Övervakning Cell-autonoma dygnsrytm klocka rytmer av genuttryck Använda Luciferas bioluminiscens Reportrar

Summary

Dygnsklockan fungera inom enskilda celler, dvs de är cell-autonoma. Här beskriver vi metoder för att generera cell-autonoma klocka modeller med icke-invasiv, luciferas-baserad realtid bioluminiscens teknik. Reporter celler ger foglig, funktionella modellsystem för att studera dygnsrytm biologi.

Abstract

Hos däggdjur är många aspekter av beteende och fysiologi, såsom sömn-vakna cykler och levermetabolism regleras av endogena dygnsklockan (omdömet ^1,2). Den dygnsrytm tidhållning systemet är en hierarkisk flera oscillator nätverk med den centrala klockan belägen i suprachiasmatiska kärnan (SCN) synkronisera och samordna extra SCN och perifera klockor håll ^1,2. Individuella celler är de funktionella enheterna för produktion och underhåll av dygnsrytmer ^3,4, och dessa oscillatorer med olika vävnadstyper i organismen delar en anmärkningsvärt liknande biokemisk negativ återkopplingsmekanism. Men på grund av interaktioner på neuronala nätverket nivå i SCN och genom rytmiska, systemiska signaler på organismbiologi nivå, dygnsrytmen på organismbiologi nivå inte nödvändigtvis cell-autonoma ^5-7. Jämfört med traditionella studier av rörelseaktivitet in vivo och explantat SCN ex vivo, c.ell-baserade in vitro-analyser tillåter upptäckt av cell-autonoma dygnsrytm defekter ^5,8. Strategiskt cellbaserade modeller är mer experimentellt lätthanterliga för fenotypisk karaktärisering och snabb upptäckt av grundläggande klocka mekanismer ^5,8-13.

Eftersom dygnsrytmen är dynamiska, är längsgående mätningar med hög tidsupplösning för att bedöma klockfunktion. Under de senaste åren har i realtid bioluminiscens inspelning med eldflugeluciferas som reporter blivit en vanlig metod för att studera dygnsrytmen hos däggdjur ^14,15, eftersom den möjliggör undersökning av persistens och dynamiken av molekylära rytmer. För att övervaka cell-autonoma dygnsrytm av genuttryck kan luciferas reportrar införas i celler via transient transfektion ^13,16,17 eller stabil transduktion ^5,10,18,19. Här beskriver vi en stabil transduktion protokoll med lentivirus-medierad gen leverans. Than lentivirusvektor systemet är överlägset traditionella metoder såsom övergående transfektion och könsceller överföring på grund av dess effektivitet och mångsidighet: den medger effektiv leverans och stabil integration i värdgenomet både delande och icke-delande celler ^20. När en reporter cellinje etableras, kan dynamiken i klockfunktionen examineras genom bioluminiscens inspelning. Vi beskriver först generationen P (PER2)-d Luc reporter linjer och sedan presentera data från denna och andra dygnsrytm reportrar. I dessa analyser, är 3T3 musfibroblaster och U2OS humana osteosarkomceller som cellulära modeller. Vi diskuterar också olika sätt att använda dessa klocka modeller dygnsrytm studier. Metoder som beskrivs här kan appliceras på en stor variation av celltyper att studera cellulära och molekylära grunden för dygnsklockan och kan vara användbar för att hantera problem i andra biologiska system.

Protocol

1. Konstruktion av Lentiviral Luciferas Reportrar

En däggdjurspromotor cirkadiska reporterkonstruktion innehåller vanligtvis en expressionskassett i vilken en dygnsrytm promotor fuserad med luciferasgenen. Både ligerings-och rekombination-baserade strategier används ofta för DNA-kloning. Som ett exempel, beskriver vi här en rekombination-baserad metod gateway kloning för att generera P (PER2)-d Luc Lentiviral reporter, i vilken den destabiliserade luciferas (Luc d) är under kontroll av mus PER2 promotorn.

1. Kloning av PER2 promotorn. Använda PCR för att amplifiera fragmentet PER2 promotor-DNA av 526 bp, uppströms om transkriptionsstartstället från en mus PER2 BAC-klon ^9-13, med användning av en framåtriktad primer (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') och en omvänd primer (5' -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 '), och klon till pENTR5'-TOPO-vektorn (Invitrogen) för att alstrapENTR5'-P (PER2).
2. Kloning av d Luc. I d Luc innehåller eldflugeluciferasgenen och en C-terminal sekvens PEST för snabb proteinnedbrytning såsom tidigare beskrivits ^21. Använda PCR för att amplifiera d Luc DNA-fragmentet, och klon till pENTR / D-TOPO-vektorn (Invitrogen) för att alstra pENTR / Dd Luc.
3. Konstruktion av reporter vektor. Blanda de två pENTR plasmider, pENTR5'-P (PER2) och pENTR / Dd Luc, med Lentiviral destinationen vektorn pLV7-BSD (BSD, blasticidin resistensgen), och utför rekombinationsreaktionen med CLONASE att generera en pLV7-BSD-P (PER2)-d Luc reporter (figur 1). pLV7-BSD är en modifierad version (tillverkad i vårt labb) i pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) i vilken skogsmurmeldjur hepatitvirus efter-transkriptionella regulatoriska elementet (WPRE) sekvenser ²² insattes omedelbart nedströms om uttrycket CA ssette att förstärka genuttryck.

2. Produktion av Lentiviral Particles

1. Seed 293T-celler (dag 1)

1. Grow humana embryonala njurceller (HEK) 293T-celler till 90-100% konfluens i vanlig DMEM kompletterat med 10% FBS och 1x penicillin-streptomycin-glutamin (PSG) på 10 cm skålar kultur. (Snabbt växande celler med lågt passagenummer är kritiska för effektiv transfektion.)
2. Före sådd av cellerna för transfektion, kappa 6-brunns odlingsplattor genom att tillsätta 1 ml av 0,001% poly-L-lysin i PBS till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur under 20 minuter. Aspirera lösningen och skölj gång med 1 x PBS före användning.
3. Dissociera 293T-celler med trypsin och utsäde 0,75 x 10 ⁶ celler på varje brunn av förbelagda plattor med 2 ml vanlig DMEM. Snurra plattorna noggrant för att erhålla en jämn fördelning av celler i varje brunn. Odla cellerna i inkubatorn vid 37 ° C över natten.

TEP "> 2. Transient transfektion Via Capo ₄ / DNA nederbörd (dag 2)

1. Observera de ympade cellerna från dag 1. Cell ska nå sammanflödet av 80-90%.
2. Förbered plasmidtransfektion blanda i en 1,5 ml mikrocentrifugrör genom att tillsätta 2 pg av en lentiviral reporter plasmid-DNA (t.ex. pLV7-P (PER2)-d Luc, Liu lab) och de 3 vektorerna förpackning (1,3 pg gag / pol, 0,5 pg Rev och 0,7 g VSVG, Invitrogen). Som en kontroll för både transfektion och efterföljande infektion, inkluderar vi vanligtvis en ytterligare brunn i transfektion för en lentiviral GFP expressionsvektor, pLV156-CMV-EGFP (figur 1A), hyser förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) under kontroll av CMV-promotorn såsom beskrivits tidigare ^20.
3. Tillsätt 100 | il av 0,25 M CaClj ₂ (utspädd med DNas / RNas-fritt DDH ₂ O från 2,5 M stamlösning) till plasmiden blandningen i steg 2 och blanda väl. Tillsätt sedan 100 | il 2x BBS-lösning (50 mM BES 280 mM NaCl, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 6,95) och blanda försiktigt men grundligt. Inkubera DNA-blandningen vid rumstemperatur under 15 minuter.
4. Medan du väntar, aspirera medium från 293T-celler och ändra till 2 ml färskt medium. Returnera plattan till inkubatorn under minst 10 min för att jämvikta mediets pH före transfektion.
5. Lägg transfektion mix från steg 3 till 293T-celler droppe för droppe. Snurra plattan försiktigt och observera partikelbildning under ett mikroskop. Inkubera vid 5% CO _2, 37 ° C över natten. (Skön partikelbildning Capo ₄ / DNA-fällning är avgörande för effektiv transfektion.)

3. Harvest virala partiklar (dagar 3-4)

1. Ca 16 timmar efter transfektion (dag 3) vid vilken tidpunkt cellerna skall nå 100% konfluens, aspirera mediet från celler och ersätta med 2 ml färskt DMEM vanlig. Inkubera vid 37 ° C över natten.
2. På dag 4, bedöma transfektion effektivitet genom att observera EGFP uttryck i transfection kontrollceller (transfektionseffektiviteten av 90-100% med hög EGFP expression är en tillförlitlig prediktor för en god viral prep.)
3. Samla mediet innehållande utsöndrade, infektiösa viruspartiklar. Centrifugera vid> 2.000 x g under 5 min för att avlägsna kvarvarande 293T-celler och samla virusinnehållande supematanten. Alternativt, kan mediet rensas med en 0,45 um membranfilter. De virala partiklarna är färdig för användning vid infektion.

3. Infektion av 3T3-celler

1. Seed 3T3-celler (dag 3)

Split och frö lämpligt antal (~ 12.000) av 3T3-celler på en 12-brunnars platta för att erhålla 20-30% sammanflytning på nästa dag. Inkubera vid 37 ° C över natten.

2. Infektera 3T3-celler (dag 4)

1. Beakta sådda cellerna. Sammanflödet av 20-30% (mindre än 50%) är önskvärt för infektion.
2. Lägg polybren till en slutlig koncentration av 5 pg / ml till den uppsamlade mediet innehållande viralapartiklar. Blanda väl genom pipettering.
3. Aspirera medium från 3T3-celler, och tillsätt 1 ml av ovanstående virala blandningen per brunn. Inkubera vid 37 ° C över natten. (Polybren används för att förbättra effektiviteten infektion, men är inte absolut nödvändigt. Eftersom det kan vara giftiga för vissa celler, är föregående testning rekommenderas.)

3. Markera infekterade celler (dag 5 och framåt)

1. Tjugofyra timmar efter infektion, aspirera medium som innehåller virus och polybren från infekterade celler, tvätta en gång med 1 x PBS, och ändra till färskt medium. Inkubera vid 37 ° C över natten för återhämtning och tillväxt.
2. När sammanflytande (vanligtvis 1-2 dagar senare), dela cellerna och inkubera vid 37 ° C över natten.
3. Följande dag, aspirera mediet från celler (<50% sammanflytning önskas) och ersätt med färskt medium innehållande 10 ng / ml Blasticidin att selektera för stabilt transducerade celler. (Blasticidin kill-kurva måste bestämmas empiriskt för en speciell cellinje.)

4. Bioluminescens Registrering av Reporter celler

1. Seed reporter celler

Propagera Blasticidin-resistenta reporter celler och dela på 35-mm odlingsskålar. Inkubera vid 37 ° C tills sammanflytande. Vi förbereder brukar ≥ 3 rätter för varje reporter cellinje under varje villkor för dygnsrytm fenotypning.

2. Synkronisering och förändring inspelningsmedium

1. Sug medium från sammanflytande reporter celler, tvätta en gång med PBS, och ersätt med DMEM innehållande 10 pM forskolin (eller 200 nM dexametason). Inkubera vid 37 ° C under 1 timme för att synkronisera cellerna. (Alternativt kan cellerna synkroniseras med temperaturcykler ²³ eller serum chock ^24.)
2. Medan du väntar, förbereda rekordning medium för 3T3-celler enligt följande: 1x DMEM (HyClone) innehållande 10% FBS, 1x Pen / Strep / Gin, 1 pM forskolin, 1 mM luciferin, 25 mM HEPES, pH 7,4. Serum och forskolin koncentrationen kan bestämmas empiriskt. För mycket dunkla celler, kan fenolrött-fritt medium användas.
3. I slutet av forskolin behandling, aspirera medium och ersätta med nybakade inspelningsmedium.

3. Bioluminescens inspelning av reporter celler

1. Efter medelhög förändring, täcker odlingsskålar med 40 mm sterila täckglas och tätning på plats med vakuum fett för att förhindra avdunstning.
2. Ladda rätter på LumiCycle luminometern, som hålls inuti en inkubator inställd på 36 ° C utan H ₂ O eller CO _2.
3. Starta realtid bioluminiscens inspelning. Vi registrerar brukar rytmer för 1 vecka, följt av medelhög förändring och kontinuerlig inspelning för en andra vecka (se Savelyev et al. För detaljer) ^25. (För inspelning av 96-villa plattor, Synergy SL2 användes som inspelningsenhet, se Diskussion 1,1 för detaljer).

5. Data analys och presentation

Reporter celler underlättar högupplöst kvantitativ luminiscens inspelning, kritisk för att bestämma fenotypiska effekter på dygnsrytm klockfunktion. För att få dygnsrytm parametrar inklusive fas, period längd, rytm amplitud och dämpning takt använder vi programmet LumiCycle Analys (Actimetrics) för att analysera bioluminiscens uppgifter ^5,14. Kortfattat, rådata är baslinjen monterat först och baseline-korrigerad data monteras på en sinusvåg, från vilken parametrarna bestäms. För prover som visar ihållande rytmer, godhet-of-fit på> 90% uppnås vanligtvis. På grund av hög övergående bioluminiscens på medelhög förändring utesluter vi vanligtvis den första cykeln av data från analys.

För data presentationen rita vi brukar rådata (bioluminescens, pulser / sek) mot timig (dagar). Vid behov kan baslinje-korrigerad data plottas för att jämföra amplitud och fas.

6. Representativa resultat

1. Fas-specifika dygnsrytm reportrar

Den cirkadiska klockan är baserad på en biokemisk negativ återkopplingsmekanism ^1. Kärnan återkoppling består av transkriptionsaktivatorer BMAL1 och klocka och repressorer pers och crys, som verkar på dygnsrytm E / E'-box enhancerelement för att producera rytmiska genuttryck (med morgon-fas, t.ex. Rev-erb α). Kärnan slingan reglerar och integrerar minst två andra dygnsrytm cis-element, DBP/E4BP4 bindande elementet (D-box, för dag-fas, t.ex. Per3) och ROR / REV-ERB bindande element (RRE, för natten fas, t.ex. Bmal1) ^17. Kombinatorisk reglering av flera dygnsrytm element kan generera nya mellanliggande faser. Till exempel, Cry1 transkripningen förmedlas av samtliga tre dygnsrytm element (dvs. E / E'-box och D-box element i promotorn och RREs i den första intronen i Cry1 genen), vilket ger upphov till distinkta Cry1 kväll tid fas ^13.

Baserat på dessa mekanismer genreglering, genererade vi fyra olika reporterkonstruktioner: P (PER2)-d Luc och P (Cry1)-d Luc reportrar som innehåller både E / E'-box och D-box element i den regulatoriska regionen ^{17, 26,27,} P (Cry1) - Intron-d Luc representerar kombinatorisk reglering av alla tre delar (dvs. E / E'-box, D-box, och RRE) ^13,17, och P (Bmal1)-d Luc reglerade uteslutande av RRE ^9,17,19,21. Vi introducerade dessa reportrar i 3T3-celler för att producera de förväntade distinkta faser reporter expression (figur 2).

2. Gene ÖVERVÄLDIGANDE via RNAi och farmakologiskt aktive föreningar

När transfektionseffektivitet är hög, kan syntetisk siRNA kan transient transfekteras in i celler för att slå ned genuttryck. När transfektion är tekniskt svårt, kan en shRNA expressionsvektor vara stabilt transduceras in i celler via Lentiviral infektion, så att shRNA produceras av cellen bearbetas till siRNA för gen ÖVERVÄLDIGANDE (KD). Här presenterar vi KD effekter av Cry1 och cry2 gener med siRNA i U2OS celler (Figur 3A) och shRNA i 3T3-celler med hjälp av en pLL3.7 vektor Gateway uttryck ⁹ (Figur 3B). Förutom 3T3 celler har U2OS modellen blivit en annan framstående cellulär klocka modell till stor del eftersom det uppfyller de viktigaste kraven för high-throughput screening av kommersiellt tillgängliga mänskliga siRNA bibliotek (t.ex. människa, kan generera robusta dygnsrytm, validerade funktion alla kända klocka gener och mottagliga för högeffektiv transfektion ochkvantitativ luminiscens inspelning). I båda celltyperna resulterade RNAi-medierad KD klocka fenotyper överensstämmer med tidigare mus knockout (KO) och cellulära KD studier ^5,10,11,28. Till exempel Cry1 KD förkortar perioden längd och minskar rytm uthållighet, medan cry2 KD förlänger perioden. Dessutom, kan utvalda små molekyler kan användas för att farmakologiskt mål och stör proteinfunktion (figur 3C).

Figur 1. Lentivirus-medierad gen avgivningssystem. (A) Schematisk bild av två lentivirala P (PER2)-d Luc reporter vektorerna och en CMV-EGFP konstruktionen. Endast regionen för integrering i värdcellens genom visas. I båda reporterkonstruktioner är transkriptionen av d Luc under direkt kontroll av PER2 promotorn. I pLV7-BSD-P (PER2)-d Luc vektor (rekombination baserad kloning), underlättar en samuttryckt Blasticidin resistensgen (BSD) val av infekterade celler. I pLV156-P (PER2)-d Luc vektorn (ligering-baserad kloning), är EGFP översättning medieras av ett internt ribosominträdesställe (IRES) nedströms av d Luc, vilket möjliggör visuell observation och FACS-sortering av infekterade celler. Dessutom, SV40-promotor / terminator (P / T) en används som en isolator (se diskussion 1,3). I CMV-EGFP styrvektor är EGFP expression under kontroll av en stark CMV-promotor. (B) Fluorescerande bilder av transfekterade och infekterade GFP-uttryckande celler. Vanligtvis uppnår vi hög effektivitet både övergående transfektion av 293T-celler och Lentiviral infektion av cellinjer av vårt intresse, vilket framgår av GFP uttryck i dessa celler. Klicka här för att se större bild .

Figur 2. Fas-uttryck av bioluminiscens reportrar i 3T3-celler De lentivirala vektorerna reporter användes i detta experiment är pLV7-BSD-P (PER2)-d Luc, P (Cry1)-d Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, och P (Bmal1)-d Luc. Varje reporter uppvisar en distinkt fas av oscillation, såsom indikeras av pilarna. Medan PER2 och Cry1 initiativtagare kör topp bioluminiscens på morgonen dagars faser och Bmal1 promotorn nattetid fas, kombinatorisk reglering av P (Cry1) - Intron hysa E-box, ger D-box, och element ROT kväll fas av topp bioluminiscens . Klicka här för att se större bild .

Figur 3. Genetisk och farmakologiska störning dygnsrytm bioluminiscens rytmer i reporter celler. (A) Effekter av Cry1 och cry2 knockdown av siRNA på cellulära rytmer U2OS reporter celler. Den LumiCycle luminometer användes för bioluminescens registrering av celler i 35 mm skålar. Figur anpassas från Reference # 10, med tillåtelse från Elsevier (2009). (B) Effekter av cry2 ÖVERVÄLDIGANDE av shRNAs på cellulära rytmer 3T3 reporter celler. En pLL3.7 Gateway vektor innehållande en U6-shRNA kassett användes för cry2 gen knockdown. shRNA2 har en bättre knockdown verkningsgrad än shRNA1 såsom bestämts genom Western blot-analys (data ej visade). Ett Synergy luminometern användes för bioluminescens registrering av celler i en 96-brunnsplatta. Inställningarna för inspelning är följande:. Inkubator temperatur 33 ° C, integrationstid, 15 sek, intervall tid, 30 min (C) Effekter av små molekyler hämmare på cellular rytmer U2OS reporter celler. Chir99021 och roskovitin är hämmare riktade mot GSK-3 och CDK, respektive. Det VIEWLUX systemet (Chir99021 analys) och en Tecan luminometer (roskovitin analys) användes för bioluminescens inspelningar av celler i 384-brunnsplattor. Figur är anpassad från Reference # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA). Klicka här för att se större bild .

Discussion

1. Ändringar av nuvarande protokollet

1,1 inspelningsenheter och genomströmning överväganden

På grund av dess kommersiella tillgänglighet har LumiCycle (Actimetrics) blivit den mest använda automatiserade luminometer enhet för realtidsinspelning ^{4,5,9,19,29-31.} Den LumiCycle använder fotomultiplikatorrör (PMT) som Ijusdetektorer, som ger extremt hög känslighet och lågt brus ^14, och därför är särskilt lämplig för datainsamling av mycket mörk luciferas-baserad bioluminescens. Andra liknande PMT-baserade enheter (t.ex. Kronos, Atto Co och POLARstar Optima, BMG Labtech Inc.) har också använts i många studier ^32,33.

Den LumiCycle analys med användning 35-mm skålar kan anpassas till 96 -, 384 - eller ens 1152-brunnar format för high-throughput screening (HTS) experiment. HTS metodutveckling fokuserar främst på följande två aspekter: 1) Bättre reporter celler med ljusare luciferas och / eller högre reporter uttryck (se nedan), och 2) känsliga inspelningsenheter som rymmer flera brunnar. Vi och andra har använt flera Mikroplattläsare som Synergy SL2 (BioTek), Oändlig M200 (Tecan) ^19, TopCount (PerkinElmer) ²⁸ och EnVision (Perkin Elmer) ^34. I vårt labb, är både LumiCycle och anordningar Synergy placerades i en temperatur-kontrollerad och ljustät inkubator. Alternativt, om resurserna tillåter, kan de registrerande enheterna placeras i en temperatur-kontrollerat rum. För HTS måste viktiga inställningar som t.ex. integration / exponeringstid och intervallet mellan tidpunkter bestämmas empiriskt för en given reporter och färdskrivare.

Den LumiCycle analysen ger inte rumslig information i en enda cell upplösning. Yamaguchi et al. ³⁵ och Welsh et al. ^4,5 pionjärer realtid bioluminescens avbildning av integrating en specialdesignad mikroskop med en mycket känslig, låg bullernivå CCD-kamera ¹⁵ för att åstadkomma en enda cell upplösning. Under de senaste åren har mer känsliga bildsystem blivit kommersiellt tillgängliga, inklusive LV200 (Olympus) och CellGraph (AB3000-B, Atto) med en ultrakänslig kyld och back-belyst elektron multiplicera CCD och multicolor filter ^36,37. Avbildning har också använts i mer sofistikerade HTS experiment, t.ex. en CCD-VIEWLUX imager (Perkin-Elmer) i kombination med GNF automatiserade robotsystemet (GNF Systems). Detta system aktiveras storskaliga skärmar för nya gener och små molekyler som påverkar klockfunktion ^10,12,19.

1,2 Luciferas reportrar

Luciferaser började användas i realtid luminiscens inspelning av dygnsrytm genuttryck i början av 1990 i växter och cyanobakterier, och har vanligen används i däggdjurssystem sedan 2000 ^29,35,38-40 (enLSO se recensioner ^14,15). Luciferas reportrar är i allmänhet mindre toxiska och mer känslig än fluorescerande reportrar såsom GFP, på grund av mycket lägre bakgrund ^41. Den vanligast använda bioluminescent reporter är eldfluga (Photinus pyralis) luciferas (Luc +) konstruerat i vektorn pGL3-serien (Promega), i vilken den kodande regionen av den nativa Luc ändrades för optimerad transkription och translation. Kombinationen av eldflugeluciferas och mycket stabil och cell-permeabla substrat, D-luciferin, är idealisk för långvarig inspelning. d Luc är en modifierad version av Luc + med en PEST-sekvens fusionerad vid sin C-terminal för att möjliggöra snabb proteinnedbrytning. En ytterligare förbättrad version, Luc2, finns i pGL4 vektorn serien (Promega) med högre och mindre avvikande uttryck. Men vi observerar inte en signifikant skillnad i prestanda mellan Luc + och Luc2 i övergående 3T3 och U2OS celler (data ej visade). I en färsk rapport, var brasilianska klick skalbaggsluciferas (E Luc) visar att uppvisa en mycket ljusare signal än Luc +, lämplig för en enda cell imaging ^42.

Många nyare studier har utnyttjat mPER2 :: LUC fusion knock-in reporter mus ^{4,5,9,19,25,29-31,43.} Denna reporter system möjliggör dygnsrytm fenotypning av celler och explantat vävnad inklusive SCN. I våra tidigare studier, korsade vi denna linje reporter mus med många av de beteendemässigt kännetecknas knockouts klocka gen och undersökte dynamiken i bioluminiscens rytmer i SCN, lever och explantat lung odlade ex vivo, och i dissocierade SCN nervceller och fibroblaster odlade in vitro ^{4, 5,9,31.} Dessa studier tillät oss att få viktiga insikter i de molekylära detaljerna i klockan drift vid cellen och organismbiologi nivåer.

1,3 Gene delivery-metoder

e_content "> vektor-baserade klocka reportrar ger stor mångsidighet, eftersom de kan införas i olika celltyper via transient transfektion ^11,13,16,17 eller Lentiviral transduktion ^5,9,18. Även besvärliga och mindre reproducerbara, tillfälligt transfekterade celler kan även odlas i kontinuerlig närvaro av antibiotika för att generera stabila cellinjer. Lentiviral vektorer fortfarande är föredragna på grund av deras stabila integrering i cellens genom, liksom ökad effektivitet och mångsidighet. Förutom pLV7 vektorn som presenteras ovan i vilka infekterade celler kan vara väljs med antibiotika, har vi använt andra vektorer. Exempelvis innehåller pLV156-P (PER2)-d Luc vektorn P (PER2)-d Luc-IRES-EGFP expressionskassetten i vilken EGFP översättning medieras av en intern ribosom post site (IRES) nedströms d. Luc, vilket möjliggör visuell observation och fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) av celler med integreed vektorerna ⁵ (figur 1) (se nedan). Att avskärma reportern från effekter integrationsstället, en konstitutiv promotor och terminator (P / T) kan införas som en isolator eller skenmål omedelbart uppströms om P (PER2)-d Luc reporter expressionskassett (t.ex. botten konstruera i figur 1A ), såsom rapporterats av Brown et al. ¹⁸ och Liu et al. ⁵

Tidigare studier etablerade grunden för utforskning av vävnadsspecifika genetisk störning både in vivo och / eller ex vivo ^44-48. Exempelvis kan virala partiklar kan injiceras i SCN regionen följt av SCN skiva beredning. Som ett alternativ till detta in vivo följt av ex vivo-analys, kan SCN skivor dissekeras först och odlade ex vivo, följt av inkubering med hög titer virus. Emellertid, på grund av låg infektion effektivitet relativt tjocka vävnadsskivor,en mycket konsekvent ex vivo-protokoll återstår att utvecklas.

1,4 Val av cellinjer och villkor inspelning

Mycket av det vi vet om biokemi och cellbiologi av klockan mekanismen är baserad på tre cellulära modeller: 3T3 musfibroblaster ^16,17, U2OS mänskliga osteosarkomceller ^10,11,19,28 och fibroblaster mus som härrör från möss ^{9,13 , 34.} Den lentivirusvektor Systemet medger effektiv leverans och stabil integration i värdgenomet både delande och icke delande däggdjursceller, och därför är inte begränsat till vissa celltyper som i övergående transfektion. Med tanke på roller dygnsklockan i regleringen av ett stort antal cellulära och fysiologiska svar, kommer framtida studier sträcker säkert till en mängd olika celltyper, antingen kommersiellt tillgängliga cellinjer eller primära celler härledda från möss. Dessa cell-autonoma klockan studier hjälper avslöja vävnads-ubiquitous, liksom vävnadsspecifika, egenskaper dygnsklockan.

Det är värt att notera att generera reporter celler kan kräva empiriska tester av olika reportrar (t.ex. olika vektor-och promotor typ) och ibland ytterligare optimering. Inte alla celltyper har cell-autonoma rytmer. För att förbättra cellens hälsa och persistens av cellulära rytmer, optimering av inspelningsmedium är ofta nödvändigt. Till exempel, som ett alternativ till den 3T3 inspelningsmediet, är det lagringsmedium som används för U2OS celler enligt följande: 1x DMEM (Invitrogen), 2% B-27, 1 iM forskolin, 1 mM luciferin, 14,5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES (pH 7,2). 1 mM luciferin är vanligen tillräcklig, men en slutlig koncentration (0,1-1 mM) kan bestämmas för varje cell / reporter typ. Forskolin kanske inte är nödvändigt och dess koncentration kan bestämmas empiriskt för varje celltyp.

1,5 transfektionseffektivitet i Lentiviral prep

Hög stansfection effektivitet 293T celler är avgörande för en bra viral prep. Viktiga överväganden inkluderar hälsa 293T celler och val av transfektion reagens. 293T celler kan vara mycket petiga och kräver noggrann hantering. Således måste celltillväxt hastighet och morfologi övervakas noggrant. För konsekvensens rekommenderar vi att serum testas först och samma testade sats används därefter för att upprätthålla cellerna. Vi testar alltid nya 2x BBS och CaCl ₂ lösningar lager och optimera arbeta koncentration av CaCl ₂ ca 0,25 M. Celler med hög passage nummer och / eller visa låg tillväxt bör inte användas. 293T-celler är lätt transfekterbara med ett antal transfektionsreagenser. Förutom till Capo ₄ nådde vi också utmärkt transfektion effektivitet med Fugene 6 (Roche eller Promega) eller Lipofectamine-2000 (Invitrogen). Dessa lipidbaserade transfektion (lipofektion) reagens är dyrare, men ger bättre transfektion konsistens än CaPO _4. For stora lentivirala preps rekommenderar vi att du använder CaPO4 för transfektion grund av lägre kostnad.

1,6 Generering av klonala cellinjer

Un-koncentrerade råa virala partiklarna är av relativt låg titer (10 ⁶ viruspartiklar / ml), och reporter expression i transducerade celler är låg. Även om detta är tillräckligt för de flesta tillämpningar som LumiCycle inspelning är ljusare reportrar behövs ofta, t.ex. i hög genomströmning analyser med hjälp av en mindre känslig färdskrivare. Reporter uttryckning kan ökas genom användning av högre titer virala preps. För att göra detta, rekommenderar vi att du använder större odlingskärl sådana as15 cm rätter för transfektion, och samla media två gånger på dag 4 och dag 5. För 10x koncentration (10 ⁷ virala partiklar / ml), utföra filtrering med användning av centrifugal filteranordningar (Millipore). För 100x eller mer koncentration (≥ 10 ⁸ viruspartiklar / ml), utför ultracentrifugering som tidigare beskrivits 5,18. Om en homogen cellpopulation önskas, kan klonala cellinjer erhållas genom FACS-baserad enkel cellsortering i 96-brunnsplattor. Det är dock viktigt att dessa klonade celler noggrant undersökas, cellmorfologin vara omöjlig att skilja från föräldrarnas celler och klocka egenskaper såsom tid längd och amplitud bör vara representativa för den infekterade cellpopulationen.

2. Tillämpning av Cell-autonoma modeller Reporter Clock

Till skillnad från vävnad eller djurmodeller, cellbaserade modeller mottagliga för genetiska och farmakologiska störningar, och vid behov även använda i HTS-format. Störning av genfunktion kan uppnås genom över-uttryck eller RNAi-medierad knockdown. Selektiva små molekyler kan användas för att störa proteinfunktion. Här har vi d kortiscuss några användningar av cell-autonoma klocka modeller i dygnsrytm studier.

2,1 Studie av mekanismer klockfrekvens

Cell-autonoma klocka modeller har avsevärt underlättat mekanistiska studier. Hogenesch och kollegor använde 3T3 modellen att visa att feedback förtryck av crys krävs för klockfunktion ¹⁶ och U2OS modellen för att undersöka systemnivå egenskaper klockfunktion ^11. Vi använde Cry1-/ -: cry2-/ - fibroblast-modell härledd från möss för att visa att fördröjd återkoppling förtryck är nödvändig för klockfunktion ¹³ och Bmal1-/ - fibroblast-modell för att visa att Rev-erbα och β spelar redundanta roller i reglera RRE-medierad rytmisk genuttryck, och att Bmal1 rytm inte kritiskt krävs för grundläggande klockfunktion ^9. Dessutom lät kemisk screening i reporter celler identifiering och / eller förtydligande av de funktioner GSK-3 β (period förkortning när störd) ^19, CK1σ och ε (period förlängs då störd) ⁴⁹ och CK1α ^12. Som diskuteras nedan, dessa modeller underlättar identifiering av ytterligare klocka komponenter. Strategiskt dessa cellulära modeller är mer lätthanterliga för snabb upptäckt av grundläggande mekanismer, som sedan ger nya ingångar för in vivo-validering och prospektering.

2,2 Identifiering av klockan faktorer

Utöver kärnan återkopplingsslingan, integrerar klockmekanismen också olika signalering och regulatoriska faktorer. För identifiering av ytterligare klocka komponenter och modifierare, cell-autonoma klocka modeller är fördelaktiga jämfört genetisk screening i möss på grund av den inneboende dödlighet, pleiotropa effekter och utvecklande genetiska ersättning i samband med muterade djurmodeller ^50. Cell-baserade skärmar, i kombination med funktionell genomik lämpligavärk, har faktiskt utförs med hög kapacitet för inspelning system screen genomet hela siRNA och bibliotek shRNA för identifiering av nya klocka faktorer ^10,28. Likaså kan man använda kemiska biologiska metoder och skärm för olika små molekyler för att studera deras effekter på klockfunktion ^12,19,34,49. Även stora klocka gener och deras funktioner har identifierats, har dessa skärmar identifierat ytterligare komponenter eller modifierare som är involverade i regleringen eller modulering av klockan. Många av dessa modifierare representerar särskilda formerna för att integrera signaltransduktion av synkrona eller asynkrona signaler (klockingångar).

2,3 Studie av klockan utgångar

Även praktiskt taget alla celler in vivo har dygnsklockan, gör celler odlade in vitro inte nödvändigtvis visa uppenbara dygnsrytm. I detta sammanhang ger reportern tillvägagångssättet ett användbart verktyg för att testa huruvidaklocka mekanism existerar i en speciell celltyp. Närvaro av cell-autonoma klocka mekanismer garanterar studier av klockan utgångar i dessa celler, liksom i vävnader in vivo, inklusive transkriptom av mikromatrisen eller RNA-sekvensering ^51,52, transkriptionella regulatoriska nätverk, proteomet, och Metabolome. Dessa studier undersöker genomet hela RNA och protein mönster uttryck och därmed skulle komplettera cellbaserade analyser luminiscens reporter som inte nödvändigtvis återspeglar den endogena uttrycket.

3. Betydelse för cell-autonoma Clock modeller

Samordning av dygnsrytm funktion i SCN och över olika cell-och vävnadstyper är en viktig aspekt av normal fysiologi ^30. Den centrala SCN och perifera klockor är alla viktiga delar i den övergripande dygnsrytm organisationen. SCN tar emot ljus in direkt från näthinnan att dra in till ljus / mörker cykel, och fungerar som en samordnare försynkronisera perifera klockor genom både neuronala och hormonella anslutningar. Utöver interna synkronisering, iscensätter den molekylära urverk inom perifera vävnader och celler också en myriad av transkriptions utgång nätverk, vilket i slutändan styr uppenbara dygnsrytm i fysiologi och beteende.

Således, både systemiska och lokala signaler reglerar cirkadiska fysiologi, och det finns ett behov att avslöja cirkadiska gener direkt regleras av cell-autonoma klockor vs dem indirekt regleras av systemiska signalerna från SCN. Rollen av perifera klockor kan studeras i cell-autonoma klocka modeller, där systemiska influenser avlägsnas. I fallet med levern, vävnads-specifika regulatoriska nätverk genererar rytmer i lokala fysiologi ^51,53. Genom att jämföra in vitro och in vivo dygnsrytm, kommer vi att kunna skilja mellan cell-autonoma och systemisk kö-drivna klockfunktionerna. Faktum, recent studier har börjat att avslöja en viktig roll för levern klockan i lever genuttryck ^6,51,52. Framtida forskning inom området motiverar utvecklingen av olika vävnader och celler typspecifika klocka modeller som representerar olika fysiologiska utgångar.

Tidigare studier av biokemi och cellbiologi av klockan mekanismen har till stor del förlitat sig på ett begränsat antal cell-och vävnadstyper, inklusive särskilt 3T3, U2OS, fibroblaster mus, och lever. Ett implicit antagande i de flesta dygnsrytm studier är att klockan fungerar på samma sätt i alla mobiltelefoner och typer vävnad och genfunktion bestäms i en cell eller vävnadstyp anses allmänt gälla allmänt i alla celler ^7. Men genom att upprätta och karakterisera fler cell-autonoma klocka modeller är framtida studier förväntas avslöja vävnadsspecifika klocka egenskaper som ligger till grund lokala dygnsrytm biologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30243FS	For regular cell growth
DMEM	Invitrogen	12100-046	For luminometry
FBS	HyClone	SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-Luciferin	Biosynth	L-8220
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
All other chemicals	Sigma
Equipment
Tissue culture incubator			5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood			BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope			Phase contrast optional
LumiCycle	Actimetrics