo metodo per il trattamento del cancro della vescica con attivante RNA via endovescicale consegnato piccolo (sarna) in un modello murino ortotopico eterotrapianto tumore della vescica. Il modello murino è stabilito dal cateterismo uretrale sotto anestesia generale per via inalatoria. Combustioni chimiche viene quindi introdotto alla mucosa della vescica utilizzando intravescicale soluzione di nitrato d'argento di distruggere lo strato di glicosaminoglicani vescica e permette alle cellule di allegare. Dopo alcuni lavaggi con acqua sterile, cancro della vescica umana KU-7-luc2-GFP cellule sono instillati attraverso il catetere in vescica di sosta per 2 ore. Successiva crescita dei tumori vescicali è confermata e monitorata da ecografia vescicale in vivo e di imaging bioluminescente. I tumori vengono poi trattati per via endovescicale con sarna formulata in nanoparticelle lipidiche (LNPs). La crescita del tumore è monitorata con gli ultrasuoni e la bioluminescenza. Tutte le fasi di questa procedura sono illustrati nel video allegato.
Protocol
Procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Animal Care istituzionale e Comitato uso (IACUC) presso l'University of California, San Francisco.
1. Preparazione cellulare
- La linea di carcinoma della vescica umana cellule KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) viene coltivato in RPMI-1640 integrato con 10% siero fetale bovino e 50 ug / ml di gentamicina.
- Le colture vengono mantenute a 37 ° C, 5% CO 2 con mezzi cambia ogni due o tre giorni.
- Le cellule sono state raccolte mediante digestione con tripsina e contate con un emocitometro. Una sospensione singola cella di 2 x 10 6 cellule in 50 pl è stato preparato in PBS e mantenuto in ghiaccio.
2. Ortotopico modello di tumore della vescica
- Nudo femminile (nu / nu) topi 8-10 settimane di età (Simonsen Laboratory, Gilory, CA) sono stati utilizzati.
- Posizionare un telino sterile su una piastra elettrica per servire unadi una piattaforma chirurgica. Sterile gel lubrificante, 24-linguistiche cateteri con aghi mandrino, soluzione di nitrato d'argento, e l'acqua sterile sono preparati.
- Anestesia generale viene indotta nei topi con isoflurano per via inalatoria (3% per l'induzione, 1-2% per la manutenzione) e mantenuto via dell'ogiva. Pomata oftalmica sterile viene applicato agli occhi dell'animale, e un cuscinetto di calore viene utilizzato per mantenere la temperatura corporea.
- Posizionare il mouse in posizione supina.
- Afferrare vulva dell'animale con le pinze per la stabilizzazione.
- Utilizzando un 24-gua catetere endovenoso con l'ago con stiletto rimosso, l'uretra mouse è cateterismo. Ampio lubrificazione devono essere utilizzati. Con la posizione supina del mouse, l'uretra si trova immediatamente posteriore alle pieghe della vulva e anteriore della vagina. Un angolo di 45 gradi è inizialmente adottare al fine di incannulare l'uretra e passare sotto l'osso pubico. Un angolo più superficiale viene poi portato a passare attraverso l'uretra nella vescica. Gentle pres pelviciAssicurarsi di raddrizzare l'uretra può essere d'aiuto. Si deve prestare attenzione per evitare di spingere troppo contro la resistenza, in quanto questo può portare a perforazione della vescica o uretrale. Urine visto all'interno del catetere conferma la sua posizione all'interno del lume vescicale.
- Aspirare urina dal lume del catetere vescicale e con l'ago mandrino. L'ago stiletto viene utilizzato per tutte le aspirazioni e successive iniezioni, lasciando il catetere in posizione. Ciò consente di iniezione di volumi precisi eliminando il spazio morto all'interno del catetere, e rende superflua cateterizzazioni ripetute.
- Per mettere in pericolo il livello glicosaminoglicano dell'urotelio vescica, 10 pl di 0,5 M di nitrato d'argento viene iniettato e lasciato abitare per 10 secondi. Ciò può formare un precipitato bianco con urina residua.
- Aspirare ed eliminare i contenuti precipitato e la vescica utilizzando un ago con stiletto.
- Lavare la vescica mediante iniezione di 100 microlitri di acqua sterile. Aspirare ed eliminare l'acqua. REPEa lavaggio con acqua sterile 3 volte per un totale di 4 lavaggi.
- Posizionare una cravatta di seta attorno al 4-0 meato uretrale per occludere l'uretra in preparazione per la rimozione del catetere.
- Iniettare precedentemente preparato 2 x 10 6 KU-7-luc2-GFP cellule in 50 pl usando l'ago mandrino.
- Contemporaneamente rimuovere il catetere e l'ago mandrino, lasciando l'uretra occluso dalla cravatta di seta.
- Il mouse sarà mantenuto in anestesia generale per 2 ore prima che la cravatta di seta viene rimosso e l'animale è risvegliata.
3. Ultrasuono
- Anestesia generale viene indotta con isofluorano vaporizzato e mantenuto tramite cono di naso.
- A VisualSonics Vevo 770 In Vivo ad alta risoluzione Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada) con il RMV-704 40 MHz sonda è stata utilizzata.
- Posizionare il mouse in posizione supina sulla piattaforma ultrasuoni.
- Fissare zampe posteriori dell'animalecon nastro per evitare movimenti in eccesso durante la manipolazione della sonda ad ultrasuoni.
- Applicare il gel per ultrasuoni al bacino del mouse.
- Abbassare uno RMV-704 (40 MHz) sonda ad ultrasuoni sul bacino del mouse per ottenere immagini trasversali o longitudinali.
- Se il tumore si trova, le immagini possono essere salvate per la misurazione delle dimensioni del tumore.
4. Bioluminescent Imaging
- Eseguire iniezione intraperitoneale di 200 pl (150 mg / kg) substrato luciferina.
- Indurre anestesia generale con isofluorano vaporizzato e mantenere via cono di naso.
- Mettere i topi in posizione supina nel imager bioluminescenza.
- Cinque minuti dopo l'iniezione luciferina, misurare la bioluminescenza dall'animale in fotoni al secondo.
5. Preparazione sarna
- Sintetizzare RNA oligonucleotidi ad una scala di 50-100 mol.
- Ricottura complementari a singolo filamento oligonucleotidi into duplex saRNAs.
- Lipid-nanoparticelle (LNP)-sarna vengono preparati con il lipide ionizzabile 1,2-dilinoleyl-4-(2 - dimetilamminoetil) - [1,3]-diossolano (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl colina, colesterolo, e PEG-DMG utilizzando una procedura di formazione spontanea vescicola formulazione come precedentemente descritto. 1
6. La somministrazione intravescicale di Sarna Formulato
- Dopo aver stabilito il ortotopico modello di tumore della vescica, i topi sono trattati con attivazione intravescicale piccolo RNA (sarna) formulati in nanoparticelle lipidiche (LNPs) (Tabella 1).
- Anestesia generale è stabilito e mantenuto con isofluorano vaporizzato, e lubrificante oftalmica sterile viene applicato.
- Mettete l'animale in posizione supina.
- Eseguire uretrale cateterismo come descritto in precedenza.
- Posizionare una cravatta di seta 4-0 intorno all'uretra e il catetere.
- Aspirare tutto urina dal catetere edella vescica utilizzando una siringa vuota e l'ago mandrino.
- Iniettare LNP-sarna via endovescicale per una dose totale di 50 ml (3 mg / kg). Contemporaneamente rimuovere il catetere e l'ago mandrino, lasciando l'uretra occluso dalla cravatta di seta.
- Il mouse rimarrà anestetizzati con l'uretra occluso per 2 ore.
- Il trattamento con intravescicale LNP-sarna fu iniziata il 4 ° giorno dopo l'impianto del tumore. I topi sono stati trattati in serie, ogni 3 giorni, per un totale di 14 trattamenti.
7. Risultati rappresentativi
Tumori della vescica derivanti da KU-7-luc2-GFP cellule può essere monitorato da luciferasi bioluminescenza immagini (Figura 1A e C) e ultrasuoni vescica (Figura 1B e D). I tumori sono spesso rilevabili entro 3-5 giorni dopo l'inoculazione delle cellule. Abbiamo trovato successo l'impianto del tumore della vescica in oltre il 90% dei topi. Come il trattamento con intravescicale dsRNA deriva, la progressione del tumore può essere monitorato with queste modalità. Dopo che l'animale viene sacrificato, la crescita tumorale può anche essere confermata mediante GFP fluorescenza. In generale, la media bioluminescenza correlata con le dimensioni medie ultrasuoni per tumori della vescica, come si vede visivamente in figure 1C e 1D. Tuttavia, dopo gli animali sono stati sacrificati e tumore è stata confermata da GFP, abbiamo trovato che bioluminescenza più strettamente correlata con la presenza di tumore conveniente rispetto fatto misurazioni ultrasuoni. Ciò è particolarmente evidente tra topi trattati con sarna (rispetto ai controlli) perché il tessuto cicatriziale residuo in topi trattati era spesso visualizzata mediante ultrasuoni, ma potrebbe non essere differenziata da tumore vivo.
Figura 1. Cinetica di crescita tumorale del tumori della vescica. (A) di imaging bioluminescenza misura l'attività della luciferasi all'interno del tumore della vescica per confermare la loro posizione e la crescita. (B) In ultrasoun vescica vivod utilizzando una sonda 40MHz produce immagini tumorali cui dimensioni possono essere misurata con precisione. (C) grafici che illustrano aumento progressivo del tumore in dimensioni e bioluminescenza ultrasuoni. I valori rappresentano la media (+ / - deviazione standard) le misure da 6 animali. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Vi presentiamo un protocollo per l'istituzione di un modello murino ortotopica tumore della vescica xenotrapianto seguito da un trattamento intravescicale dei tumori con sarna LNP formulato che bersaglia il promotore di CIP1/WAF1 p21 (p21) per l'attivazione della trascrizione. 2, 3 I tumori risultanti possono essere confermata e monitorata con immagini e bioluminescenti ultrasuoni vescica. Modelli ortotopica può essere superiore a intraperitoneale, sottocutanea, endovenosa o modelli fornendo un ambiente di urina e dell'urotelio che si avvicina maggiormente endogena cancro della vescica. Una varietà di tumori della vescica ortotopici del mouse sono stati stabiliti utilizzando sia a iniezione diretta parete della vescica così come l'instillazione intravescicale. 4-8 l'instillazione intravescicale di tumore, come dimostrato qui, piu 'simile tumori della vescica umani che iniziano superficialmente a livello dell'epitelio della mucosa e crescono più nei loro progressi. Il metodo di utilizzo di nitrato d'argento per accogliere bladDers per l'assorbimento del tumore è poco costoso e tecnicamente semplice.
Hadaschik et al. Descritto instillazione intravescicale di tumori della vescica nei topi e riportato valutazione affidabile bioluminescente tumore. 5 Allo stesso modo abbiamo trovato alti tassi di successo l'impianto del tumore con il cateterismo e instillazione cellulare. I tumori non sono stati confermati solo con bioluminescenza, ma anche con ultrasuoni vescica in vivo, fornendo un metodo aggiuntivo per quantificare progressione tumorale.
In questo protocollo, notiamo diverse modifiche alla tecnica degli altri. Abbiamo impiegato instillazione di soluzione di nitrato d'argento da perturbare il extracellulare strato vescica glicosamminoglicano per l'impianto delle cellule tumorali, invece di elettrocauterizzazione. Abbiamo trovato che questo è un buon mercato, metodo semplice e affidabile che ridurre al minimo le possibilità di errore dell'utente. Durante la valutazione ecografica della vescica, abbiamo trovato che non sia necessario per eseguire il cateterismo uretraleanticipo. Finché l'animale non erano stati sottoposti a disagio significativo per causare minzione prima di subire l'anestesia, la vescica topo è stato affidabile gonfia durante l'imaging per consentire la visualizzazione del tumore eccellente. Senza dubbio, il cateterismo uretrale è stato il passo meno affidabile del protocollo. Nella nostra esperienza, il cateterismo atimici topi nudi è più difficile che in topi C57. Tuttavia, con la tecnica descritta in questo protocollo e video, oltre il 90% degli animali è stato ripetutamente cateterizzato successo sia per instillazione tumore e il trattamento.
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Disclosures
LCL è un inventore di nome in attesa di domande di brevetto relative a sarna che siano stati presentati dalla University of California San Francisco e concesso in licenza a Alnylam Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Questa ricerca è finanziata dalla vescica AACR Henry Shepard Cancer Research Grant (09-60-30-LI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
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