Overvåking Cell-autonome biologiske klokke Rhythms of Gene Expression Bruke luciferase Bioluminescens Reporters

Summary

Fungere biologiske klokka innenfor enkelte cellene, dvs. de er celle-autonomt. Her beskriver vi metoder for generering celle-autonome klokke modeller med ikke-invasiv, luciferase-baserte sanntids bioluminescens teknologi. Reporter celler gir medgjørlig, funksjonelle modellsystem for å studere circadian biologi.

Abstract

I pattedyr, er mange aspekter av atferd og fysiologi som søvn-våkne syklus og levermetabolisme regulert av endogene biologiske klokka (anmeldt ^1,2). Circadian tidtaking systemet er et hierarkisk multi-oscillator nettverk, med den sentrale klokken ligger i suprachiasmatic nucleus (SCN) synkronisering og koordinere ekstra SCN og perifere klokker steder ^1,2. Individuelle celler er de funksjonelle enheter for produksjon og vedlikehold av døgnrytme ^3,4, og disse oscillatorer av ulike typer vev i organismen dele en bemerkelsesverdig lik biokjemisk negative tilbakemeldinger mekanisme. Imidlertid, på grunn av interaksjoner på neuronal nettverksnivå i SCN og gjennom rytmiske, systemiske pekepinner på organismebiologi nivå, døgnrytme på organismebiologi nivå ikke nødvendigvis celle-autonomt ^5-7. Sammenlignet med tradisjonelle studier av lokomotorisk aktivitet in vivo og SCN eksplanter ex vivo, cell-basert in vitro tillate for oppdagelsen av celle-autonome circadian defekter ^5,8. Strategisk, celle-baserte modeller er mer eksperimentelt medgjørlig for fenotypisk karakterisering og rask oppdagelse av grunnleggende klokke mekanismer ^5,8-13.

Fordi døgnrytmen er dynamiske, er langsgående målinger med høy tidsoppløsning nødvendig for å vurdere klokke funksjon. I de senere årene har real-time Bioluminescens opptak med firefly luciferase som reporter blitt en vanlig teknikk for å studere døgnrytme hos pattedyr ^14,15, som gjør det mulig for undersøkelse av utholdenhet og dynamikk av molekylære rytmer. Å overvåke celle-autonome døgnrytme av genuttrykk, kan luciferase journalister bli introdusert inn i cellene via forbigående transfeksjon ^13,16,17 eller stabil transduksjon ^5,10,18,19. Her beskriver vi en stabil transduksjon protokollen ved hjelp av lentivirus-mediert genet levering. Than lentiviral vektor systemet er bedre enn tradisjonelle metoder som forbigående transfeksjon og kimlinje overføring på grunn av sin effektivitet og fleksibilitet: den tillater effektiv levering og stabil integrering i verten genomet av både delende og ikke-delende celler ^20. Når en reporter cellelinje er etablert, kan dynamikken i klokkefunksjon bli undersøkt gjennom Bioluminescens opptak. Vi først beskrive generasjon av P (Per2)-d Luc reporter linjer, og deretter presentere data fra denne og andre biologiske journalister. I disse analysene er 3T3 mus fibroblaster og U2OS menneskelige osteosarkom celler brukes som cellulære modeller. Vi diskuterer også ulike måter å bruke disse klokke modeller i circadian studier. Metoder beskrevet her kan brukes til et stort utvalg av celletyper for å studere den cellulære og molekylære basis av cirkadianske klokker, og kan vise seg nyttig i å takle problemer i andre biologiske systemer.

Protocol

1. Bygging av lentiviral luciferase Reporters

En pattedyr circadian reporter konstruksjon inneholder vanligvis en ekspresjonskassett hvor en circadian promoter er smeltet sammen med den luciferase genet. Både ligation-og rekombinasjon-baserte strategier blir ofte brukt for DNA kloning. Som et eksempel, her vi beskrive en rekombinasjon-basert Gateway kloning metode for generering av et P (Per2)-d Luc lentiviral reporter, der destabilisert luciferase (d Luc) er under kontroll av musen Per2 promotoren.

1. Kloning av Per2 promoter. Bruke PCR for å forsterke Per2 promotor DNA-fragment på 526 bp, oppstrøms for transkripsjons startwebstedet fra en mus Per2 BAC klone ^9-13, ved hjelp av en forover primer (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') og en motsatt primer (5' -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 '), og klon inn pENTR5'-TOPO vektor (Invitrogen) for å genererepENTR5'-P (Per2).
2. Kloning av d Luc. D Luc inneholder ildflue luciferase genet og en C-terminalt PEST sekvens for rask proteinnedbrytingen som tidligere beskrevet ^21. Bruk PCR å forsterke d Luc DNA fragment, og klone i pENTR / D-TOPO vektor (Invitrogen) for å generere pENTR / Dd Luc.
3. Bygging av reporter vektor. Bland de to pENTR plasmider, pENTR5'-P (Per2) og pENTR / Dd Luc, med lentiviral destinasjon vektor pLV7-BSD (BSD, blasticidin motstand genet), og utfører rekombinasjon reaksjonen ved hjelp Clonase å generere en pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc reporter (figur 1). pLV7-BSD er en modifisert versjon (laget i vårt laboratorium) av pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) hvori Woodchuck hepatitt virus etter transkripsjonsregulerende Element (WPRE) sekvenser ²² ble innsatt umiddelbart nedstrøms av uttrykket CA ssette å forbedre genuttrykk.

2. Produksjon av lentiviral Partikler

1. Seed 293T celler (dag 1)

1. Grow humane embryonale nyre (HEK) 293T celler til 90-100% konfluens i vanlig DMEM supplert med 10% FBS og 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG) på 10 cm kultur retter. (Raskt voksende celler med lav passasje nummer er avgjørende for effektiv transfeksjon.)
2. Før såing cellene for transfeksjon, frakk 6-brønners kultur plater ved å tilsette 1 ml av 0,001% poly-L-lysin i PBS til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 20 min. Aspirer løsningen og skyll gang med 1x PBS før bruk.
3. Dissosierer 293T celler med trypsin og frø 0,75 x 10 ⁶ celler bort på hver brønn av de forbelagte plater med 2 ml vanlig DMEM. Virvel platene grundig for å oppnå en jevn fordeling av celler i hver brønn. Dyrke cellene i inkubator ved 37 ° C over natten.

tep "> 2. Transient transfeksjon Via Capo ₄ / DNA nedbør (dag 2)

1. Observere seeded celler fra dag 1. Cell bør nå samløpet av 80-90%.
2. Forbered plasmid transfeksjon blanding i et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved tilsetning av 2 ug en lentiviral reporter plasmid-DNA (f.eks pLV7-P (Per2)-d Luc; Liu lab) og de ​​3 emballasje vektorer (1,3 ug Gag / Pol, 0,5 ug rev, og 0,7 ug VSVG; Invitrogen). Som en kontroll for både transfeksjon og påfølgende infeksjon, vi vanligvis inkludere ekstra brønn i transfeksjon for en lentiviral GFP ekspresjonsvektor, pLV156-CMV-EGFP (figur 1A), husing forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under kontroll av CMV-promotoren som beskrevet tidligere ^20.
3. Legg 100 pl 0,25 M CaCl ₂ (fortynnet med DNase / RNase-fri DDH ₂ O fra 2,5 M lager) til plasmidet blanding i trinn 2 og bland godt. Deretter legge 100fil 2x BBS løsning (50 mmS, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na _{2 4} HPO, pH 6.95) og bland forsiktig, men grundig. Inkuber DNA blanding ved romtemperatur i 15 min.
4. Mens du venter, aspirere medium fra 293T celler og endre til 2 ml friskt medium. Returnere platen til inkubatoren i minst 10 min for å ekvilibrere middels pH før transfeksjon.
5. Legg transfeksjon mix fra trinn 3 til 293T celler dråpe for dråpe. Swirl platen forsiktig og observere dannelse under et mikroskop. Inkuber ved 5% CO _2, 37 ° C over natten. (Fine partikkel dannelse av Capo ₄ / DNA bunnfall er kritisk for effektiv transfeksjon.)

3. Høste viruspartikler (dager 3-4)

1. Ca 16 timer etter transfeksjon (dag 3) og da cellene skal nå 100% samløpet, aspirere medium fra celler og erstatte med 2 ml frisk vanlige DMEM. Inkuber ved 37 ° C over natten.
2. På dag 4, vurdere transfeksjon effektivitet ved å observere EGFP uttrykk i transfection kontroll celler (Transfeksjon effektivitet på 90-100% med høy EGFP uttrykk er en pålitelig prediktor for en god viral prep.)
3. Samle mediet inneholdende utskilles, infeksiøse viruspartikler. Sentrifuger ved> 2000 xg i 5 min for å fjerne gjenværende celler og 293T samle viruset-inneholdende supernatant. Alternativt kan mediet klareres med en 0,45 um membranfilter. De virale partikler er klare til bruk i infeksjon.

3. Infeksjon i 3T3 celler

1. Seed 3T3 celler (dag 3)

Splitt og frø passende antall (~ 12000) av 3T3-celler på en 12-brønns plate for å oppnå 20-30% konfluens ved neste dag. Inkuber ved 37 ° C over natten.

2. Infisere 3T3 celler (dag 4)

1. Observere seeded celler. Samløpet av 20-30% (mindre enn 50%) er ønskelig for infeksjon.
2. Legg polybren til en endelig konsentrasjon på 5 pg / ml til det oppsamlede medium inneholdende viralpartikler. Bland godt av pipettering.
3. Aspirer medium fra 3T3 celler, og tilsett 1 ml av ovennevnte blanding viral per brønn. Inkuber ved 37 ° C over natten. (Polybren brukes til å forbedre infeksjon effektivitet, men er ikke absolutt nødvendig. Som det kan være giftig for noen celler, er forutgående testing anbefales.)

3. Velg infiserte celler (dag 5 og nyere)

1. Tjuefire timer etter infeksjon, aspirer medium som inneholder virus og polybren fra infiserte celler, vask en gang med 1x PBS, og endre til frisk medium. Inkuber ved 37 ° C over natten for utvinning og vekst.
2. Når konfluent (vanligvis 1-2 dager senere), dele cellene og inkuber ved 37 ° C over natten.
3. Den følgende dag, aspirat medium fra celler (<50% konfluens er ønsket) og erstatte med frisk medium inneholdende 10 ug / ml Blasticidin å selektere for stabilt transduced celler. (Blasticidin kill-kurve må empirisk bestemt for en bestemt cellelinje.)

4. Bioluminescens Innspillingen av Reporter Cells

1. Seed reporter celler

Forplante Blasticidin-resistente reporter celler og delt på 35 mm kultur retter. Inkuber ved 37 ° C til konfluent. Vi vanligvis forberede ≥ 3 retter for hver reporter cellelinje under hver betingelse for circadian fenotyping.

2. Synkronisering og endring opptaksmedium

1. Aspirere medium fra confluent reporter celler, vask en gang med PBS, og erstatte med DMEM inneholder 10 mikrometer forskolin (eller 200 nM deksametason). Inkuber ved 37 ° C i 1 time for å synkronisere cellene. (Alternativt, kan cellene synkroniseres ved temperatur sykluser ²³ eller serum sjokk ^24).
2. Mens du venter, forberede postening medium for 3T3-celler som følger: 1x DMEM (HyClone) inneholdende 10% FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 uM forskolin, 1 mM luciferin, 25 mM HEPES, pH 7,4. Serum og forskolin konsentrasjon kan bestemmes empirisk. For svært dim celler, kan fenol rød-fritt medium brukes.
3. På slutten av forskolin behandling aspirere medium og erstatte med ferske opptaksmedium.

3. Bioluminescens opptak av reporter celler

1. Etter medium endring, dekker kultur retter med 40 mm sterile dekkglass og pakningen på plass med vakuum fett for å hindre fordamping.
2. Sette inn serviset på LumiCycle luminometeret, som holdes inne i en inkubator sett ved 36 ° C uten H ₂ O eller CO _2.
3. Begynn sanntid bioluminescens opptak. Vi vanligvis ta rytmer for 1 uke, etterfulgt av middels endring og kontinuerlig opptak for andre uke (se Savelyev et al. For detaljer) ^25. (For opptak av 96-vill plater, Synergy SL2 ble brukt som opptaksenheten, se diskusjon 1.1 for detaljer).

5. Data analyse og presentasjon

Reporter celler rette høy oppløsning kvantitative luminescence opptak, avgjørende for å fastslå fenotypiske effekter på biologiske klokke funksjon. Å skaffe døgnrytmen parametere inkludert fase, perioden lengde, rytme amplitude, og demping rente, bruker vi LumiCycle Analysis programmet (Actimetrics) for å analysere bioluminesens data ^5,14. Kort, rådata er baseline montert en først, og baseline-subtraherte data er utstyrt til en sinusbølge, som parametrene er bestemt. For prøver som viser vedvarende rytmer, godhet-of-fit på> 90% er vanligvis oppnås. På grunn av høy transient Bioluminescens upon middels endring, vi vanligvis utelukker den første syklusen av data fra analysen.

For data presentasjon, vi vanligvis plotte rådata (bioluminesens, teller / sek) mot timeg (dager). Når det er nødvendig, kan baseline-subtraherte data planla å sammenligne amplitude og fase.

6. Representant Resultater

1. Fase-spesifikke biologiske journalister

Den biologiske klokke er basert på en biokjemisk negativ feedback mekanisme ^en. Kjernen feedback loop består av transcriptional aktivatorer BMAL1 og klokke, og repressors pers og krystall, som fungerer på de circadian E / E'-box enhancer elementer for å oppnå rytmisk genuttrykk (med morgen fase, for eksempel Rev-Erb α). Kjernen sløyfe regulerer og integrerer minst to andre circadian cis-elementer, DBP/E4BP4 bindende element (D-box, for dagen fase, f.eks Per3) og ROR / REV-ERB bindende element (RRE, for natt fase, f.eks Bmal1) ^17. Kombinatorisk regulering av flere biologiske elementer kan generere nye mellomliggende faser. For eksempel Cry1 transcripsjon er mediert av alle tre circadian elementer (dvs. E / E'-boks og D-boks elementer i promotoren og RREs i første intron av Cry1 genet), som gir opphav til den distinkte Cry1 kveld-tid fase ^13.

Basert på disse mekanismene genregulering, genererte vi fire forskjellige reporter konstruerer: P (Per2)-d Luc og P (Cry1)-D Luc journalister som inneholder både E / E'-boksen og D-box elementer i regelverket regionen ^{17, 26,27,} P (Cry1) - Intron-d Luc representerer kombinatorisk regulering av alle tre elementene (dvs. E / E'-box, D-boksen, og RRE) ^13,17, og P (Bmal1)-d Luc regulert eksklusivt av RRE ^9,17,19,21. Vi innført disse reporterne inn 3T3 celler til å produsere de forventede distinkte faser av reporter uttrykksformer (figur 2).

2. Gene knockdown via RNAi og farmakologisk aktivive forbindelser

Når transfeksjon effektivitet er høy, kan syntetisk siRNA bli forbigående transfekteres i celler for å slå ned genuttrykk. Når transfeksjon er teknisk vanskelig, kan en shRNA ekspresjonsvektor være stabilt transduced inn celler via lentiviral infeksjon, slik at shRNA produsert av cellen er behandlet til siRNA for genet knockdown (KD). Her presenterer vi KD effekter av Cry1 og Cry2 gener ved hjelp siRNA i U2OS celler (figur 3A) og shRNA i 3T3-celler ved hjelp av en pLL3.7 Gateway ekspresjonsvektor ⁹ (Figur 3B). I tillegg til 3T3 celler, har U2OS modellen blitt en annen fremtredende mobilnettet klokke modell i stor grad fordi det oppfyller de viktigste kravene til high-throughput screening av kommersielt tilgjengelige menneskelige siRNA biblioteker (f.eks human opprinnelse, i stand til å generere robuste døgnrytme, validert funksjon av alle kjente klokke gener, og mottagelig for svært effektiv transfeksjon ogkvantitativ luminescence opptak). I begge celletyper, resulterte RNAi-mediert KD i klokke fenotyper konsistent med tidligere mus knockout (KO) og cellulære KD studier ^5,10,11,28. For eksempel Cry1 KD forkorter perioden lengde og reduserer rytme utholdenhet, mens Cry2 KD forlenger perioden. I tillegg, kan valgte små molekyler brukes til farmakologisk målet og forurolige protein funksjon (figur 3C).

Figur 1. Den lentivirus-mediert gen leveringssystem. (A) Skjematisk diagram av to lentiviral P (Per2)-d Luc reporter vektorer og CMV-EGFP konstruere. Bare området for integrering inn i vertscellen genomet er vist. I begge reporter konstruerer er transkripsjon av d Luc under direkte kontroll av Per2 promotoren. I pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc vektor (reKombinasjonen-baserte kloning), muliggjør en coexpressed Blasticidin motstand genet (BSD) utvalg av infiserte celler. I pLV156-P (Per2)-d Luc vektor (ligation-basert kloning), er EGFP oversettelse mediert av en intern ribosom oppføring området (IRES) nedstrøms d Luc, noe som åpner for visuell observasjon og FACS sortering av infiserte celler. I tillegg, en SV40 promoter / terminator (P / T) brukes som en isolator (se diskusjonen 1.3). I CMV-EGFP kontroll vektor, er EGFP uttrykk under kontroll av en sterk CMV promoter. (B) Fluorescerende bilder av transfekterte og infisert GFP-uttrykkende celler. Vanligvis oppnår vi høy effektivitet både i forbigående transfeksjon av 293T celler og i lentiviral infeksjon av cellelinjer av vår interesse, som angitt av GFP uttrykk i disse cellene. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Fase-spesifikk ekspresjon av bioluminesens reportere i 3T3-celler De lentiviral rapportørgrupper vektorer som brukes i dette eksperimentet er pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc, P (Cry1)-d Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, og P (Bmal1)-d Luc. Hver reporter fremviser tydelig fase for pendling, som indikert av pilene. Mens Per2 og Cry1 arrangører drive peak Bioluminescens på morgenen-dagers faser og Bmal1 promoter natten fase, kombinatorisk regulering av P (Cry1) - Intron harboring E-box, gir D-boksen, og RRE elementer kveld fase av peak Bioluminescens . Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Genetisk og farmakologiske forstyrrelser i døgnrytmen bioluminesens rytmer i reporter celler. (A) Effekter av Cry1 og Cry2 knockdown av siRNAs på cellulære rytmer U2OS reporter celler. Den LumiCycle luminometer ble brukt for Bioluminescens opptak av celler i 35 mm skåler. Figuren er tilpasset fra Reference # 10, med tillatelse fra Elsevier (2009). (B) Effekter av Cry2 knockdown av shRNAs på cellulære rytmer 3T3 reporter celler. En pLL3.7 Gateway vektor som inneholder en U6-shRNA kassett ble brukt for Cry2 gene knockdown. shRNA2 har en bedre knockdown effektivitet enn shRNA1 som bestemmes av Western blot analyse (data ikke vist). Synergi luminometer ble brukt for Bioluminescens opptak av celler i en 96-brønns plate. Innstillingene for opptak er som følger:. Inkubator temperatur, 33 ° C; integrasjonstid, 15 sek; intervalltid, 30 min (c) Effekt av små molekyl-inhibitorer for cellular rytmer U2OS reporter celler. Chir99021 og Roscovitine er inhibitorer rettet mot GSK-3 og CDK, henholdsvis. Den ViewLux system (Chir99021 analyse) og en Tecan luminometer (Roscovitine analyse) ble brukt for bioluminesens opptak av celler i 384-brønners plater. Tallet er tilpasset fra Reference 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA). Klikk her for å se større figur .

Discussion

1. Modifikasjoner Gjeldende protokoll

1.1 Opptak enheter og gjennomstrømning hensyn

På grunn av sin kommersielle tilgjengeligheten, har LumiCycle (Actimetrics) blitt den mest brukte automatisert luminometer enhet for sanntids opptak ^{4,5,9,19,29-31.} Den LumiCycle sysselsetter fotomultiplikator-rør (PMTs) som lys detektorer, som gir ekstremt høy følsomhet og lavt støynivå ^14, og derfor er spesielt egnet for datainnsamling av svært svak luciferase-baserte bioluminesens. Andre lignende PMT-baserte enheter (f.eks Kronos, Atto Co, og POLARstar Optima, BMG LabTech Inc.) har også blitt brukt i mange studier ^32,33.

Den LumiCycle analysen ved hjelp av 35 mm retter kan tilpasses til 96 -, 384 - eller til og med 1152-brønners plate formater for high-throughput screening (HTS) eksperimenter. HTS analysen utvikling fokuserer hovedsakelig på følgende to aspekter: 1) Bedre reporter celler med lysere luciferase og / eller høyere reporter uttrykk (se nedenfor), og 2) svært sensitive opptaksenheter som rommer multi-brønners plater. Vi og andre har brukt flere mikroplate lesere som Synergy SL2 (BioTek), Infinite M200 (Tecan) ^19, TopCount (PerkinElmer) ^28, og ser (Perkin Elmer) ^34. I vårt laboratorium, blir både LumiCycle og Synergy enheter plassert i en temperaturkontrollert og lys-tight kuvøse. Alternativt, hvis ressursene tillater, kan opptaksenheter plasseres i et temperaturkontrollert rom. For HTS, må kritiske innstillinger som integrering / eksponeringstid og intervall mellom tidspunkter bestemmes empirisk for en gitt reporter og opptaksenhet.

Den LumiCycle analysen gir ikke romlig informasjon på én celle oppløsning. Yamaguchi et al. ³⁵ og Welsh et al. ^4,5 pioner sanntid Bioluminescens bildebehandling av integrating en spesialdesignet mikroskop med en svært følsom, støysvak CCD kamera ¹⁵ for å oppnå enkelt celle oppløsning. I de senere årene har mer følsomme imaging-systemer blir kommersielt tilgjengelig, inkludert LV200 (Olympus) og CellGraph (AB3000-B, Atto) med en ultrasensitive avkjølte og back-belyste elektron multiplisere CCD og flerfarget filtre ^36,37. Imaging har også blitt brukt i mer sofistikerte HTS eksperimenter, f.eks en ViewLux CCD bildesensor (Perkin-Elmer) kombinert med GNF automatisert robot system (GNF Systems). Dette systemet aktivert store skjermer for nye gener og små molekyler som påvirker klokkefunksjon ^10,12,19.

1,2 luciferase journalister

Luciferases ble først brukt i real-time luminescence opptak av circadian genuttrykk i begynnelsen av 1990 i planter og cyanobakterier, og har blitt brukt i pattedyr-systemet siden 2000 ^29,35,38-40 (aLSO se vurderinger ^14,15). Luciferase journalister er generelt mindre giftige og mer følsom enn fluorescerende reportere som GFP, på grunn mye lavere bakgrunn ^41. Den mest brukte bioluminescent reporter er ildflue (Photinus pyralis) luciferase (Luc +) konstruert i pGL3 vektoren serien (Promega), i hvor den kodende regionen av de innfødte Luc ble modifisert for optimalisert transkripsjon og translasjon. Kombinasjonen av firefly luciferase og dens meget stabilt og celle-gjennomtrengelig substrat, D-luciferin, er ideell for langsiktig opptak. d Luc er en modifisert versjon av Luc + med PEST sekvens sammensmeltet ved sin C-terminus for å tillate rask proteinnedbrytingen. En ytterligere forbedret versjon, Luc2, er tilgjengelig på pGL4 vektor-serien (Promega) med høyere og mindre avvikende uttrykk. Men vi gjorde ikke observere en signifikant forskjell i ytelse mellom Luc + og Luc2 i forbigående transfektert 3T3 og U2OS celler (data ikke vist). I en fersk rapport, ble brasilianske klikk beetle luciferase (E Luc) vist seg å utstille en mye lysere signal enn Luc +, egnet for enkelt celle bildebehandling ^42.

Mange nyere studier har tatt nytte av mPER2 :: LUC fusion knock-in reporter mus ^{4,5,9,19,25,29-31,43.} Dette reporter systemet tillater circadian fenotyping av celler og vev explants inkludert SCN. I våre tidligere studier, krysset vi denne reporteren mus linje med mange av de behaviorally preget klokke genet knockouts og undersøkt dynamikken i bioluminesens rytmer i SCN, lever og lunge explants kultivert ex vivo, og i dissosiert SCN nevroner og fibroblaster dyrket in vitro ^{4, 5,9,31.} Disse studiene tillatt oss å få viktig innsikt i de molekylære detaljene klokke på cellen og organismebiologi nivåer.

1,3 Gene leveringsmåter

e_content "> Vector-basert klokke reportere gir stor allsidighet, som de kan bli introdusert til ulike celletyper via forbigående transfeksjon ^11,13,16,17 eller lentiviral transduksjon ^5,9,18. Selv tungvint og mindre reproduserbar, forbigående transfektert celler kan også dyrkes i kontinuerlig nærvær av antibiotika for å generere stabile cellelinjer. lentiviral vektorer fortsatt foretrukket på grunn av deres stabile integrering i cellens genom, samt større effektivitet og fleksibilitet. Foruten pLV7 vektor presentert ovenfor hvor infiserte celler kan være valgt med antibiotika, har vi brukt andre vektorer. For eksempel inneholder pLV156-P (Per2)-d Luc vektor a P (Per2)-d Luc-IRES-EGFP ekspresjonskassett der EGFP oversettelsen er mediert av en intern ribosom oppføring Site (IRES) nedstrøms d Luc, slik at for visuell observasjon og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) av celler med integrerted vektorer ⁵ (figur 1) (se nedenfor). Å skjerme reporteren fra integrering reiser effekter, en konstitutiv promoter og terminator (P / T) kan bli innført som en isolator eller Decoy umiddelbart oppstrøms av P (Per2)-d Luc reporter ekspresjonskassett (for eksempel bunn konstruere i figur 1A ), som rapportert av Brown et al. ¹⁸ og Liu et al. ⁵

Tidligere studier etablerte grunnlaget for utforskning av vev-spesifikk genetisk forstyrrelse både in vivo og / eller ex vivo ^44-48. For eksempel, kan virale partikler injiseres i SCN regionen etterfulgt av SCN stykke forberedelse. Som et alternativ til dette in vivo etterfulgt av ex vivo-forsøk, kan SCN skiver bli dissekert første og kultivert ex vivo, fulgt av inkubasjon med høy titer virus. Imidlertid, på grunn av lavt infeksjon effektivitet relativt tykke vevet stykker,en svært konsekvent ex vivo-protokollen gjenstår å bli utviklet.

1.4 Valg av cellelinjer og opptaksforhold

Mye av det vi vet om biokjemi og cellebiologi av klokken mekanismen er basert på tre mobilnettet modeller: 3T3 mus fibroblaster ^16,17, U2OS menneskelige osteosarkom celler ^10,11,19,28 og mus fibroblaster hentet fra mus ^{9,13 , 34.} Den lentiviral vektor systemet tillater effektiv levering og stabil integrering i verten genomet av både delende og ikke-delende pattedyrceller, og derfor er ikke begrenset til visse celletyper som i transient transfeksjon. Gitt rollene circadian klokker i reguleringen av et bredt spekter av cellulære og fysiologiske responser, vil fremtidige studier sikkert utvide til et bredt utvalg av celletyper, enten kommersielt tilgjengelige cellelinjer eller primære celler avledet fra mus. Disse celle-autonome klokke studier vil bidra til å avdekke vev-ubiquitous samt vevsspesifikke, egenskaper av cirkadianske klokker.

Det er verdt å merke seg at generere reporter celler kan kreve empirisk testing av ulike journalister (f.eks ulike vektor og promoter typer), og noen ganger ytterligere optimalisering. Ikke alle celletyper har celle-autonome rytmer. Å forbedre celle helse og utholdenhet av mobilnettet rytmer, optimalisering av opptaksmedium er ofte nødvendig. For eksempel, som et alternativ til den 3T3 opptaksmedium er opptaksmediet brukes for U2OS celler som følger: 1x DMEM (Invitrogen), 2% B-27, 1 uM forskolin, 1 mM luciferin, 14,5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES (pH 7,2). 1 mM luciferin er vanligvis tilstrekkelig, men en endelig konsentrasjon (0,1-1 mM) kan bestemmes for hver celle / reporter attraksjon. Forskolin kan ikke være nødvendig og konsentrasjonen kan empirisk bestemt for hver celletype.

1,5 Transfeksjon effektivitet i lentiviral prep

Høy transfection effektiviteten av 293T celler er avgjørende for en god viral prep. Viktige hensyn er helse 293T celler og valg av en transfeksjon reagens. 293T celler kan være veldig pirkete og krever forsiktig håndtering. Dermed må celle vekst og morfologi overvåkes nøye. For konsistens, anbefales det at serum testes første og samme testede batch brukes deretter for å opprettholde cellene. Vi alltid teste ut nye 2x BBS og CaCl ₂ lager løsninger og optimalisere arbeidet konsentrasjon av CaCl ₂ rundt 0,25 M. Cells av høy passasje nummer og / eller vise langsom vekst bør ikke brukes. 293T celler lett transfectable med en rekke transfeksjon reagenser. I tillegg til Capo _4, vi også oppnådd gode transfeksjon effektivitet med Fugene 6 (Roche eller Promega) eller Lipofectamine-2000 (Invitrogen). Disse lipid-baserte transfeksjon (lipofection) reagenser er dyrere, men gir bedre transfeksjon konsistens enn Capo _4. For store lentiviral preps, anbefaler vi at du bruker CaPO4 for transfeksjon grunn av lavere pris.

1,6 generasjon av klonal cellelinjer

Un-konsentrerte rå viruspartikler er av relativt lav titer (10 ⁶ virale partikler / ml), og reporter ekspresjon i transduced celler er lav. Selv om dette er tilstrekkelig for de fleste applikasjoner som LumiCycle opptak, blir lysere reportere ofte nødvendig, for eksempel i høy gjennomstrømming analyser ved hjelp av en mindre følsom opptaksenhet. Reporter uttrykk kan økes ved å bruke høyere titer viral preps. For å gjøre dette, anbefaler vi å bruke større kultur fartøy slike as15 cm retter for transfeksjon, og samle media to ganger på dag 4 og dag 5. For 10x konsentrasjon (10 ⁷ viruspartikler / ml), utføre filtrering ved hjelp av sentrifugal filter enheter (Millipore). For 100x eller mer konsentrasjonen (≥ 10 ⁸ viruspartikler / ml), utfør ultrasentrifugering som tidligere beskrevet 5,18. Hvis en homogen cellepopulasjon ønsket kan klonale cellelinjer oppnås ved FACS-baserte enkelt celle sortering i 96-brønners plater. Imidlertid er det viktig at disse klonale celler undersøkes nøye; cellemorfologi bør være utvisket fra foreldrecellene og klokke egenskaper som periodelengde og amplitude bør være representative for den infiserte cellepopulasjon.

2. Anvendelse av Cell-autonome Reporter Clock Modeller

I motsetning til vev eller dyremodeller, celle-baserte modeller er mottagelig for genetiske og farmakologiske forstyrrelser, og når det er nødvendig, også bruke i HTS formater. Perturbasjon av genfunksjon kan oppnås ved å over-ekspresjon eller RNAi-mediert knockdown. Selektive små molekyler kan brukes til å forstyrre protein funksjon. Her har vi kort discuss noen bruksområder for celle-autonome klokke modeller i circadian studier.

2.1 Studie av kjernen klokke mekanismer

Cell-autonome klokke modeller har mye lettere mekanistiske studier. Hogenesch og kolleger brukte 3T3 modell for å vise at tilbakemeldingene undertrykkelse av krystall er nødvendig for klokke funksjon ^16, og U2OS modellen til å undersøke system-level egenskaper klokkefunksjon ^11. Vi bemanning Cry1-/ -: Cry2-/ - fibroblast modellen avledet fra mus for å vise at forsinket tilbakemelding undertrykking er nødvendig for klokke funksjon ^13, og den Bmal1-/ - fibroblast modell for å vise at Rev-erbα og β spiller overflødige roller i regulerer RRE-mediert rytmisk genuttrykk, og at Bmal1 rytme er ikke kritisk nødvendig for kjerne klokke funksjon ^9. Videre tillates kjemiske screening i reporter celler identifisering og / eller avklaring av funksjonene GSK-3 β (periode forkorte når perturbed) ^19, CK1σ og ε (periode forlengelse når perturbed) ^49, og CK1α ^12. Som omtalt nedenfor, disse modellene lette identifikasjon av ytterligere klokke komponenter. Strategisk, disse mobile modeller er mer medgjørlig for rask oppdagelse av grunnleggende mekanismer, som deretter gir nye startpunkter for in vivo validering og utforskning.

2.2 Identifisering av klokke faktorer

I tillegg til kjernen feedback loop, integrerer klokke mekanisme også diverse signalering og regulatoriske faktorer. For identifisering av ytterligere klokke komponenter og modifikatorer, celle-autonome klokke modeller er en fordel over genetisk screening hos mus på grunn av den iboende dødelighet, mitogen effekt, og utviklingsmessige genetisk erstatning knyttet mutant dyremodeller ^50. Cell-baserte skjermer, i kombinasjon med funksjonell genomforskning hensiktsaches, har blitt effektivt gjennomført med høy gjennomstrømming registreringssystemer til skjermen genom-wide siRNA og shRNA biblioteker for identifisering av nye klokke faktorer ^10,28. Tilsvarende kan man ansette kjemiske biologiske tilnærminger og skjermen for diverse små molekyler å studere deres virkninger på klokkefunksjon ^12,19,34,49. Selv om store klokke gener og deres funksjoner er identifisert, har disse skjermene identifisert flere komponenter eller modifikatorer som er involvert i regulering eller modulering av døgnet. Mange av disse modifikatorer representerer spesielle regler for å integrere signaltransduksjon av synkrone eller asynkrone signaler (klokke innganger).

2.3 Studie av klokke utganger

Selv talt alle celler in vivo har biologiske klokka, gjør celler dyrket in vitro ikke nødvendigvis viser overt døgnrytme. I denne sammenheng gir reporteren tilnærming et nyttig verktøy for å teste omklokke mekanisme eksisterer i en bestemt celletype. Tilstedeværelse av celle-autonome klokke mekanismer garanterer studier av klokke utganger i disse cellene, samt i vev in vivo, inkludert transkriptom ved mikromatriser eller RNA ^51,52 sekvensering, transkripsjonsregulerende nettverk proteomet og metabolome. Disse studiene undersøker genom-wide RNA og protein expression mønstre og dermed vil utfylle celle-baserte luminescence reporter analyser som ikke nødvendigvis gjenspeiler den endogene uttrykk.

3. Betydningen av Cell-autonome Clock Modeller

Koordinering av circadian funksjon innenfor SCN og på tvers av forskjellige celle-og vevstyper er en kritisk del av normal fysiologi ^30. Den sentrale SCN og perifere klokker er alle viktige deler av den totale circadian organisasjonen. SCN mottar lys innspill direkte fra netthinnen til entrain til lys / mørke syklus, og fungerer som en koordinator tilsynkronisere perifere klokker gjennom både neuronal og hormonelle tilkoblinger. I tillegg til intern synkronisering, arrangerer den molekylære urverk innenfor perifert vev og celler også en myriade av transcriptional utgang nettverk, som til slutt styrer overt døgnrytme i fysiologi og atferd.

Således, både systemisk og lokalt signaler regulerer circadian fysiologi, og det er et behov for å avdekke circadian gener direkte regulert av celle-autonome klokker vs de indirekte regulert av systemiske signaler som kommer fra SCN. Rollen av perifere klokker kan studeres i celle-autonome klokke modeller, der systemiske påvirkninger er fjernet. I tilfelle av leveren, vevsspesifikke regulatoriske nettverk generere rytmer i lokal fysiologi ^51,53. Ved å sammenligne in vitro og in vivo døgnrytme, vil vi være i stand til å skille mellom celle-autonome og systemisk cue-drevet klokke funksjoner. Faktisk, recent studier har begynt å avsløre en betydelig rolle for leveren klokken ved nedsatt genuttrykk ^6,51,52. Fremtidig forskning på feltet garanterer utvikling av ulike vev-og celle typespesifikke klokke modeller som representerer ulike fysiologiske utganger.

Tidligere studier av biokjemi og cellebiologi av klokken mekanismen har i stor grad vært avhengig av et begrenset antall celler og vev typer, og da særlig 3T3, U2OS, mus fibroblaster, og lever. En implisitt antagelse i de fleste circadian studier er at klokken fungerer på samme måte i alle celler og vevstyper, og gen-funksjon bestemt i en celle-eller vevstype er generelt ansett å gjelde universelt i alle celler ^7. Men ved å etablere og karakterisere flere celle-autonome klokke modeller er fremtidige studier forventes å avdekke vev spesifikke klokke egenskaper underliggende lokale circadian biologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30243FS	For regular cell growth
DMEM	Invitrogen	12100-046	For luminometry
FBS	HyClone	SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-Luciferin	Biosynth	L-8220
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
All other chemicals	Sigma
Equipment
Tissue culture incubator			5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood			BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope			Phase contrast optional
LumiCycle	Actimetrics