En ortotopisk blåstumör modell och utvärdering av Intravesikal Sarna behandling

Summary

Upprätta en ortotopisk modell blåsa tumören för att utvärdera antitumöreffekter av intravesikalt levererat Särna och övervakning tumörtillväxt genom ultraljud och självlysande bilder.

Abstract

Vi presenterar ett nytt förfarande för behandling av blåscancer med intravesikalt levereras liten aktiverande RNA (Sarna) i en ortotopisk xenotransplantat mus blåsan tumörmodell. Den musmodell fastställs genom urinröret kateterisering i inhalerade narkos. Kemisk brännskada införs sedan till blåsan slemhinna under användning av intravesikalt silvernitratlösning att störa skiktet blåsan glykosaminoglykan och tillåter celler att fästa. Efter flera tvättar med sterilt vatten, blåscancer hos människa KU-7-luc2-GFP celler instilleras genom katetern in i blåsan för att verka i 2 timmar. Efterföljande tillväxt av tumörer i urinblåsan bekräftas och övervakas av in vivo urinblåsan ultraljud och självlysande bilder. Tumörerna behandlas sedan intravesikalt med Sarna formulerat i lipid nanopartiklar (LNPs). Tumörtillväxten övervakas med ultraljud och bioluminiscens. Alla steg i detta förfarande är visat på bifogade videon.

Protocol

Förfaranden som inbegriper djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (lACUC) vid University of California, San Francisco.

1. Cellberedning

1. Den humana cancer i urinblåsan cellinje KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) odlas i RPMI-1640 medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 50 | ig / ml gentamicin.
2. Kulturerna upprätthölls vid 37 ° C, _5% CO2 med mediet ändras var två till tre dagar.
3. Cellerna skördades genom trypsindigerering och räknades med användning av en hemocytometer. En enda cell-suspension av 2 x 10 ^6-celler i 50 | il framställdes i fosfatbuffrad saltlösning och förvarades på is.

2. Ortotopisk urinblåsan tumörmodell

1. Nakna (nu / nu) möss 8-10 veckor gamla (Simonsen Laboratory, Gilory, CA) användes.
2. Placera en steril duk över en värmedyna för att tjäna enSA kirurgisk plattform. Steril smörjande gelé 24-dervisning före katetrar med nål nålar, silvernitratlösning och sterilt vatten är beredda.
3. Narkos induceras i möss med inhalerad isofluran (3% för inducering, 1-2% för underhåll) och upprätthölls genom noskonen. Steril oftalmisk salva anbringas på djurets ögon, och en värme dyna används för att bibehålla kroppstemperaturen.
4. Placera musen i ryggläge.
5. Ta försiktigt tag i djurets vulva med pincett för stabilisering.
6. Med hjälp av en 24-gauge intravenös kateter med bort nålen nålen är musen urinröret kateteriserade. Riklig smörjning skulle användas. Med musen liggande, är urinröret ligger omedelbart posteriort till vulva veck och främre till vaginan. En 45-gradig vinkel initialt tas för att kanylera urinröret och passerar under blygdbenet. En mer flack vinkel tas sedan att passera genom urinröret in i blåsan. Gentle bäcken tryckSe till att räta ut urinröret ofta kan hjälpa till. Försiktighet måste iakttas för att undvika att trycka för hårt motstånd, eftersom detta kan leda till uretral eller urinblåsan perforation. Urin ses i katetern bekräftar sitt läge i blåsan lumen.
7. Aspirera urin från katetern och urinblåsa lumen med hjälp av nålen nålen. Styrtråden nål används för alla efterföljande aspirationer och injektioner, som lämnar katetern på plats. Detta möjliggör för injektion av korrekta volymer genom att eliminera den döda-utrymmet i katetern, och det gör upprepade kateterisering onödigt.
8. Att försämra glykosaminoglykan skiktet av blåsan urotelium är 10 | il av 0,5 M silvernitratlösning injiceras och fick stå i 10 sekunder. Detta kan bilda en vit fällning med återstående urin.
9. Aspirera och kassera fällningen och urinblåsan innehåll med hjälp av en nål nål.
10. Tvätta blåsan genom att injicera 100 jil sterilt vatten. Aspirera och kassera vattnet. RepEvid tvätt med sterilt vatten 3 gånger för totalt 4 tvättar.
11. Placera en 4-0 sidenslips runt uretra meatus att tillsluta urinröret inför kateter tas bort.
12. Injicera tidigare framställd 2 x 10 ⁶ KU-7-luc2-GFP celler i 50 | il med hjälp av styrtråden nålen.
13. Samtidigt tar bort katetern och nålen nålen lämnar urinröret tilltäppt av sidenslips.
14. Musen kommer att bibehållas under narkos i 2 timmar innan slips tas bort och djuret vaknat.

3. Ultraljud

1. Narkos induceras med förångad isofluran och upprätthölls genom noskonen.
2. En VisualSonics VEVO 770 In Vivo hög upplösning Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada) med RMV-704 40 MHz prob användes.
3. Placera musen i ryggläge på ultraljudet plattformen.
4. Säkra djurets bakbenmed tejp för att undvika överskott av rörelse under manipulering av ultraljudssonden.
5. Applicera ultraljudsgel till musen bäckenet.
6. Sänk en RMV-704 (40 MHz) ultraljudsproben på musen bäckenet för att få tvärgående eller längsgående bilder.
7. Om tumören upptäcks kan bilder sparas för mätning av tumör dimensioner.

4. Bioluminiscerande Imaging

1. Utföra intraperitoneal injektion av 200 | il (150 mg / kg) luciferin substrat.
2. Framkalla narkos med förångad isofluran och underhålla via noskon.
3. Placera möss i ryggläge i bioluminescens kameran.
4. Fem minuter efter luciferin injektion mäta bioluminiscensen från djuret i fotoner per sekund.

5. Sarna Framställning

1. Syntetisera RNA-oligonukleotider i en skala av 50-100 pmol.
2. Annelera komplementära enkelsträngade oligonukleotider iNTO duplex saRNAs.
3. Lipid-nanopartikel (LNP)-Sarna framställes med den joniserbara lipiden 1,2-dilinoleylfosfatidylkolin-4-(2 - dimetylaminoetyl) - [1,3]-dioxolan (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl kolin, kolesterol och PEG-DMG användning av en spontan vesikel förfarande bildning formulering som tidigare beskrivits. ¹

6. Intravesikal administration av formulerat Sarna

1. Efter upprättandet av ortotopisk modell blåsan tumör behandlas mössen med intravesikal liten aktiverande RNA (Sarna) formulerad i lipida nanopartiklar (LNPs) (tabell 1).
2. Narkos upprättas och upprätthålls med förångad isofluran, och steril oftalmisk smörjmedel appliceras.
3. Placera djuret i ryggläge.
4. Utföra uretral katetrisering såsom tidigare beskrivits.
5. Placera en 4-0 sidenslips runt urinröret och katetern.
6. Aspirera all urin från katetern ochurinblåsan med hjälp av en tom spruta och nål nål.
7. Injicera LNP-Särna intravesikalt för en total dos av 50 | il (3 mg / kg). Samtidigt tar bort katetern och nålen nålen lämnar urinröret tilltäppt av sidenslips.
8. Musen kommer att förbli bedövades med urinröret ockluderades under 2 timmar.
9. Behandling med intravesikal LNP-Särna började på dag 4 efter tumörimplantation. Mössen behandlades seriellt, var 3 dagar, under totalt 14 behandlingar.

7. Representativa resultat

Blåstumörer härrör från KU-7-luc2-GFP celler kan övervakas genom luciferas bioluminiscent avbildning (figur 1 A och C) och urinblåsan ultraljud (Figur 1B och D). Tumörer är ofta detekterbar inom 3-5 dagar efter cellympning. Vi fann framgångsrik implantering blåstumör i över 90% av mössen. Eftersom behandling med intravesikal dsRNA följer, kan utvecklingen av tumören övervakas with dessa villkor. Efter att djuret avlivades kan tumörtillväxt också bekräftas med användning av GFP-fluorescens. I allmänhet betyder bioluminiscens korrelerade med genomsnittliga ultraljud dimensioner för tumörer i urinblåsan, såsom ses visuellt i fig 1C och 1D. Men efter djuren avlivades och tumören bekräftades av GFP, fann vi att bioluminiscens korrelerade närmare med förekomsten av livskraftiga tumör än vad ultraljud mätningar. Detta var särskilt tydligt hos möss behandlade med Sarna (i motsats till kontroll) på grund kvarvarande ärrvävnad i behandlade möss var ofta visualiserades genom ultraljud, men kunde inte särskiljas från levande tumör.

Figur 1. Tumör tillväxtkinetiken för tumörer i urinblåsan. (A) Bioluminescens avbildning mäter luciferasaktiviteten inom tumörer i urinblåsan för att bekräfta deras placering och tillväxt. (B) In vivo-blåsan ultrasound hjälp av en 40MHz sond ger tumör bilder vars dimensioner kan mätas exakt. (C) grafer som illustrerar tumörens progressiv ökning i Bioluminescence and ultraljud dimensioner. Värden representerar medelvärde (+ / - standardavvikelse) mätningar från 6 djur. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Vi presenterar ett protokoll för upprättandet av en mus ortotopisk xenograft urinblåsan tumörmodellen följt av intravesikal behandling av tumörer med LNP formulerade Sarna som riktar initiativtagaren till p21 ^CIP1/WAF1 (p21) för transkriptionsaktivering. ^{2, 3} De resulterande tumörer kan vara bekräftas och övervakas med självlysande avbildning och urinblåsa ultraljud. Ortotopisk modell kan vara överlägsen intraperitoneal, subkutan eller intravenösa modeller genom att tillhandahålla en miljö av urin och urotelium som är mer lik endogen cancer i urinblåsan. En mängd olika tumörer ortotopisk mus urinblåsan har fastställts med användning av både direkt injektion blåsväggen liksom intravesikal instillation., ^4-8 intravesikal instillation av tumör som visats här, närmare efterliknar humana tumörer i urinblåsan som börjar ytligt i den mukosala epitelet och fördjupas som de utvecklas. Vår metod för användning av silvernitrat för att rymma bladders för tumörupptag är billig och tekniskt enkel.

Hadaschik et al. Beskrivs intravesikal instillation av tumörer i urinblåsan hos möss och rapporterade tillförlitliga bioluminescerande tumören bedömning. ⁵ Vi lika fann höga framgångsrika tumörimplantation med kateterisering och cell instillation. Våra tumörer var inte bara bekräftats med bioluminiscens men också med in vivo urinblåsan ultraljud, vilket ger ytterligare en metod för att kvantifiera tumörprogression.

I detta protokoll noterar vi flera ändringar i andras teknik. Vi använde instillation av silvernitratlösning att störa blåsan extracellulära glykosaminoglykanen lager för tumörcellsimplantation, i stället för diatermi. Vi fann att detta är ett billigt, enkelt och tillförlitligt metod som minimerade risken för användarfel. Under ultraljud utvärdering av urinblåsan, fann vi det onödigt att utföra uretral kateteriseringförväg. Så länge djuret inte hade utsatts för betydande lidande för att orsaka urinering innan de genomgick anestesi var musen blåsan tillförlitligt utspänd under avbildning för att möjliggöra god tumör visualisering. Utan tvekan var urinrörets kateterisering den minst tillförlitliga steg i protokollet. Enligt vår erfarenhet är kateterisering av atymiska nakna möss svårare än i C57 möss. Men med den teknik som beskrivs i detta protokoll och video, var över 90% av djuren vid upprepade tillfällen kateter framgångsrikt för både tumör instillation och behandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KU-7-luc-GFP cells	Caliper Life Sciences	128091
thymic nude mice ( nu/nu)	Simonsen Laboratories	6-7 weeks old	Sim:(NCr) nu/nu fisol
Ultrasound unit	VisualSonics, inc.	Vevo 770	RMV-704 probe
Bioluminescence unit	Caliper Life Sciences	IVIS Spectrum
Exel safelet catheter	Fisher Scientific	14-841-21	24G X ¾"
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	S8157
Hamilton syringe	Hamilton Co	80301
LNP-saRNA	Alnylam Pharmaceuticals
Table 1. Specific reagents and equipment.