Summary
초음파와 발광 생물 이미징에 의한 intravesically 전달 saRNA 및 모니터링 종양 성장의 antitumor 효과를 평가하는 orthotopic 방광 종양 모델을 수립.
Abstract
우리는 orthotopic 이종 이식 마우스 방광 종양 모델에서 intravesically 배달 작은 활성 RNA (saRNA)로 방광 암 치료를위한 새로운 방법을 제시. 마우스 모델은 흡입된 일반적인 마취하에 요도 catheterization에 의해 설립되었습니다. 화학 화상 그러면 방광 glycosaminoglycan 계층을 혼란 intravesical 실버 질산염 용액을 사용하여 방광 점막을 소개하고 세포 첨부할 수 있습니다. 멸균 물, 인간의 방광 암 구-7-luc2-GFP 세포와 여러 세차장에 이어 2 시간 머물지 방광에 카테터를 통해 얻은됩니다. 방광 종양의 후속 성장 생체내 방광 초음파와 발광 생물 이미징에 의해 확인하고 감시하고 있습니다. 종양 그러면 saRNA은 지질 nanoparticles (LNPs)에 공식화와 intravesically 처리됩니다. 종양 성장 초음파 및 bioluminescence으로 감시하고 있습니다. 이 절차의 모든 단계가 수반 비디오에 증명하고 있습니다.
Protocol
동물 과목과 관련된 절차는 캘리포니아 샌프란 시스코 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 셀 준비
- 인간의 방광 암 세포주 구-7-luc2-GFP는 (캘리퍼스 생명 과학, Hopkinton, MA) 10 % 태아 소 혈청 및 50 μg / ML gentamicin과 보완 RPMI-1640 미디어에서 재배된다.
- 문화는 37에서 유지됩니다 ° C, 매체와 CO 2는 모든 2-3일 변화 5 %.
- 세포는 트립신의 소화에 의해 수확과 hemocytometer를 사용하여 계산되었다. 50 μl 2 X 10 6 세포의 단일 세포 현탁액은 인산염으로 준비되었다 염분 버퍼 얼음에 보관.
2. Orthotopic 방광 종양 모델
- 8~10주 옛 여자 누드 (뉴 / 뉴) 생쥐 (시몬 슨 연구소, Gilory, CA)을 사용 하였다.
- 를 제공하기 위해 가열 패드를 통해 무균 드레이프를 배치SA 외과 플랫폼입니다. 멸균 윤활 젤리, 탐침의 바늘, 실버 질산 용액 및 멸균 물 24 게이지 카테터는 준비가되어 있습니다.
- 일반 마취가 흡입된 isoflurane (유도 3 %, 유지 보수 1~2%)과 nosecone 통해 유지와 생쥐에 시달릴 수 있습니다. 멸균 안과 연고는 동물의 시선에 적용되며, 열 패드는 체온을 유지하는 데 사용됩니다.
- 위로 향한 자세로 마우스를 놓으십시오.
- 부드럽게 안정화를위한 집게로 동물의 외음부를 파악.
- 제거 주사 탐침으로 24 게이지 정맥 카테터를 사용하여 마우스 요도가 catheterized됩니다. 충분한 윤활를 사용해야합니다. 마우스 부정사로 요도가 vulvar 주름과 음부의 앞부분에 즉시 후부에 위치하고 있습니다. 45도 각도는 처음에는 치골 아래에 요도를 cannulate하고 전달하기 위해 가져옵니다. 보다 얕은 각도는 다음 방광으로 요도를 통과하기 위해 가져옵니다. 젠틀 골반을 대표해서요도가 자주 도울 수 펴주십시오. 케어는이 요도 또는 방광 천공을 초래할 수 있으므로, 저항에 대해 너무 심하게 밀어 피하기 위해 이동해야합니다. 카테터 내에서 본 소변이 방광 루멘 내에서 위치를 확인합니다.
- 탐침 바늘을 사용하여 카테터와 방광 루멘에서 소변을 기음. 탐침 바늘이 장소에서 카테터를 떠나, 이후의 모든 열망과 주사에 사용됩니다. 이것은 카테터 내에 사망하는 공간을 제거하여 정확한 볼륨의 주입은 가능하며 반복 catheterizations가 필요합니다.
- 방광 urothelium의 glycosaminoglycan 계층에 악영향을하려면, 0.5 M 실버 질산 중 10 μL을 주입하고 10 초 동안 머물러 허용됩니다. 이것은 남아있는 소변과 흰색 침전물을 형성 있습니다.
- 기음과 탐침 바늘을 사용하여 침전물과 방광 내용물을 버리고.
- 100 μL 멸균 물을 주입하여 방광 씻으십시오. 물을 대기음 및 폐기. Repe4 세차장의 총 멸균 물로 세척 장에서 3 회.
- 카테터 제거를위한 준비 요도를 윗니와 아랫니가 맞물리다하는 요도 meatus 주변 4-0 실크 넥타이를 놓으십시오.
- 주사 이전 탐침 바늘을 이용하여 50 μL에 2 × 10 6 구-7-luc2-GFP 세포를 준비 하였다.
- 동시에 실크 넥타이에 의해 occluded 요도를 떠나는, 카테터와 탐침 바늘을 제거합니다.
- 실크 넥타이가 제거되고 동물이 잠에서되기 전에 마우스는 12 시간 동안 일반적인 마취하에 유지됩니다.
3. 초음파
- 일반 마취가 증발 isoflurane과 코 콘을 통해 유지로 유도된다.
- VIVO에서 VisualSonics Vevo 770는 고해상도의 마이크로 이미징 시스템은 (VisualSonics INC, 토론토, 온타리오, 캐나다) RMV-704 40 MHz의 탐침으로 사용되었다.
- 초음파 플랫폼에서 위로 향한 자세로 마우스를 놓으십시오.
- 동물의 뒷다리를 확보테이프로 초음파 프로브의 조작 중에 초과 움직임을 피할 수 있습니다.
- 마우스 골반에 초음파 젤을 적용합니다.
- 가로 또는 세로 이미지를 얻기 위해 마우스 골반에 RMV-704 (40 MHz의) 초음파 프로브를 낮춥니다.
- 종양이 발견되면 이미지는 종양 크기 측정을 위해 저장할 수 있습니다.
4. 발광 생물 이미징
- 200 μL (150 밀리그램 / ㎏) luciferin 기판의 intraperitoneal 주사를 수행합니다.
- isoflurane 증발과 함께 일반적인 마취를 유도하고 코 콘을 통해 유지합니다.
- bioluminescence의 영상기 이내에 위로 향한 자세로 마우스를 놓습니다.
- 5 분 luciferin 주입 후 초당 광자의 동물에서 bioluminescence를 측정.
5. saRNA 준비
- 50-100 μmol의 규모 oligonucleotides를 RNA 합성.
- 보완 단일 좌초된 oligonucleotides를 어닐링 전아 니 디럭스 saRNAs.
- [1,3]-dioxolane (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl 콜린, 콜레스테롤, 그리고 PEG-DMG - 지질 nanoparticle (LNP) saRNA은 ionizable 지질 1,2-dilinoleyl-4-(- dimethylaminoethyl 2)과 함께 준비하고 있습니다 이전에 설명한대로 자발적인 소포 형성 제제 절차를 사용 1.
6. 공식화 saRNA의 Intravesical 관리
- orthotopic 방광 종양 모델을 맺은 후, 마우스는 지질 nanoparticles (LNPs) (표 1)에서 공식화 intravesical 작은 활성 RNA (saRNA)로 처리됩니다.
- 일반 마취를 설립, 유지 isoflurane 증발과 함께, 그리고 무균 안과 윤활유가 적용되어 있습니다.
- 부정사 위치에 동물을 배치합니다.
- 이전에 설명한대로 요도 catheterization을 수행합니다.
- 요도 카테터와 주변 4-0 실크 넥타이를 놓으십시오.
- 카테터에서 모든 소변을 기음과빈 주사기 및 탐침 바늘을 사용하여 방광.
- 50 μL (3 밀리그램 / ㎏)의 총 복용량을 위해 intravesically LNP-saRNA을 주사. 동시에 실크 넥타이에 의해 occluded 요도를 떠나는, 카테터와 탐침 바늘을 제거합니다.
- 마우스는 2 시간 동안 occluded 요도와 anesthetized 유지됩니다.
- intravesical LNP-saRNA과 치료는 종양 이식 후 4 일에 시작되었다. 쥐은 14 트리 트먼트 총, 매 3 일간 순차적으로 처리되었다.
7. 대표 결과
구-7-luc2-GFP 세포에서 형태소 분석 방광 종양은 루시페라제 발광 생물 이미징 (그림 1A와 C)과 방광 초음파 (그림 1B와 D)에 의해 모니터할 수 있습니다. 종양 세포 접종 후 3~5일 이내 자주 감지 있습니다. 우리는 생쥐의 90 % 이상의 성공적인 방광 종양 주입을 발견. intravesical dsRNA와 치료 ensues으로 종양의 진행은 WI를 모니터링할 수 있습니다이러한 modalities 일. 동물 희생 후 종양의 성장 또한 GFP 형광을 사용하여 확인할 수 있습니다. 일반적으로, bioluminescence는 같은 인물 1C 및 1D에 시각적으로 볼, 방광 종양에 대한 평균 초음파 차원과 상호 의미. 동물들이 희생되었으며 종양이 GFP가 확정되자 그러나, 우리는 그 bioluminescence은 초음파 측정했던 것보다 가능한 종양의 존재와보다 밀접하게 상호 발견. 처리 생쥐에서의 잔류 반흔 조직은 종종 초음파에 의해 시각했지만 라이브 종양으로부터 구분하지 못했기 때문에이 saRNA (같은 컨트롤의 반대 의미)로 치료 생쥐 중에서 특히 겉보기했습니다.
그림 1. 방광 종양의 종양 성장 속도론. () Bioluminescence 이미징 자신의 위치와 성장을 확인하는 방광 종양 내에 루시페라제 활동을 측정합니다. (B)의 생체내 방광 ultrasoun에서D 40MHz 프로브를 사용하는 것은 누구의 치수를 정확하게 측정할 수있는 종양 이미지를 생성합니다. (C) 그래프 bioluminescence 및 초음파 차원에서 종양의 진보적인 증가를 설명. 6 동물의 측정 - 값 (표준 편차 + / -) 의미를 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
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Discussion
우리는 transcriptional 활성화를 위해 p21 CIP1/WAF1 (p21)의 발기인을 대상으로 LNP 책정 saRNA와 종양의 intravesical 치료 다음에 마우스 orthotopic 이종 이식의 방광 종양 모델의 구축을위한 프로토콜을 제시한다. 2, 3 결과 종양이 될 수 있습니다 발광 생물 이미징 및 방광 초음파로 확인 및 모니터링. Orthotopic 모델은 소변과 밀접 내생 방광 암 대략 것을 urothelium의 환경을 제공함으로써 intraperitoneal, 피하 또는 정맥 주사 모델 우수 수 있습니다. orthotopic 마우스 방광 종양의 종류는 모두 직접 방광 벽 주입뿐 아니라 intravesical 떨어뜨림를 사용하여 설립되었습니다. 종양의 4-8 Intravesical 떨어뜨림은 여기를 시연으로, 더 자세히 점막 상피에서 피상적 시작하고 깊은 성장 인간의 방광 종양을 모방한 것이었 그들 진행으로. blad을 수용하기 위해 은을 질산을 사용하는 우리의 방법종양 이해를위한 ders은 저렴하고 기술적으로 간단하다.
Hadaschik 외. 마우스에서 방광 종양의 intravesical 떨어뜨림을 설명하고 신뢰할 수있는 발광 생물 종양 평가 5. 우리는 비슷하게 catheterization과 셀 떨어뜨림과 성공적인 종양 이식의 높은 속도를 발견했다고 전했다. 우리의 종양은 종양 진행을 quantifying위한 추가적인 방법을 제공할뿐만 아니라 생체내 방광 초음파에있는 bioluminescence으로 확인되지 않았다.
이 프로토콜에서는, 우리는 다른 사람의 기술에 대한 몇 가지 수정 사항을 확인합니다. 우리는 대신 electrocautery의 종양 세포 주입을위한 방광 세포 glycosaminoglycan 레이어를 방해하는 실버 질산염 솔루션의 떨어뜨림 고용. 우리는 이것이 사용자 오류 가능성을 최소화 싸고, 단순하고 안정적인 방법으로 발견. 방광의 초음파 평가하는 동안, 우리는 그것이 불필요한 요도 catheterization을 수행하는 것으로사전. 동물 마취를 겪고 전에 배뇨를 일으키는 것으로 상당한 고통에 노출되지 않았다는만큼 마우스 방광이 안정적으로 우수한 종양의 시각화를 가능하도록하기 위해서 이미징 동안 불어되었다. 의심의 여지없이, 요도 catheterization은 프로토콜 이상의 안정적인 발전이었다. 우리의 경험에서 athymic 누드 마우스의 catheterization는 C57 생쥐보다 더 어렵습니다. 그러나,이 프로토콜 및 동영상에 설명된 기법으로, 동물의 90 % 이상은 반복적으로 종양 떨어뜨림 및 치료 모두에 성공적으로 catheterized되었다.
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Disclosures
LCL은 캘리포니아 샌프란 시스코 대학에서 제기한 및 Alnylam 제약 회사에 허가되었습니다 saRNA에 관련된 특허 출원이 보류에 관한라는 발명가이다.
Acknowledgments
이 연구는 AACR 헨리 쉐퍼 방광 암 연구 그랜트 (09-60-30-LI)에 의해 자금 지원을하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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