Summary
שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.
Abstract
ביונקים, היבטים רבים של התנהגות ופיזיולוגיה כגון מחזורי שינה והערות וחילוף חומרים כבדים מוסדרים בשעוני יממת אנדוגני (סקר 1,2). המערכת הביולוגית זמן שמירה, היא רשת היררכית רב מתנד, עם השעון המרכזי ממוקם בגרעין suprachiasmatic (SCN) סנכרון ותיאום שעונים-SCN נוסף והיקפיים אחר 1,2. תאים בודדים הם יחידות פונקציונליות לדור ותחזוקה של מקצבי יממה 3,4 ומתנדים אלה של סוגי רקמות שונים בנתח אורגניזם מנגנון משוב דומה להפליא ביוכימי שלילי. עם זאת, בשל אינטראקציות ברמת הרשת העצבית בSCN ובאמצעות רמזים קצביים, מערכתיים ברמת האורגניזם, מקצבי יממה ברמת האורגניזם אינם בהכרח תא אוטונומי 5-7. בהשוואה למחקרים מסורתיים של פעילות של תנועה בגוף חי וexplants SCN vivo לשעבר, גell מבוסס במבחני חוץ גופייה מאפשרת גילוי פגמי תא אוטונומי יממת 5,8. מבחינה אסטרטגית, מודלים מבוססי תאים יותר בניסוי צייתנים לאפיון פנוטיפי וגילוי מהיר של מנגנוני שעון בסיסיים 5,8-13.
בגלל מקצבי יממה הם דינמיים, מדידות אורכות עם רזולוציה גבוהה זמנית נחוצות להערכת תפקוד שעון. בשנים האחרונות, הקלטת פליטת אור בזמן אמת באמצעות בלוציפראז הגחלילית ככתב הפכה לשיטה נפוצה ללימוד מקצבי יממה ביונקים 14,15, שכן היא מאפשרת לבחינה של ההתמדה והדינמיקה של מקצבים מולקולריים. כדי לפקח על מקצבי יממת תא אוטונומי של ביטוי גנים, כתבי וציפראז ניתן הוכנסו לתאים באמצעות transfection החולף 13,16,17 או תמרה יציבה 5,10,18,19. כאן אנו מתארים פרוטוקול תמרה יציבה באמצעות משלוח הגן lentivirus בתיווך. Tמערכת וקטור lentiviral הוא עדיף על שיטות מסורתיות כגון transfection חולף ושידור germline בגלל היעילות והרבגוניות שלו: הוא מאפשר העברה יעילה ויציבה אינטגרציה לתוך הגנום של המארח הוא חלוקה ולא חלוקת תאים-20. ברגע ששורת תאי כתב הוא הקים, את הדינמיקה של פונקציית שעון יכולה להיבחן דרך הקלטת פליטת אור. אנו מתארים לראשונה את הדור (Per2) קווי P-d לוק כתב, ולאחר מכן מציגים נתונים מזה וכתבי יממה אחרים. במבחנים אלה, fibroblasts העכבר 3T3 וU2OS תאי סרטן עצמות אדם משמשים כמודל לסלולרי. אנחנו גם לדון בדרכים שונות של שימוש במודלים אלה במחקרי שעון יממה. שיטות שתוארו כאן ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים ללמוד את הבסיס התאי ומולקולרי של שעוני יממה, ועשויה להיות שימושי בהתמודדות עם בעיות במערכות ביולוגיות אחרות.
Protocol
1. בנייה של עיתונאי לוציפראז lentiviral
מבנה כתב יממת יונקים מכיל בדרך כלל ביטוי בקלטת שאמרגן יממה מעומתת עם גן לוציפראז. אסטרטגיות קשירה ושניהם רקומבינציה מבוססת משמשות בדרך כלל לשיבוט דנ"א. כדוגמה, הנה אנחנו מתארים שיטת שיבוט Gateway מבוססת רקומבינציה ליצירת כתב P (Per2)-ד לוק lentiviral, בי לוציפראז הערער (ד לוק) הוא תחת שליטה של אמרגן Per2 עכבר.
- שיבוט של Per2 אמרגן. השתמש PCR להגביר בר דנ"א אמרגן Per2 של 526 נ"ב, במעלה זרם של אתר תחילת השעתוק מעכבר Per2 BAC שיבוט 9-13, באמצעות פריימר קדימה (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') ופריימר הפוך (5' -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 "), ושיבוט לpENTR5'-topo וקטור (Invitrogen) לייצרpENTR5'-P (Per2).
- שיבוט של ד לוק. ד לוק מכיל את גן בלוציפראז גחלילית ורצף הדברה C-מסוף לפירוק חלבונים מהיר כפי שתואר קודם לכן 21. השתמש PCR להגביר בר ד לוק-DNA, והשיבוט לpENTR / D-topo וקטור (Invitrogen) כדי ליצור pENTR / DD לוק.
- בנייה של וקטור כתב. מערבב את שני פלסמידים pENTR, pENTR5'-P (Per2) וpENTR / DD לוק, עם וקטור יעד lentiviral pLV7-BSD (BSD, גן ההתנגדות blasticidin), ולבצע את תגובת רקומבינציה באמצעות Clonase לייצר pLV7-BSD-P (Per2)-D כתב לוק (איור 1). pLV7-BSD הוא גרסה שונה (שנעשה במעבדה שלנו) של pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) שבו וירוס צהבת מרמיטת רצפים לאחר התעתיק רגולטוריים אלמנט (WPRE) 22 הוכנסו מייד במורד זרם של הביטוי ca ssette כדי לשפר ביטוי גנים.
2. ייצור של חלקיקי lentiviral
1. תאי 293T זרעים (יום 1)
- לגדול בכליות (HEK) 293T תאים עובריים אנושיים למפגש 90-100% בDMEM הרגיל בתוספת 10% FBS ו1x פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (PSG) על 10 מנות תרבות סנטימטר. (במהירות תאים גדלים עם מספר מעבר נמוך הם קריטיים עבור transfection היעיל.)
- לפני זריעת התאים transfection ל, מעייל צלחות התרבות 6-כן על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.001% פולי-L-ליזין בPBS לכל באר ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. לשאוב את הפתרון ולשטוף פעם אחת עם 1x PBS לפני השימוש.
- לנתק את תאי 293T עם טריפסין וזרע 0.75 x 10 6 תאים על גבי כל אחד גם מהצלחות מראש המצופות עם 2 המ"ל DMEM הרגיל. מערבולת ביסודיות את הצלחות להשיג חלוקה שווה של תאים בכל אחד גם. לגדל את התאים בחממה ב 37 ° C למשך הלילה.
- הקפד על התאים נזרעו מיום 1. תא צריך להגיע מפגש של 80-90%.
- הכן תערובת transfection פלסמיד בצינור microcentrifuge מ"ל 1.5 ידי הוספת 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד כתב lentiviral (למשל, pLV7-P (Per2)-ד לוק; יו מעבדה) ואת 3 וקטורי האריזה (1.3 איסור פרסום מיקרוגרם / פול, 0.5 מיקרוגרם Rev, ו -0.7 מיקרוגרם VSVG; Invitrogen). כשלט עבור transfection וזיהום שלאחר מכן, אנחנו בדרך כלל כוללים גם תוספת בtransfection לוקטור ביטוי של GFP lentiviral, pLV156-CMV-EGFP (איור 1 א), חסת חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) תחת השליטה של אמרגן CMV כפי שתואר לעיל 20.
- הוסף 100 μl של 0.25 מ 'CaCl 2 (מדולל עם DNase / RNase ללא DDH 2 O מהמניות 2.5 מ') לתערובת פלסמיד בשלב 2 ומערבבים היטב. ואז להוסיף 100 μl של פתרון BBS 2x (50 מ"מ BES, 280 המ"מ NaCl, 1.5 מ"מ Na 2 HPO 4, pH 6.95) ומערבב בעדינות אך ביסודיות. דגירה את תערובת ה-DNA בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
- בזמן המתנה, לשאוב בינוני מתאי 293T ולשנות עד בינוני 2 מ"ל טרי. להחזיר את הצלחת לאינקובטור במשך לפחות 10 דקות כדי לאזן חומציות בינונית לפני transfection.
- הוסף תערובת transfection משלב 3 לירידת 293T תאים אחר טיפה. המערבולת בעדינות את הצלחת ולבחון היווצרות חלקיק תחת מיקרוסקופ. לדגור על 5% CO 2, 37 ° C למשך הלילה. (היווצרות חלקיקים קטנים של קאפו 4 משקע / ה-DNA הוא קריטי עבור transfection היעיל.)
3. חלקיקים נגיפיים קציר (ימים 3-4)
- כ 16 שעות לאחר transfection (יום 3) שבו תאים בזמן צריכים להגיע למפגש 100%, לשאוב בינוני מתאים ולהחליף המ"ל DMEM טרי 2 רגיל. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- ביום 4, להעריך את יעילות transfection על ידי התבוננות בביטוי EGFP טראןתאי בקרת sfection (יעילות Transfection של 90-100% עם ביטוי EGFP גבוה היא מנבא אמין של מכין נגיפי טוב.)
- איסוף בינוני המכילים חלקיקים מופרשים, מחלות זיהומיות ויראליות. צנטריפוגה ב> 2000 XG למשך 5 דקות להסרת תאי 293T השיורי ולאסוף את supernatant וירוס המכיל. לחלופין, ניתן הבינוני פונה עם מסנן קרום מיקרומטר 0.45. את חלקיקי הנגיף מוכנים לשימוש בזיהום.
3. זיהום של תאי 3T3
1. תאי 3T3 זרעים (יום 3)
פיצול ומספר מתאים זרע (~ 12,000) של תאי 3T3 בצלחת 12-היטב כדי להשיג מפגש 20-30% ביום שלמחרת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. להדביק תאי 3T3 (יום 4)
- הקפד על התאים נזרעו. מפגש של 20-30% (פחות מ 50%) הוא רצוי לזיהום.
- הוסף polybrene לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל למדיום שנאסף המכיל נגיףחלקיקים. מערבב היטב על ידי pipetting.
- לשאוב בינוני מתאי 3T3, ולהוסיף 1 מ"ל של התערובת הנגיפית מעל לטוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. (Polybrene משמש כדי לשפר את יעילות זיהום, אבל אינו מחויב באופן מוחלט. כפי שזה עלול להיות רעיל לתאים מסוימים, בדיקות מוקדמות מומלצות).
3. בחר תאים נגועים (יום 5 והלאה)
- עשרים וארבע שעות לאחר פגיעה, לשאוב בינוני המכיל וירוס וpolybrene מתאים נגועים, לשטוף פעם אחת עם 1x PBS, ולשנות למדיום טרי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה להתאוששות ולצמיחה.
- כאשר מתלכדים (בדרך כלל 1-2 ימים לאחר מכן), לפצל את התאים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת בינוני, aspirate מתאים (<50% מפגש הוא רצוי) ולהחליף במדיום טרי המכיל 10 מיקרוגרם / המ"ל Blasticidin כדי לבחור ליציבות transduced תאים. (Blasticidin להרוג עקום צריך להיקבע באופן אמפירי לשורת תאים מסוימות.)
4. הקלטת פליטת אור של תאי Reporter
1. תאי כתב Seed
הפץ תאי כתב Blasticidin עמידים ולפצל על מנות התרבות 35-מ"מ. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד שמתלכד. אנחנו בדרך כלל להכין ≥ 3 מנות עבור כל שורת תאי כתב תחת כל תנאים לphenotyping יממה.
2. סנכרון ושינוי להקלטה בינונית
- לשאוב בינוני מתאי כתב מחוברים, לשטוף פעם עם PBS, ולהחליף עם DMEM המכיל 10 מיקרומטר forskolin (או 200 ננומטר דקסמטזון). לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לסנכרן את התאים. (לחלופין, תאים יכולים להיות מסונכרנים במחזורי הטמפרטורה 23, או הלם סרום 24.)
- בזמן המתנה, להכין שיאבינוני ing לתאי 3T3 כדלקמן: 1x DMEM (HyClone) המכיל 10% FBS, 1x עט / דלקת / Gln, 1 מיקרומטר forskolin, 1 המ"מ luciferin, 25 HEPES מ"מ, pH 7.4. יכולים להיקבע סרום וריכוז forskolin באופן אמפירי. לתאים עמומים מאוד, בינוני פנול האדום חופשי יכול להיות בשימוש.
- בסוף טיפול forskolin, לשאוב בינוני ולהחליף עם הקלטה בינונית טרי.
3. הקלטת פליטת אור של תאי כתב
- בעקבות שינוי בינוני, לכסות מנות התרבות עם 40 המ"מ coverslips סטריליים וחותם במקום עם גריז ואקום כדי למנוע אידוי.
- טען את המנות על גבי luminometer LumiCycle, שנשמר בתוך קבוצת חממה ב 36 ° C ללא H 2 O או CO 2.
- התחל הקלטת פליטת אור בזמן אמת. אנחנו בדרך כלל להקליט מקצבים ל1 שבוע, ואחרי שינוי מדיום והקלטה רציפה לשבוע שני (ראה סאבלייב et al. לפרטים) 25. (להקלטה של 96-צלחות ll, סינרגיה SL2 שמשה כמכשיר הקלטה; ראו דיון 1.1 עבור פרט).
5. ניתוח והצגת נתונים
תאי Reporter להקל על צריבה ברזולוציה גבוהה כמו הארה, קריטית לקביעת השפעות פנוטיפי על תפקוד שעון יממה. כדי לקבל פרמטרי יממה, כוללים שלב, אורך תקופה, משרעת קצב, וקצב דעיכה, אנו משתמשים בתכנית ניתוח LumiCycle (Actimetrics) לניתוח נתוני פליטת אור 5,14. בקצרה, נתונים גולמיים הם בסיס מצויד ראשונים, ונתונים בסיסיים-נגרעו מצוידים לגל סינוס, שממנו את הפרמטרים שנקבע. לדגימות שמראות מקצבים מתמשכים, טוב, של התאמה של> 90% מושגת בדרך כלל. בשל פליטת אור חולפת גבוהה על שינוי בינוני, אנחנו בדרך כלל לא לכלול את המחזור הראשון של נתונים מניתוח.
להצגת נתונים, אנחנו בדרך כלל להתוות סדרת נתוני גלם (פליטת אור, ספירות / sec) נגד ti(ימים). בעת צורך, נתונים בסיסיים-נגרעו ניתן להתוות להשוות האמפליטודה והפאזה.
6. נציג תוצאות
1. כתבי יממת שלב ספציפיים
שעון היממה המבוסס על מנגנון משוב שלילי ביוכימי 1. לולאת משוב הליבה מורכבת ממפעילי תעתיק BMAL1 ושעון, וrepressors מצו וcrys, הפועלים על אלמנטי E / E'-תיבת היממה משפר לייצר ביטוי גנים קצבי (בשלב הבוקר, למשל, Rev-Erb α). לולאת הליבה מווסתת ומשלבת לפחות שני אלמנטי CIS אחרים יממה, אלמנט כריכת DBP/E4BP4 (D-תיבה; לשלב היום, למשל, Per3) ואלמנט כריכת רע"ש / REV-Erb (RRE; ללילה שלב, למשל, Bmal1) 17. רגולצית קומבינטורית ידי גורמי יממה מרובים יכולה ליצור שלבי ביניים רומן. לדוגמה, Cry1 תמלילבו מתווך על ידי כל השלושה אלמנטי היממה (כלומר, E / E'-תיבה ותיבת D-אלמנטים באמרגן וRREs באינטרון הראשון של Cry1 הגן), והוליד Cry1 השלב המובחן הערב בזמן 13.
בהתבסס על מנגנונים אלה של ויסות גנים, שנוצרנו 4 מבני כתב שונים: P (Per2)-ד לוק ו-P (Cry1)-d כתבי לוק המכילים גם E / E'-תיבה ואלמנטי D-box באזור הרגולציה 17, 26,27, P (Cry1) - אינטרון-d לוק מייצג רגולצית קומבינטורית על ידי כל השלושה האלמנטים (כלומר, E / E'קופסה, D-תיבה, וRRE) 13,17; ו-P (Bmal1)-ד לוק המוסדר באופן בלעדי על ידי RRE 9,17,19,21. אנחנו הצגנו לכתבים אלה לתוך תאי 3T3 כדי לייצר את השלבים הברורים הצפויים של ביטוי עיתונאי (איור 2).
2. מציאת גן באמצעות RNAi ופרמקולוגית active תרכובות
כאשר יעילות transfection היא גבוהה, siRNA הסינטטי ניתן transfected זמנית לתוך תאים כדי להפיל ביטוי גנים. כאשר transfection הוא קשה מבחינה טכנית, וקטור ביטוי shRNA יכול להיות יציבות transduced לתוך תאים באמצעות זיהום lentiviral, כך שshRNA מיוצר על ידי תאי מעובד לsiRNA למציאת גן (KD). כאן אנו מציגים תופעות KD של Cry1 וCry2 גנים באמצעות siRNA בתאי U2OS (האיור 3A) וshRNA בתאי 3T3 באמצעות וקטור pLL3.7 Gateway ביטוי 9 (איור 3 ב '). בנוסף לתאי 3T3, מודל U2OS הפך אחר מודל שעון סלולרי בולט במידה רבה משום שהיא עומדת בדרישות המפתח לתפוקה גבוהה הקרנה של ספריות siRNA אדם זמינות מסחרי (למשל, מקור אנושי, מסוגל לייצר מקצב פעילות חזק, תפקוד תוקף של כל הגנים הידועים שעון ומתאימים לtransfection והיעיל ביותרהקלטת הארה כמוני). בשני סוגי התאים, KD RNAi בתיווך הביא פנוטיפים שעון עקביים עם נוקאאוט הקודם עכבר (KO) ומחקרי KD סלולריים 5,10,11,28. לדוגמה, אורך Cry1 KD מתקצר תקופה ומפחית התמדת קצב, בעוד Cry2 KD מתארך תקופה. בנוסף, מולקולות קטנות שנבחרו יכולות לשמש למטרה פרמקולוגית ותפקוד חלבון מטריד (האיור 3C).
איור 1. מערכת מסירת גן lentivirus בתיווך. () תרשים סכמטי של 2 P lentiviral (Per2)-d וקטורי כתב לוק וCMV-EGFP לבנות. רק באזור להשתלבות הגנום התא המארח מוצג. בשני המבנים של הכתב, התעתיק של ד לוק נמצא תחת שליטה ישירה של אמרגן Per2. בpLV7-BSD-P (Per2)-ד לוק הווקטור (מחדששיבוט שילוב מבוסס), גן התנגדות Blasticidin coexpressed (BSD) מאפשר בחירה של תאים נגועים. בpLV156-P (Per2)-ד לוק וקטור (שיבוט קשירה מבוססת), תרגום EGFP מתווך על ידי אתר פנימי כניסה הריבוזום (ires) במורד זרם של ד לוק, המאפשר התבוננות וFACS מיון של תאים נגועים ויזואלי. בנוסף, SV40 אמרגן / שליחות קטלנית (P / T) משמש כמבודד (ראה דיון 1.3). בוקטור שליטת CMV-EGFP, ביטוי EGFP נמצא תחת שליטה של אמרגן CMV חזק. (B) תמונות של פלורסנט GFP-להביע transfected והנגוע בתאים. בדרך כלל, אנו להשיג יעילות גבוהה בשניהם transfection החולף של תאי 293T ובזיהום lentiviral של שורות תאים של האינטרס שלנו, כפי שצוינו על ידי ביטוי של GFP בתאים אלה. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. ביטוי שלב ספציפי של כתבי פליטת אור בתאי 3T3 וקטורי כתב lentiviral משמשים בניסוי זה הם pLV7-BSD-P (Per2)-ד לוק, P (Cry1)-ד לוק, P (Cry1) -. אינטרון-d לוק, ו-P (Bmal1)-ד לוק. כל עיתונאי מציג שלב מובהק של תנודה, כפי שצוין על ידי החיצים. בעוד Per2 ופליטת אור Cry1 יזמי כונן שיא בשלבי בוקר יום ואמרגן Bmal1 בלילה השלב, רגולצית קומבינטורית ידי P (Cry1) - אינטרון מחסה תיבת דואר, D-תיבה, ואלמנטי RRE מקנים שלב הערב של פליטת אור שיא . לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. הפרעות גנטיות ותרופתיות של מקצבי יממת פליטת אור בתאי כתב. (A) השפעות של Cry1 וCry2 מציאה ידי siRNAs על מקצבים תאיים של תאי כתב U2OS. Luminometer LumiCycle שמש להקלטת פליטת אור של תאים ב35 מנות מ"מ. איור מותאם מעיון # 10, באישור Elsevier (2009). (B) השפעות של Cry2 מציאה ידי shRNAs על מקצבים תאיים של תאי כתב 3T3. וקטור pLL3.7 Gateway המכיל קלטת U6-shRNA שמש למציאת הגן Cry2. shRNA2 יש יעילות טובה יותר מאשר מציאת shRNA1 כפי שנקבע על ידי ניתוח כתם מערבי (מידע לא מוצג). Luminometer Synergy שמש להקלטת פליטת אור של תאים בצלחת 96 היטב. ההגדרות לרישום הן כדלקמן:. טמפרטורת חממה, 33 ° C; זמן אינטגרציה, 15 שניות; זמן מרווח, 30 דקות (C) השפעות של מעכבי מולקולה קטנים על celמקצבי lular של תאי כתב U2OS. Chir99021 וRoscovitine הם מעכבים מכוונים נגד GSK-3 וCDK, בהתאמה. מערכת ViewLux (Chir99021 assay) וluminometer טקאן (Roscovitine assay) שמשו להקלטות פליטת אור של תאים בצלחות 384 כן. איור מותאם Reference # 19 (זכויות יוצרים 2008 האקדמיה הלאומית למדעים, ארה"ב). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. עשיית שינויים בפרוטוקול הנוכחי
1.1 מכשירי הקלטה ושיקולי תפוקה
בגלל הזמינות המסחרית שלה, LumiCycle (Actimetrics) הפך את מכשיר luminometer האוטומטי הנפוץ ביותר להקלטה בזמן אמת 4,5,9,19,29-31. LumiCycle מעסיק צינורות מכפילים (PMTs) כגלאי אור, המספקים רגישות גבוהה ורעש נמוך 14, ולכן מתאים במיוחד לרכישת נתונים של פליטת האור לוציפראז מבוסס מאוד עמומה. התקנים דומים אחרים PMT מבוססים (למשל, קרונוס, ATTO ושות; וPOLARstar אופטימה, BMG Labtech Inc) להשתמש גם במחקרים רבים 32,33.
Assay LumiCycle באמצעות כלי 35-מ"מ ניתן להתאים ל96 -, 384 - או אפילו פורמטי צלחת 1152-גם לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS) ניסויים. HTS assay הפיתוח מתמקד בעיקר בשני ההיבטים הבאים: 1תאים טובים יותר) עם כתב לוציפראז הבהיר וביטוי עיתונאי / או גבוה יותר (ראה להלן), ו2) מכשירי הקלטה רגישים מאוד, כי להכיל צלחות רבות כן. אנחנו ואחרים השתמשנו מספר קוראי microplate כגון סינרגיה SL2 (BioTek), האינסופי M200 (טקאן) 19, TopCount (PerkinElmer) 28, ולדמיין (פרקין אלמר) 34. במעבדה שלנו, הן LumiCycle ומכשירי Synergy ממוקמים בחממה בטמפרטורה מבוקרת ואור חזק. לחלופין, אם משאבים מאפשרים זאת, יחידות ההקלטה יכולות להיות ממוקמות בחדר עם בקרת הטמפרטורה. לHTS, הגדרות קריטיות כמו זמן אינטגרציה / חשיפה ומרווח זמן בין נקודתי זמן צריכות להיקבע באופן אמפירי לכתב ניתן ומכשיר הקלטה.
Assay LumiCycle אינו מספק מידע מרחבים ברזולוצית תא בודדה. ימגוצ'י et al. וולשית 35 ואח'. 4,5 חלוץ הדמית פליטת אור בזמן אמת על ידי integrating מיקרוסקופ תוכנן במיוחד עם מצלמה רגישה מאוד, רעש נמוך CCD 15 כדי להשיג רזולוצית תא בודדה. בשנים האחרונות, מערכות הדמיה רגישות יותר הפכו זמינות מסחרי, כוללים LV200 (אולימפוס) וCellGraph (AB3000-B, ATTO) עם מקורר רגיש ואלקטרונים מאחור מוארי הכפלת מסנני CCD וססגוני 36,37. הדמיה כמו כן נעשתה שימוש בניסויים מתוחכמים יותר, כגון HTS ViewLux CCD imager (פרקין אלמר-) בשילוב עם מערכת רובוטית האוטומטית GNF (מערכות GNF). מערכת זו אפשרה למסכים גדולים לגנים חדשים ומולקולות קטנות המשפיעים על תפקוד שעון 10,12,19.
1.2 כתבי לוציפראז
Luciferases שמשו ראשון בהקלטת הארה בזמן אמת של ביטוי גני שעון הביולוגי בתחילת 1990 במפעלים ובחוליות, ויש בדרך כלל נעשה שימוש במערכת היונקים מאז 2000 29,35,38-40 (סימפוני לראות ביקורות 14,15). כתבי וציפראז הם בדרך כלל רעילים פחות ורגישים יותר מכתבי ניאון כגון GFP, בשל רקע נמוך בהרבה 41. כתב bioluminescent הנפוץ ביותר הוא גחלילית לוציפראז (Photinus pyralis) (לוק +) נבנה בpGL3 וקטור הסדרה (Promega), שבאזור הקידוד של לוק היליד שונה לשעתוק ותרגום אופטימליים. שילוב של הגחלילית לוציפראז והמצע שלה מאוד יציב ותא חדיר, D-luciferin, הוא אידיאלי להקלטה לטווח ארוך. ד לוק הוא גרסה שונה של לוק + עם רצף דברה התמזג ב-C-התחנה הסופית שלו, כדי לאפשר פירוק חלבונים מהיר. גרסת שיפור נוספת, Luc2, זמינה בסדרת pGL4 הווקטור (Promega) עם ביטוי גבוה יותר ופחות חריג. עם זאת, אנו לא צופים שינוי משמעותי בביצועים בין לוק + וLuc2 בtransfected transiently תאי 3T3 וU2OS (מידע לא מוצג). בדו"ח שפורסם לאחרונה, לחץ ברזילאי החיפושית לוציפראז (E לוק) הוצג בתערוכת אות הרבה יותר בהירה מלוק +, מתאימה להדמית תא בודדה 42.
מחקרים רבים שנערכו לאחרונה נצלו mPER2 :: לוק איחוי עקום בעכבר 4,5,9,19,25,29-31,43 כתב. מערכת זו מאפשרת לעיתונאי phenotyping יממה של תאים והרקמות explants כולל SCN. במחקרים הקודמים שלנו, חצה את קו עכבר הכתב הזה עם רבים מknockouts גני השעון אפיין התנהגותית ובחן את הדינמיקה של מקצבי פליטת אור בSCN, כבד וריאות explants vivo לשעבר מתורבת, ונוירונים בSCN ניתקו ופיברובלסטים בתרבית במבחנה 4, 5,9,31. מחקרים אלו אפשרו לנו להשיג תובנה חשובות לפרטים המולקולריים של פעולת שעון ברמות התאים ואורגניזמים.
1.3 שיטות משלוח גן
e_content "כתבי שעון> וקטור מבוסס לספק צדדיים גדול, כפי שהם יכולים להיות הציגו לסוגי תאים שונים באמצעות transfection החולף 11,13,16,17 או תמרת lentiviral 5,9,18. למרות שתאים מסורבלים ופחות לשעתק, transfected transiently יכולים גם גדל בנוכחות הרציפה באנטיביוטיקה ליצירת שורות תאי יציבות. וקטורי lentiviral עדיין עדיפים בגלל השילוב היציב שלהם לתוך הגנום של התא, כמו גם את היעילות וגמישות רבות יותר. חוץ pLV7 הווקטור שהוצג לעיל שבתאים נגועים יכולים להיות נבחר באנטיביוטיקה, יש לנו להשתמש וקטורים אחרים. לדוגמה, pLV156-P (Per2)-ד לוק הווקטור מכיל P (Per2)-ד קלטת ביטוי לוק ires-EGFP שבתרגום EGFP מתווך על ידי כניסה הריבוזום פנימית אתר (ires) במורד זרם של ד לוק, המאפשר לתצפית חזותית ומיון התא פלואורסצנטי מופעל (FACS) של תאים עם integratוקטורי ed 5 (איור 1) (ראו להלן). כדי לגונן על העיתונאי מהשפעות אינטגרצית אתר, אמרגן מכונן ושליחות קטלנית (P / T) יכול להיות מוצג כמבודד או דמה מייד במעלה זרם של קלטת P (Per2)-ד לוק כתב הביטוי (לדוגמה, תחתון לבנות באיור 1 א ' ), כפי שדווח על ידי בראון ואח' 18. ויו et al. 5מחקרים קודמים הקימו את התשתית לחקר הפרעות גנטיות ספציפיות לרקמה בגוף חי הוא ו / או vivo לשעבר 44-48. לדוגמה, חלקיקים נגיפיים ניתן להזריק לתוך אזור SCN אחרי הכנת פרוסת SCN. כחלופה לזו in vivo אחרי assay vivo לשעבר, פרוסות SCN ניתן גזורות vivo לשעבר ראשונה ותרבותי, ואחרי דגירה עם נגיף גבוה כייל נוגדנים. עם זאת, בשל יעילות נמוכה של זיהום רקמות פרוסות עבות יחסית,פרוטוקול vivo לשעבר עקבי ביותר נשאר כדי להתפתח.
1.4 בחירה של שורות תאים ותנאי הקלטה
הרבה ממה שאנחנו יודעים על ביוכימיה והביולוגיה של תא במנגנון השעון מבוסס על שלושה דגמים סלולריים: פיברובלסטים 3T3 עכבר 16,17, תאי סרטן עצמות אדם U2OS 10,11,19,28 ופיברובלסטים עכבר נגזרים מעכברים 9,13 , 34. מערכת וקטור lentiviral מאפשרת העברה יעילה ויציבה אינטגרציה לתוך הגנום של המארח הוא חלוקה ולא חלוקה-תאי יונקים, ולכן אינה מוגבל לסוגי תאים מסוימים כבtransfection חולף. בהתחשב בתפקידים של שעוני יממה בוויסות של מגוון רחב של תגובות תאיות ופיסיולוגיות, מחקרים עתידיים יהיו בהחלט להאריך למגוון רחב של סוגי תאים, או קווים זמינים מסחרי תא או תאים עיקריים הנגזרים מעכברים. מחקרי שעון תא אוטונומיים אלה יסייעו לחשוף רקמות ubiquitous, כמו גם רקמה ספציפית, מאפיינים של שעוני יממה.
ראוי לציין כי יצירת תאי כתב עשויה לדרוש בדיקה אמפירית של כתבים שונים (למשל, סוגי וקטור ואמרגן שונים), ולפעמים אופטימיזציה נוספת. לא כל סוגי התאים יש מקצבי תא אוטונומיים. כדי לשפר את בריאות תא והתמדה של מקצבים תאיים, אופטימיזציה של הקלטה בינונית לעתים קרובות יש צורך. לדוגמה, כחלופה להקלטה הבינונית 3T3, ההקלטה הבינונית המשמשים לתאי U2OS הוא כדלקמן: 1x DMEM (Invitrogen), 2% B-27, 1 מיקרומטר forskolin, 1 המ"מ luciferin, 14.5 מ"מ, 10 NaHCO3 HEPES מ"מ (PH 7.2). 1 המ"מ luciferin הוא בדרך כלל מספיק, אבל ריכוז סופי (0.1-1 מ"מ) שייקבע לכל סוג תא / כתב. Forskolin ייתכן שלא יהיה צורך וריכוזו ניתן באופן אמפירי נקבע לכל סוג תא.
יעילות 1.5 Transfection בהכנת lentiviral
tr הגבוהיעילות ansfection של תאי 293T היא קריטית להכנה נגיפית טובה. שיקולים עיקריים כוללים בריאותם של תאים ובחירה של 293T מגיב transfection. תאי 293T יכולים להיות מאוד בררנים ודורשים טיפול זהיר. לפיכך, שיעור צמיחה ומורפולוגיה תא חייב להיות במעקב צמוד. לעקביות, אנו ממליצים להיבדק סרום ראשון ואותה תצווה נבדקה משמשת לאחר מכן לשמירה על התאים. אנחנו תמיד לבדוק BBS 2x החדש ו 2 פתרוני מניות CaCl ולייעל את עבודת ריכוז של 2 CaCl סביב 0.25 מ 'תאים של מספר גבוה מעבר ו / או הצגת שיעור צמיחה איטי לא צריך להיות בשימוש. תאי 293T הם transfectable בקלות עם מספר ריאגנטים transfection. בנוסף לקאפו 4, יש לנו גם השיג יעילות transfection מצוינת עם 6 Fugene (רוש או Promega) או Lipofectamine-2000 (Invitrogen). transfection ריאגנטים אלה מבוססי שומנים (lipofection) הם יקרים יותר, אבל לתת עקביות transfection טובה יותר מאשר קאפו 4. Fopreps lentiviral גדול r, מומלץ להשתמש CaPO4 לtransfection בגלל העלות הנמוכה יותר.
1.6 דור של שורות תאים משובטות
חלקיקים נגיפיים גולמיים בלתי מרוכזים של כייל נמוך יחסית (10 6 חלקיקים נגיפיים / מ"ל), והבעה בכתב transduced תאים הם נמוכים. אמנם זה יספיק לרוב יישומים כגון הקלטת LumiCycle, עיתונאים בהירים לעתים קרובות צורך, למשל במבחני תפוקה גבוהה באמצעות מכשיר הקלטה רגישה פחות. ביטוי כתב יכול להיות מוגבר באמצעות preps הנגיפי כייל נוגדנים גבוהים יותר. לשם כך, מומלץ להשתמש בכלי התרבות גדולות as15 מנות סנטימטר כאלה לtransfection, ואיסוף כלי תקשורת פעמים ביום 4 ויום 5. לריכוז 10x (10 7 חלקיקים נגיפיים / מ"ל), לבצע סינון באמצעות מכשירי סינון צנטריפוגליות (Millipore). לריכוז 100x או יותר (≥ 10 8 / מיליליטר חלקיקים נגיפיים), לבצע ultracentrifugation כפי שתואר לעיל
2. יישום של מודלי שעון Reporter Cell-אוטונומיים
בניגוד לדגמי רקמות או בעל חיים, מודלים מבוססי תאים ניתנים להפרעות גנטיות ותרופתיות, ובמידת צורך, גם להשתמש בפורמטי HTS. הפרעה של תפקוד גן יכולה להיות מושגת על ידי יתר ביטוי או מציאה RNAi בתיווך. מולקולות קטנות סלקטיבית יכולות לשמש כדי להפריע לתפקוד חלבון. הנה בקצרה iv שiscuss כמה שימושים של מודלי שעון תא אוטונומי במחקרי יממה.
2.1 חקר מנגנוני שעון ליבה
מודלי שעון סלולרי אוטונומיים סייעו מאוד מחקרים מכניסטית. Hogenesch ועמיתיו השתמשו במודל 3T3 להראות שדיכוי המשוב על ידי crys נדרש לתפקוד שעון 16, ומודל U2OS לחקור את מאפייני מערכת ברמה של תפקוד שעון 11. אנחנו עובדים Cry1-/ -: Cry2-/ - מודל פיברובלסטים נגזר מעכברים כדי להראות שדיכוי משוב מושהה הוא הכרחי לתפקוד שעון 13, וBmal1-/ - מודל פיברובלסטים להראות שRev-β erbα ולשחק תפקידים מיותרים ב ויסות ביטוי גנים קצבי RRE בתיווך, וכי Bmal1 קצב אינו ביקורתי הנדרש לתפקוד שעון ליבה 9. יתר על כן, הקרנה כימית בתאי כתב אפשרה זיהוי ו / או הבהרה מהפונקציות של GSK-3 β (קיצור תקופה שבה מוטרד) 19, CK1σ וε (תקופת הארכה כאשר מוטרדת) 49, 12 וCK1α. כפי שנראה להלן, מודלים אלה מאפשרים זיהוי של רכיבי שעון נוספים. מבחינה אסטרטגית, מודלים סלולריים אלה לצייתנים יותר לגילוי מהיר של מנגנונים בסיסיים, אשר לאחר מכן מספקים נקודתי כניסה חדשות לאימות ובחקר גוף חי.
2.2 זיהוי גורמי שעון
בנוסף ללולאת משוב הליבה, מנגנון השעון גם משתלב איתות מגוונת וגורמים הרגולטוריים. לזיהוי רכיבי שעון נוספים ומכפילים, מודלי שעון תא אוטונומי הם יתרון על פני סריקה גנטית בעכברים בשל הקטלניות הטבועות, אפקטי pleiotropic, והפיצוי גנטי התפתחותית קשור למודלים של בעלי חיים מוטנטים 50. מסכים מבוססי תאים, בשילוב עם appro הגנומיקהכאבים, בוצעו בצורה יעילה באמצעות מערכות הקלטת תפוקה גבוהה לsiRNA מסך הגנום וספריות shRNA לזיהוי גורמי שעון רומן 10,28. כמו כן, אחד יכול להעסיק גישות ביולוגיות כימיות ומסך למולקולות קטנות שונות כדי ללמוד את השפעותיהם על תפקוד שעון 12,19,34,49. למרות שגנים של שעון גדולים והפונקציות שלהם זוהו, מסכים אלו זיהו רכיבים או מכפילים נוספים שמעורבים ברגולציה או אפנון של השעון. רבים ממכפילים אלה מייצגים אופנים מסוימים של שילוב העברת אותות של רמזי סינכרוני או אסינכרוני (תשומות שעון).
2.3 חקר תפוקות שעון
למרות שכמעט כל התאים בגוף חי יש שעוני יממה, תאים בתרבית במבחנה איננו בהכרח להציג מקצבי יממה גלויים. בהקשר זה, גישת הכתב מספקת כלי שימושי כדי לבדוק אםמנגנון שעון קיים בסוג תא מסוים. נוכחות של מנגנוני שעון תא אוטונומיים מתחייבת מחקרים של פלטי שעון בתאים אלה, כמו גם ברקמות בגוף חי, כולל transcriptome ידי microarray או RNA רצף 51,52, רשתות רגולטוריות תעתיק, Proteome, וmetabolome. מחקרים אלו בודקים RNA הגנום ודפוסי ביטוי חלבון ובכך ישלימו את מבחני כתב הארה מבוססות תאים שאינם בהכרח משקפים את ביטוי אנדוגני.
3. משמעות של מודלי שעון סלולרי אוטונומיים
תיאום פונקצית יממה בתוך SCN ועל פני תא וסוגי רקמות שונים הוא היבט קריטי של 30 פיזיולוגיה נורמלית. SCN המרכזי ושעוני פריפריה הם כל החלקים החיוניים של ארגון צירקדי באופן כללי. SCN מקבל קלט אור ישירות מהרשתית לעלות על רכבת למחזור האור / חושך, ומשמש כרכז לסנכרון שעונים היקפיים באמצעות חיבורים עצביים והן הורמונלי. בנוסף לסנכרון הפנימי, השעון המולקולרי בתוך רקמות ותאים היקפיים גם מנצח מספר עצום של רשתות פלט תעתיק, שסופו של דבר שולטים בקצב יממה גלוי בפיזיולוגיה והתנהגות.
לפיכך, שני אותות מערכתיים ומקומיים להסדיר פיזיולוגית יממה, ויש צורך לחשוף גני יממה מוסדרת ישירות על ידי שעוני תא אוטונומי לעומת אלה מוסדרים באופן עקיף על ידי אותות מערכתיים הנובעים מSCN. התפקיד של שעונים היקפיים ניתן ללמוד במודלי שעון תאים אוטונומיים, שבו השפעות מערכתיות יוסרו. במקרה של הכבד, רשתות רגולטוריות רקמות ספציפיות לייצר מקצבים בפיזיולוגיה מקומית 51,53. על ידי השוואה במבחנה במקצבי יממת vivo, אהיה מסוגל להבחין בין פונקציות שעון קיו מונעות תא אוטונומיות ומערכתיות. אכן, recenמחקרי t החלו לחשוף תפקיד משמעותי לשעון הכבד בביטוי גנים בכבד 6,51,52. מחקרים עתידיים בתחום פיתוח צווי מודלים שונים רקמות ותאים ספציפיים לסוג שעון מייצגים תפוקות פיסיולוגיות שונות.
מחקרים קודמים של ביוכימיה והביולוגיה של תא במנגנון השעון הסתמכו במידה רבה על מספר מוגבל של סוגי תאים ורקמות, ובמיוחד 3T3, U2OS, פיברובלסטים עכבר, ובכבד. הנחה מובלעת ברוב מחקרי יממה היא שהשעון עובד באותו אופן בכל התא וסוגי רקמות, ותפקוד גן נקבע בתא אחד או סוג הרקמה נחשב בדרך כלל להחלה אוניברסלית בכל התאים 7. עם זאת, על ידי הקמה ואפיון מודלי שעון תא אוטונומיים יותר, מחקרים עתידיים צפויים לחשוף מאפייני שעון ספציפיים רקמות שבבסיס ביולוגית יממה מקומית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן הלאומי למדע (IOS-0920417) (ACL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
| DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
| FBS | HyClone | SH3091003 | |
| Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| All other chemicals | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37 °C | ||
| Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
| Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
| LumiCycle | Actimetrics | ||
References
- Reppert, S. M., Weaver, D. R.
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., Maywood, E. S. A clockwork web: circadian timing in brain and periphery, in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 4, 649-661 (2003).
- Nagoshi, E. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119, 693-705 (2004).
- Welsh, D. K. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr. Biol. 14, 2289-2295 (2004).
- Liu, A. C. Intercellular coupling confers robustness against mutations in the SCN circadian clock network. Cell. 129, 605-616 (2007).
- Kornmann, B. System-driven and oscillator-dependent circadian transcription in mice with a conditionally active liver clock. PLoS Biol. 5, e34 (2007).
- Hogenesch, J. B., Herzog, E. D. Intracellular and intercellular processes determine robustness of the circadian clock. FEBS Lett. 585, 1427-1434 (2011).
- DeBruyne, J. P., Weaver, D. R., Reppert, S. M. Peripheral circadian oscillators require CLOCK. Curr. Biol. 17, 538-539 (2007).
- Liu, A. C. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4, e1000023 (2008).
- Zhang, E. E. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, 199-210 (2009).
- Baggs, J. E. Network features of the mammalian circadian clock. PLoS Biol. 7, e52 (2009).
- Hirota, T. High-throughput chemical screen identifies a novel potent modulator of cellular circadian rhythms and reveals CKIalpha as a clock regulatory kinase. PLoS Biol. 8, e1000559 (2010).
- Ukai-Tadenuma, M. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Sato, T. K. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nat. Genet. 38, 312-319 (2006).
- Ueda, H. R. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat. Genet. 37, 187-192 (2005).
- Brown, S. A. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLoS Biol. 3, e338 (2005).
- Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20746-20751 (2008).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Ueda, H. R. A transcription factor response element for gene expression during circadian night. Nature. 418, 534-539 (2002).
- Zufferey, R., Donello, J. E., Trono, D., Hope, T. J. Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J. Virol. 73, 2886-2892 (1999).
- Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330, 379-385 (2010).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U.A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A., Lundkvist, G. B. S. Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus. J. Vis. Exp. (48), e2439 (2011).
- Akashi, M., Ichise, T., Mamine, T., Takumi, T. Molecular mechanism of cell-autonomous circadian gene expression of Period2, a crucial regulator of the mammalian circadian clock. Mol. Biol. Cell. 17, 555-565 (2006).
- Ohno, T., Onishi, Y., Ishida, N. A novel E4BP4 element drives circadian expression of mPeriod2. Nucleic Acids Res. 35, 648-655 (2007).
- Maier, B. A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes Dev. 23, 708-718 (2009).
- Yoo, S. H. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 5339-5346 (2004).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat. Chem. Biol. 3, 630-639 (2007).
- Ko, C. H. Emergence of noise-induced oscillations in the central circadian pacemaker. PLoS Biol. 8, e1000513 (2010).
- Izumo, M., Johnson, C. H., Yamazaki, S. Circadian gene expression in mammalian fibroblasts revealed by real-time luminescence reporting: temperature compensation and damping. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16089-16094 (2003).
- Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput. Biol. 2, e136 (2006).
- Chen, Z. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 101-106 (2011).
- Yamaguchi, S. Synchronization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Akashi, M., Hayasaka, N., Yamazaki, S., Node, K. Mitogen-activated protein kinase is a functional component of the autonomous circadian system in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 28, 4619-4623 (2008).
- Hoshino, H., Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Luciferase-YFP fusion tag with enhanced emission for single-cell luminescence imaging. Nat. Methods. 4, 637-639 (2007).
- Asai, M. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr. Biol. 11, 1524-1527 (2001).
- Wilsbacher, L. D. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 489-494 (2002).
- Yamazaki, S. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Imaging: A Laboratory Manual. Yuste, R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 369-385 (2011).
- Nakajima, Y. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, e10011 (2010).
- Guilding, C. A riot of rhythms: neuronal and glial circadian oscillators in the mediobasal hypothalamus. Mol. Brain. 2, 28 (2009).
- O'Neill, J. S. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Fuller, P. M., Lu, J., Saper, C. B. Differential rescue of light- and food-entrainable circadian rhythms. Science. 320, 1074-1077 (2008).
- Mukherjee, S. Knockdown of Clock in the ventral tegmental area through RNA interference results in a mixed state of mania and depression-like behavior. Biol. Psychiatry. 68, 503-511 (2010).
- Saijo, K. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death. Cell. 137, 47-59 (2009).
- Elias, G. M. Synapse-specific and developmentally regulated targeting of AMPA receptors by a family of MAGUK scaffolding proteins. Neuron. 52, 307-320 (2006).
- Isojima, Y. CKIepsilon/delta-dependent phosphorylation is a temperature-insensitive, period-determining process in the mammalian circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15744-15749 (2009).
- Bucan, M., Abel, T. The mouse: genetics meets behaviour. Nat. Rev. Genet. 3, 114-123 (2002).
- Hughes, M. E. Harmonics of circadian gene transcription in mammals. PLoS Genet. 5, e1000442 (2009).
- Atwood, A. Cell-autonomous circadian clock of hepatocytes drives rhythms in transcription and polyamine synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 18560-18565 (2011).
- Panda, S. Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell. 109, 307-320 (2002).
