Summary
Gründung einer orthotopen Tumormodell Blase zu Antitumor-Wirkung von intravesikal geliefert Sarna und Überwachung des Tumorwachstums durch Ultraschall und Biolumineszenz-Bildgebung zu beurteilen.
Abstract
Wir stellen eine neue Methode zur Behandlung von Blasenkrebs mit intravesikal geliefert kleine aktivierende RNA (SÄRNA) in einem orthotopen Xenograft Maus Blasentumor Modell. Das Maus-Modell wird durch Katheterisierung der Harnröhre unter inhalativen Vollnarkose eingerichtet. Verätzung wird dann auf der Blasenschleimhaut mit intravesikale Silbernitratlösung, um die Blase eingeführt Glycosaminoglycan Schicht zu stören und erlaubt den Zellen zu befestigen. Nach mehrmaligem Waschen mit sterilem Wasser, die menschliche Blasenkarzinom KU-7-luc2-GFP-Zellen durch den Katheter in die Blase instilliert für 2 Stunden zu verweilen. Anschließende Wachstum von Blasentumoren wird bestätigt und überwacht durch In-vivo-Blase Ultraschall und Biolumineszenz Bildgebung. Die Tumoren werden dann mit intravesikal SÄRNA in Lipid-Nanopartikel (LNPs) formuliert behandelt. Das Tumorwachstum wird mit Ultraschall und Biolumineszenz überwacht. Alle Schritte dieses Verfahrens sind in der beigefügten Video demonstriert.
Protocol
Verfahren mit tierischen Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of California, San Francisco genehmigt worden.
1. Zellpräparation
- Das menschliche Blasenkarzinom-Zelllinie KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) in RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 50 ug / ml Gentamicin ergänzt war.
- Die Kulturen werden bei 37 ° C, 5% CO 2 mit Medien wechselt alle zwei bis drei Tage.
- Die Zellen wurden durch Trypsin-Verdau geerntet und unter Verwendung eines Hämozytometers. Eine einzelne Zellsuspension von 2 × 10 6 Zellen in 50 l wurde in Phosphat-gepufferter Salzlösung hergestellt und auf Eis gehalten.
2. Orthotopen Blasentumor Modell
- Weiblicher Akt (nu / nu) Mäuse 8-10 Wochen alt (Simonsen Laboratory, Gilory, CA) verwendet wurden.
- Setzen Sie ein steriles Tuch über einem Heizkissen dienen, einsa chirurgischen Plattform. Sterile Gleitgel, 24-che Katheter mit Stilett Nadeln, Silbernitrat-Lösung, und steriles Wasser hergestellt.
- Vollnarkose ist bei den Mäusen mit inhalativen Isofluran (3% für Induktion, 1-2% für die Wartung) und-wartung über Nasenkonus induziert. Sterile ophthalmische Salbe wird auf die Augen des Tieres angelegt wird, und ein Heizkissen verwendet wird, um die Körperwärme zu halten.
- Platzieren Sie die Maus in Rückenlage.
- Fassen Sie das Tier Vulva mit einer Pinzette zur Stabilisierung.
- Mit einem 24-che intravenösen Katheter mit der Nadel Stilett entfernt wird, wird die Maus Harnröhre katheterisiert. Eine ausreichende Schmierung verwendet werden sollte. Mit der Maus auf dem Rücken, wird die Harnröhre liegt unmittelbar hinter der Vulva Falten und anterior der Vagina. Eine 45-Grad-Winkel wird vorgelegt, um die Harnröhre kanülieren und unterhalb des Schambeins besteht. Eine flachere Neigung wird dann genommen, um durch die Harnröhre in die Blase besteht. Sanfte Becken-presSie glätten die Harnröhre kann oft helfen. Es ist darauf zu vermeiden, zu hart gegen einen Widerstand, da dies zu urethralen oder Perforation Blase führen kann. Urin im Katheter gesehen bestätigt seine Position innerhalb der Blase Lumen.
- Saugen Urin von den Katheter und Blasenlumens mit der Sondennadel. Die Sondennadel wird für alle nachfolgenden Streben und Injektionen verwendet wird, wobei der Katheter an Ort und Stelle. Dies ermöglicht genaue Volumina Injektion von durch den Wegfall der Totraum innerhalb des Katheters, und es wird wiederholt Katheterisierungen unnötig.
- Um die Glykosaminoglykan Schicht der Blase Urothel beeinträchtigen, wird 10 ul 0,5 M Silbernitrat injiziert und man ließ sie für 10 Sekunden zu verweilen. Dies kann zur Bildung eines weißen Niederschlags mit den restlichen Urin.
- Absaugen und entsorgen Sie die Inhalte Niederschlag und der Blase mit einem Sondennadel.
- Waschen Sie die Blase durch Injektion von 100 ul sterilem Wasser. Absaugen und verwerfen das Wasser. Repebei Waschen mit sterilem Wasser 3-mal für insgesamt 4 Wäschen.
- Legen Sie eine 4-0 Seidenkrawatte rund um die Harnröhre, um die Harnröhre in Vorbereitung auf Entfernung des Katheters zu verschließen.
- Zuvor hergestellten Spritzen 2 x 10 6 KU-7-luc2-GFP-Zellen in 50 ul mit der Sondennadel.
- Gleichzeitig nehmen Sie den Katheter und Sondennadel, so dass die Harnröhre durch die Seidenkrawatte verschlossen.
- Die Maus wird unter Vollnarkose für 2 Stunden gehalten werden, bevor die Seidenkrawatte wird entfernt und das Tier ist erwacht.
3. Ultraschall
- Vollnarkose mit Isofluran verdampfte und-wartung über Nasenkonus induziert.
- Ein VisualSonics Vevo 770 In Vivo High-Resolution Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Kanada) mit dem RMV-704 40-MHz-Sonde verwendet wurde.
- Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf dem Ultraschall-Plattform.
- Sichern des Tieres Hinterbeinemit Klebeband übermäßige Bewegung während der Manipulation der Ultraschall-Sonde zu vermeiden.
- Bewerben Ultraschall-Gel auf die Maus Becken.
- Senken Sie eine RMV-704 (40 MHz) Ultraschallsonde auf die Maus, um das Becken quer oder längs Bilder zu erhalten.
- Wenn Tumor gefunden wird, können Bilder für die Messung des Tumors Dimensionen gespeichert werden.
4. Bioluminescent Imaging
- Führen intraperitoneale Injektion von 200 ul (150 mg / kg) Luciferinsubstrat.
- Induzieren Vollnarkose mit Isofluran und pflegen verdampften über Bugspitze.
- Platzieren Sie Mäuse in Rückenlage in der Biolumineszenz-Imager.
- Fünf Minuten nach der Injektion Luciferin, messen Sie die Biolumineszenz von dem Tier in Photonen pro Sekunde.
5. SÄRNA Vorbereitung
- Synthetisieren RNA-Oligonukleotiden auf einer Skala von 50 bis 100 mmol.
- Glühen komplementäre einzelsträngige Oligonukleotide iNTO-Duplex saRNAs.
- [1,3]-dioxolan (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl Cholin, Cholesterin und PEG-DMG - Lipid-Nanopartikel (LNP)-SÄRNA mit dem ionisierbaren Lipids 1,2-Dilinoleyl-4-(- Dimethylaminoethyl 2) hergestellt Verwendung eines spontanen Vesikelbildung Formulierung Verfahren wie zuvor beschrieben. 1
6. Intravesikale Verabreichung formuliertes SÄRNA
- Nach Gründung der orthotopen Blasentumor Modell werden Mäuse mit intravesikale kleine aktivierende RNA (SÄRNA) in Lipid-Nanopartikel (LNPs) (Tabelle 1) formuliert behandelt.
- Vollnarkose wird aufgebaut und mit verdampfte Isofluran aufrechterhalten, und sterile ophthalmische Schmiermittel aufgetragen wird.
- Platzieren Sie das Tier in Rückenlage.
- Führen Katheterisierung der Harnröhre, wie zuvor beschrieben.
- Legen Sie eine 4-0 Seidenkrawatte um die Harnröhre und Katheter.
- Saugen sie die gesamte Urin aus dem Katheter undBlase mit einer leeren Spritze und Sondennadel.
- Spritzen-LNP SÄRNA intravesikal für eine Gesamtdosis von 50 ml (3 mg / kg). Gleichzeitig nehmen Sie den Katheter und Sondennadel, so dass die Harnröhre durch die Seidenkrawatte verschlossen.
- Die Maus bleibt anästhesiert mit der Harnröhre für 2 Stunden verschlossen.
- Die Behandlung mit intravesikale LNP-SÄRNA wurde am Tag 4 nach der Tumorimplantation begonnen. Die Mäuse wurden seriell behandelt alle 3 Tage, für insgesamt 14 Behandlungen.
7. Repräsentative Ergebnisse
Blasen, die aus Tumoren KU-7-luc2-GFP-Zellen kann mittels Luciferase-Biolumineszenz-Bildgebung (1A und C) und der Blase Ultraschall (1B und D) überwacht werden. Tumoren sind oft innerhalb von 3-5 Tagen nachweisbar nach Zellinokulation. Wir fanden erfolgreiche Blasentumor Implantation in über 90% der Mäuse. Da die Behandlung mit intravesikale dsRNA erfolgt, kann das Fortschreiten des Tumors wi überwacht werdenth dieser Modalitäten. Nachdem das Tier geopfert wird, kann das Tumorwachstum bestätigte auch mit GFP-Fluoreszenz werden. In der Regel bedeuten, Biolumineszenz mit mittleren Abmessungen für Ultraschall Blasentumoren korreliert, wie visuell in den Abbildungen 1C und 1D gesehen. Jedoch, nachdem die Tiere getötet und Tumor wurde durch GFP bestätigt, fanden wir, dass Biolumineszenz enger mit der Anwesenheit von lebensfähigen Tumor als hat Ultraschallmessungen korreliert. Dies war besonders deutlich bei den Mäusen mit Sarna (als Gegensatz zu den Kontrollen) behandelt, da die verbleibende Narbengewebe im behandelten Mäuse war oft durch Ultraschall sichtbar gemacht, konnte aber nicht von Live-Tumor zu unterscheiden.
Abbildung 1. Das Tumorwachstum Kinetik von Blasentumoren. (A) Biolumineszenz-Bildgebung misst die Luciferaseaktivität innerhalb Blasentumoren zu deren Standort und Wachstumsbedingungen zu bestätigen. (B) In-vivo-Blase ultrasound mit einem 40MHz-Sonde erzeugt Tumor Bilder, deren Abmessungen genau gemessen werden kann. (C) graphische Darstellungen des Tumors progressiver Anstieg der Biolumineszenz-und Ultraschall-Dimensionen. Die Werte stellen Mittelwert (+ / - Standardabweichung) Messungen von 6 Tieren. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Wir präsentieren ein Protokoll für die Errichtung eines Maus-Xenograft orthotopen Tumormodell Blase durch intravesikale Behandlung der Tumoren mit LNP SÄRNA formuliert, die den Promotor von p21 CIP1/WAF1 (p21) Zielen für die Aktivierung der Transkription gefolgt. 2, 3 Die entstehenden Tumoren können bestätigt und mit Biolumineszenz-Bildgebung und Blase Ultraschall überwacht. Orthotopische Modellen überlegen sein kann intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Modellen durch ein Milieu von Urin und Urothel, dass mehr sehr nahe endogenen Blasenkrebs. Eine Vielzahl von orthotopen Maus Blasentumoren eingerichtet wurden sowohl die direkte Injektion Blasenwand sowie intravesikale Instillation. 4-8 intravesikale Instillation von Tumor, wie hier gezeigt, genauer das Verhalten menschlicher Blasentumoren, die oberflächlich beginnen in dem Darmepithel und wachsen tiefer wie sie Fortschritte. Unsere Methode der Verwendung von Silbernitrat zu blad unterbringenZylinder für Tumoraufnahme ist kostengünstig und technisch einfach.
Hadaschik et al. Beschrieben intravesikale Instillation von Blasentumoren bei Mäusen und berichtet zuverlässig Biolumineszenz Tumor Beurteilung. 5 Wir fanden ähnlich hohe Raten von erfolgreichen Tumorimplantation mit Katheterisierung und Zell-Instillation. Unsere Tumoren wurden nicht nur mit Biolumineszenz, sondern auch mit In-vivo-Blase Ultraschall bestätigt, eine zusätzliche Methode zur Quantifizierung der Tumorprogression.
In diesem Protokoll, stellen wir einige Modifikationen an anderer Technik. Wir verwendeten Instillation von Silbernitrat-Lösung, um die Blase extrazellulären Glycosaminoglycan Schicht für Implantation der Tumorzellen, anstatt Elektrokauter stören. Wir fanden, dass dies eine billige, einfache und zuverlässige Methode, die Potenzial für die Benutzer Fehler minimiert werden. Während Ultraschalluntersuchung der Blase, fanden wir es nicht notwendig, Katheterisierung der Harnröhre durchführenvorher. Solange das Tier nicht zu bedeutsamer Weise Leiden unterworfen worden, das Wasserlassen vor einer Narkose führen, wurde die Maus zuverlässig Blase während der Bildgebung aufgetrieben, um für ausgezeichnete Tumor Visualisierung zu ermöglichen. Ohne Zweifel war die Katheterisierung der Harnröhre unzuverlässigsten Schritt des Protokolls. Nach unserer Erfahrung ist Katheterisierung im Nacktmausmodell schwieriger als in C57-Mäusen. Doch mit der Technik in diesem Protokoll und Video beschrieben wird, wurden über 90% der Tiere immer wieder erfolgreich für beide Tumor Instillation und Behandlung katheterisiert.
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Disclosures
LCL ist ein benannter Erfinder auf anhängige Patentanmeldungen in Bezug auf SÄRNA, die von der University of California San Francisco eingereicht worden sind und in Lizenz an Alnylam Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Diese Forschung wird von der AACR Henry Shepard Blasenkrebs Research Grant (09-60-30-LI) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
- Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
- Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).
- Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).
